宋麗娜 王曉敏,2,3,4,* 劉文娟 楊 宏 付金軍 胡新華 高艷明,2,3,4 李建設(shè),2,3,4

(1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2 寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；3 寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；4 寧夏設(shè)施園藝(寧夏大學(xué))技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750021；5 寧夏巨豐種苗有限責(zé)任公司，寧夏，銀川 750021)

番茄(Solanumlycopersicom)，原產(chǎn)于南美洲，屬于茄科草本植物[1]。番茄果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)元素，具有抗氧化能力，能夠預(yù)防多種疾病[2]。截止2020年，我國(guó)番茄的年產(chǎn)量已達(dá)6 515萬(wàn)噸，種植面積達(dá)百萬(wàn)公頃，目前我國(guó)已成為世界上最大的番茄生產(chǎn)國(guó)[3]。寧夏地處黃河中上游的氣候干爽，日照充足，為本地番茄栽培創(chuàng)造了有利的環(huán)境條件，尤其在全國(guó)大部分地區(qū)遇到持續(xù)高溫天氣時(shí)，寧夏地區(qū)因氣候冷涼、晝夜溫差大，種植的番茄果實(shí)品質(zhì)佳，使得該地區(qū)成為我國(guó)越夏番茄的新產(chǎn)區(qū)[3]。番茄作為寧夏重要農(nóng)產(chǎn)品之一，種質(zhì)資源數(shù)量龐大，因此，開(kāi)展番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性相關(guān)研究，對(duì)番茄品種改良和雜種優(yōu)勢(shì)利用，了解物種起源、預(yù)測(cè)物種適應(yīng)性、預(yù)測(cè)遺傳資源分布、開(kāi)發(fā)與利用種質(zhì)資源等具有重要意義[4-5]。

迄今為止，已有前人開(kāi)展了關(guān)于番茄種質(zhì)遺傳多樣性的研究，但是對(duì)于種質(zhì)資源遺傳多樣性的評(píng)價(jià)主要依賴(lài)于表型。例如何潤(rùn)銘等[6]對(duì)95份番茄種質(zhì)資源的23個(gè)表型進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前番茄育種在一定程度上趨于同質(zhì)化，應(yīng)該重視對(duì)不同遺傳背景材料的保護(hù)；李艷紅等[7]利用表型性狀對(duì)華南地區(qū)的櫻桃番茄的種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，數(shù)量性狀在不同類(lèi)型番茄的種質(zhì)個(gè)體間差異較大，供試材料的表型遺傳變異豐富。由于不同材料對(duì)蕃茄種質(zhì)的多樣性影響有差異，且表型性狀易受基因型和環(huán)境條件的影響，分子標(biāo)記的發(fā)展為作物遺傳多樣性分析提供了更有力、更精準(zhǔn)的工具[8]。目前，已有多種分子標(biāo)記檢測(cè)方法被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于番茄育種及遺傳多樣性分析，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)等。宋建等[9]利用400對(duì)SSR標(biāo)記分析了國(guó)內(nèi)外具有代表性的幾大類(lèi)番茄材料，結(jié)果表明，番茄材料間存在不同程度的遺傳分化，栽培番茄種內(nèi)親緣關(guān)系相對(duì)野生種種間親緣關(guān)系較近，遺傳背景十分狹窄，充分反映了我國(guó)栽培各類(lèi)番茄的實(shí)際情況。SNP由于具有遺傳穩(wěn)定性和通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[10]，已被廣泛用于國(guó)內(nèi)外番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[11]。Sim等[12]利用從整個(gè)基因組挖掘出的7 720個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)收集到的426份番茄遺傳資源進(jìn)行基因分型，將其劃分為7個(gè)不同的番茄類(lèi)型。馮晶晶等[13]利用59個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)技術(shù)對(duì)收集到的來(lái)源廣泛的433份醋栗番茄種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，醋栗番茄能夠?yàn)樵耘喾烟峁┻z傳變異資源庫(kù)。從2015年開(kāi)始至今，寧夏的蕃茄育種在種質(zhì)資源遺傳多樣性方面開(kāi)展了一些研究工作[14-16]，但是基于分子標(biāo)記尤其是SNP標(biāo)記對(duì)番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究還處于初步發(fā)展階段。

鑒于此，本研究以60對(duì)SNP引物對(duì)來(lái)自不同地區(qū)504份番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性、聚類(lèi)分析、主成分分析及群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期揭示不同材料在DNA水平上的遺傳變異，為提高寧夏地區(qū)種質(zhì)資源的利用效率及核心種質(zhì)構(gòu)建提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用504份番茄種質(zhì)資源由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜課題組(本課題組)和寧夏巨豐種苗有限公司共同提供，編號(hào)為S001～S504，詳細(xì)信息見(jiàn)電子附表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄葉片基因組DNA的提取與檢測(cè) 參照芮文婧[17]的方法，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium，CTAB)法提取番茄葉片基因組DNA。

1.2.2 引物篩選與PCR擴(kuò)增反應(yīng) 本研究利用寧夏大學(xué)瓜菜遺傳育種實(shí)驗(yàn)室篩選的均勻覆蓋12條染色體的60對(duì)引物(電子附表2)對(duì)504份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為5 μL：20～50 ng·μL-1DNA模板2.20 μL、KASP Master Mix 2.50 μL、KBD Assay mix 0.07 μL、ddH2O 0.23 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性20 s，55～61℃延伸60 s，每循環(huán)退火延伸溫度為0.6℃，10個(gè)循環(huán)；95℃變性20 s，57℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)。設(shè)置4個(gè)空白對(duì)照，模板用ddH2O代替。PCR反應(yīng)在Pro-flexTMPCR擴(kuò)增儀(ABI美國(guó))上進(jìn)行，在Omega F SNP熒光檢測(cè)儀(LGC，英國(guó))讀取數(shù)據(jù)，結(jié)果利用軟件Kluster Caller獲得待測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SNP分型結(jié)果，利用PowerMarker軟件計(jì)算各材料間的遺傳距離，在此基礎(chǔ)上采用加權(quán)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構(gòu)建聚類(lèi)圖，使用MEGA 5.0軟件繪制聚類(lèi)圖；并計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的等位變異數(shù)、等位基因頻率、基因多樣性、雜合率、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用Structure 2.3.4軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，估算最佳群體組群數(shù)K，并計(jì)算Q值。利用GenALex 6.5軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

利用60對(duì)SNP標(biāo)記對(duì)504份番茄材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析(表1)，結(jié)果表明，60對(duì)SNP引物共檢測(cè)到181個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)有3個(gè)等位基因，NDP7582、NDP7560、NDP7783檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，為4個(gè)；60個(gè)SNP標(biāo)記的主要等位基因頻率(major allele frequency, MAF)平均值為0.659，變幅為0.375～0.905，其中NDP7560最高，NDP7781最低；期望雜合率(Heterozygosity)平均值為0.069；基因多樣性在0.178～0.658之間，平均值為0.450，其中DNP7781的基因多樣性最高，NDP7560的基因多樣性最低，基因多樣性在0.600以上的有NDP7723(0.625)、NDP7529(0.623)、NDP7625(0.652)、DNP7596(0.643)、DNP7661(0.612)、DNP7781(0.658)，表明番茄種質(zhì)資源有一定的多樣性。

表1 60個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分析Table 1 Genetic diversity analysis of 60 SNP loci

表1(續(xù))

由表1可知，多態(tài)性信息值(PIC)變幅為0.171～0.583，平均值為0.381，PIC在0.5以上的有NDP7723(0.554)、NDP7589(0.501)、NDP7529(0.551)、NDP7710(0.508)、DNP7625(0.577)、NDP7596(0.569)、DNP7661(0.537)、NDP7368(0.512)、DNP7781(0.583)，共9個(gè)SNP標(biāo)記。Botstein等[18]指出當(dāng)PIC值>0.5時(shí)，表明其具有高度多態(tài)性；當(dāng)0.25

圖1 SNP標(biāo)記多態(tài)性信息值(PIC)柱形圖Fig.1 Histogram of SNP marker polymorphism information value (PIC)

2.2 番茄種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析與主成分分析

基于遺傳距離構(gòu)建504份番茄種質(zhì)資源的UPGMA聚類(lèi)圖，結(jié)果如圖2所示。504份番茄種質(zhì)資源的遺傳距離范圍在0.02～2.64之間，平均遺傳距離為0.62，在遺傳距離為0.36時(shí)被分為7類(lèi)。

圖2 基于SNP標(biāo)記的504份番茄種質(zhì)資源聚類(lèi)圖Fig.2 Cluster map of 504 tomato germplasm resources based on SNP marker

第Ⅰ類(lèi)包含S460和S458共2份材料，均為來(lái)自甘肅的紅果櫻桃番茄，植株長(zhǎng)勢(shì)中等，早熟；S458的生長(zhǎng)習(xí)性為有限生長(zhǎng)型，果形為橢圓，果實(shí)較硬；S460的生長(zhǎng)習(xí)性為無(wú)限生長(zhǎng)型，果形為圓形，果實(shí)較軟。

第Ⅱ類(lèi)包含120份材料，其中來(lái)自寧夏27份，甘肅73份，四川和云南各3份，遼寧10份，陜西4份；這一類(lèi)群的材料中有15份材料為櫻桃番茄，其余均為大果番茄；大多數(shù)材料為無(wú)限生長(zhǎng)型、生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的中晚熟番茄，果形主要為圓形，成熟果色有紅色、粉色和黃色三類(lèi)。

第Ⅲ類(lèi)包含8份材料，其中S055來(lái)自甘肅，其余均來(lái)自寧夏；S055、S056、S057材料為櫻桃番茄，S058、 S059、 S060、 S061和S062材料為口感型的大果番茄，這8份材料均為植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型早熟番茄，果形有圓形和扁圓形，果實(shí)較軟，成熟果色有粉色和紫色。

第Ⅳ類(lèi)別包含72份材料，均為櫻桃番茄，其中來(lái)自甘肅24份，寧夏43份，陜西5份；這一類(lèi)群材料主要為無(wú)限生長(zhǎng)型、生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的早熟和中早熟番茄，果形主要為長(zhǎng)圓形，果實(shí)較硬，成熟果色有紅、粉、黃色三類(lèi)。

第Ⅴ類(lèi)和第Ⅵ類(lèi)均包含2份材料，其中第Ⅴ類(lèi)番茄S064和S179來(lái)自甘肅，均為無(wú)限生長(zhǎng)型、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的早熟番茄品種，果形為圓形，果實(shí)較軟；S064成熟果色為粉色，S179成熟果色為紅色。第Ⅵ類(lèi)2份番茄材料來(lái)自寧夏，均為長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的無(wú)限生長(zhǎng)型早熟紅果番茄，果形為圓形，果實(shí)較硬。

第Ⅶ類(lèi)包含298份材料，其中來(lái)自寧夏118份、甘肅144份、四川8份、遼寧10份、陜西14份和山東5份；這類(lèi)材料大多數(shù)為無(wú)限生長(zhǎng)型、生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的早熟大果番茄，果形主要是圓形和扁圓形，成熟果色有紅色和粉色。

第Ⅱ類(lèi)的甘肅粉果材料S435與第Ⅶ類(lèi)的遼寧紅果材料S372間的遺傳距離最大，為2.64，說(shuō)明這兩個(gè)材料之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳背景復(fù)雜且遺傳多樣性較高；第Ⅶ類(lèi)S212與S214材料間遺傳距離最小，為0.02，二者均來(lái)源于甘肅地區(qū)且果實(shí)不容易轉(zhuǎn)色，說(shuō)明這兩個(gè)材料之間親緣關(guān)系較近。

由主成分分析二維圖可知(圖3)，第1主成分與第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為11.4%和10.01%。二維圖中的位置距離能夠直觀(guān)地代表番茄種質(zhì)資源的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，group1與group2主要分布在第1、第2、第4象限，且兩個(gè)群體之間有重疊現(xiàn)象，group3集中分布在第2、第3象限，且與其他群體之間基本沒(méi)有重疊，證明group3包含的材料與其他兩組的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于SNP標(biāo)記的504個(gè)番茄種質(zhì)資源主成分分析二維圖Fig.3 Two-dimensional map of principal component analysis of 504 tomato germplasm based on SNP markers

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于SNP分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，運(yùn)用Structure 2.3.4軟件對(duì)504份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，將分析得到的dimensional K繪制折線(xiàn)圖(圖4)，結(jié)果表明在K=3時(shí)，ΔK達(dá)到最大值。因此，將504份番茄種質(zhì)資源劃分為3個(gè)類(lèi)群(圖5)，第一個(gè)群體(紅色)包含79份材料，第二個(gè)群體(綠色)包含302份材料，第三個(gè)群體(藍(lán)色)包含123份材料。參考Evanno等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Q>0.6時(shí)，則表示該材料遺傳背景簡(jiǎn)單，反之則表示遺傳背景復(fù)雜。從各類(lèi)群的Q值分布表發(fā)現(xiàn)(表2)，95.44%的番茄Q值大于等于0.6，有70.24%的番茄Q值≥0.9，表明大多數(shù)參試材料的遺傳背景簡(jiǎn)單，大數(shù)為純合或者高代材料；4.56%的參試材料的Q值小于0.6，表明這23份番茄種質(zhì)資源可能為雜合材料。

圖4 K值與ΔK的變化折線(xiàn)圖Fig.4 The change of K value and ΔK line diagram

表2 各類(lèi)群Q值分布Table 2 Q value distribution of various groups

3 討論

優(yōu)異的種質(zhì)資源是新品種的選育基礎(chǔ)，種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)與鑒定是挖掘優(yōu)良育種材料、提高育種效率的有效工具[20]。分子標(biāo)記技術(shù)是鑒定和評(píng)價(jià)番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效手段。鄧學(xué)斌等[21]利用46對(duì)SNP標(biāo)記對(duì)收集的不同類(lèi)型的加工番茄種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)3 026份資源的期望雜合度均值為0.435，平均PIC為0.338。劉希艷等[22]利用44對(duì)SNP標(biāo)記對(duì)615份番茄材料進(jìn)行研究，表明番茄材料的基因多樣性均值為0.470，平均PIC為0.392 1；王濤等[20]利用篩選的103對(duì)SNP標(biāo)記對(duì)210份番茄資源進(jìn)行基因分型，結(jié)果表明平均期望雜合度為0.029，基因多樣性均值為0.346，平均PIC為0.308。在本研究中，利用篩選的60對(duì)SNP分子標(biāo)記運(yùn)用KASP技術(shù)對(duì)收集的504份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到181個(gè)等位基因，期望雜合度均值為0.069，基因多樣性均值為0.450，平均PIC為0.381。比較發(fā)現(xiàn)，本研究收集的番茄種質(zhì)資源的期望雜合度(0.069)與王濤等[20]的研究結(jié)果基本一致(0.029)，遠(yuǎn)低于鄧學(xué)斌等[21]的研究結(jié)果(0.435)，原因可能是本研究參試的番茄材料多數(shù)為高代或純合材料，雜合率較低，這與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本相同，鄧學(xué)斌等[21]利用的番茄材料全部為單株多代自交材料，而非高代或純合材料，因此期望雜合度較高?；蚨鄻有缘拇笮?0.450)與劉希艷等[22]的研究結(jié)果(0.470)相當(dāng)，高于王濤等[20]的研究結(jié)果(0.389)，可能的原因是本研究的試材數(shù)量較多，種類(lèi)多樣，而王濤等[20]的參試材料主要為鮮食番茄，類(lèi)型較少。本研究篩選的60對(duì)SNP標(biāo)記的PIC平均值較高(0.381)，表明本研究篩選的SNP分子標(biāo)記表現(xiàn)為中度偏高的多態(tài)性，這些SNP標(biāo)記可以用于番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和后期其他遺傳關(guān)系的研究。

根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果將504份番茄材料分為7類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)材料均為植株長(zhǎng)勢(shì)中等、早熟的紅果櫻桃番茄，可用于早熟紅果櫻桃番茄的培育；第Ⅱ類(lèi)材料大多數(shù)為植株長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)、無(wú)限生長(zhǎng)的中晚熟番茄，果色豐富，遺傳潛力較大，可用于培育各類(lèi)型中晚熟大果或櫻桃番茄品種，滿(mǎn)足周年生產(chǎn)的需求；第Ⅲ類(lèi)材料均為植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、無(wú)限生長(zhǎng)型的早熟番茄，包括5份口感型大果番茄材料和2份紫色櫻桃番茄材料，因此，這類(lèi)材料可用于培育口感型粉色大果或紫色櫻桃番茄等特色品種；第Ⅳ類(lèi)材料均為果實(shí)較硬、果色豐富、早熟的長(zhǎng)圓形櫻桃番茄，這類(lèi)材料可用于培育耐貯運(yùn)的長(zhǎng)圓形櫻桃番茄品種；第Ⅴ、第Ⅵ和第Ⅶ類(lèi)材料多數(shù)為生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、無(wú)限生長(zhǎng)型的圓形或扁圓形的大果早熟番茄，可用于培育早熟大果鮮食番茄品種。遺傳距離可判斷作物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，遺傳距離越大親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，反之亦然。本研究的504份參試材料有490份材料均集中在第Ⅱ、第Ⅳ、第Ⅶ類(lèi)；材料間的遺傳距離的變化范圍0.02～2.64，平均值為0.62，說(shuō)明本研究參試材料的具有一定遺傳差異和遺傳多樣性，但豐富性仍不高，可能的原因是供試材料均為地方選育的栽培種。Sacco等[23]和Sim等[24]的研究結(jié)果表明，地方栽培品種的遺傳變異水平較低，推測(cè)是由于育種者通常從最好的果實(shí)中收集種子，而不是收集更優(yōu)異的基因型[25]。因此，種質(zhì)資源的收集至關(guān)重要。本課題組已經(jīng)開(kāi)始了對(duì)國(guó)外番茄種質(zhì)的收集，包括野生種質(zhì)與栽培品種，以此豐富本課題組的番茄種質(zhì)資源。

主成分分析與群體結(jié)構(gòu)分析均劃分為三類(lèi)，與聚類(lèi)分析劃分類(lèi)群數(shù)不同，類(lèi)群Ⅳ與group1和群體Ⅰ、類(lèi)群Ⅶ與group2和群體Ⅱ、類(lèi)群Ⅱ與group3和群體Ⅲ包含的番茄材料基本一致。從三種不同的聚類(lèi)方法能夠發(fā)現(xiàn)參試的504份種質(zhì)資源的聚類(lèi)結(jié)果與地理來(lái)源沒(méi)有明顯的關(guān)系，原因在于：一方面可能是種質(zhì)資源的遺傳背景不夠明確，無(wú)法細(xì)分，番茄種質(zhì)通過(guò)自交，導(dǎo)致種內(nèi)出現(xiàn)基因交流，從群體結(jié)構(gòu)也可發(fā)現(xiàn)種群內(nèi)存在基因交流現(xiàn)象；另一方面可能是引物數(shù)量較少，檢測(cè)位點(diǎn)未能覆蓋所有變異，這與周艷朝等[26]和胡永超等[27]的推斷一致。

4 結(jié)論

本研究利用60對(duì)SNP引物，對(duì)收集的504份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，每個(gè)SNP標(biāo)記平均有3個(gè)等位基因，多態(tài)性信息值(PIC)平均值為0.381；同時(shí)發(fā)現(xiàn)有NDP7723(0.554)、NDP7589(0.501)、NDP7529(0.551)、NDP7710(0.508)、DNP7625(0.577)、NDP7596(0.569)、DNP7661(0.537)、NDP7368(0.512)、DNP7781(0.583)共9個(gè)具有高度多態(tài)性較高的SNP標(biāo)記。基于SNP標(biāo)記對(duì)參試材料進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析、主成分分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，了解到番茄種質(zhì)資源之間存在一定的親緣關(guān)系，反映了不同番茄材料之間存在基因交流。