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        滇南美登木總?cè)铺崛」に囇芯?/h1>
        2022-10-29 09:56:36方振峰楊園房輝楊光
        關(guān)鍵詞:滇南中總三萜

        方振峰,楊園,房輝,楊光

        (江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,湖北 武漢 430056)

        美登木屬植物全世界約有300種,主要產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū),以南美洲分布最多。中國(guó)約有20種和1個(gè)變種,主要分布在云南省、長(zhǎng)江以南各省區(qū),西藏自治區(qū)也有分布,多生長(zhǎng)于山谷山坡或水邊的樹林中[1]。自從美國(guó)科學(xué)家從齒葉美登木(Maytenus serrata)中分離得到高等植物中第一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類天然抗腫瘤活性成分[2],美登木屬植物受到了人們的廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)學(xué)者陸續(xù)對(duì)云南美登木[3-8]、密花美登木[9-12]、刺茶美登木[13]、廣西美登木[14]、海南美登木[15-16]、厚葉美登木[17]、滇南美登木[18-19]等多種美登木屬植物及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行研究。但美登木屬植物中生物堿類成分含量較低,三萜類成分是其主要化學(xué)成分。三萜類化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎、抗菌等活性[8]。

        滇南美登木(Maytenus austroyunnanensisS.J.Pei et Y.H.Li)為衛(wèi)矛科(Celastraceae)美登木屬(Maytenus Molina)植物,主要產(chǎn)于云南的景洪、勐養(yǎng)、勐罕、雙江、思茅、耿馬等地[20]。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),目前對(duì)該種植物的研究較少,三萜類成分為其主要化學(xué)成分,約有14種,其中部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[18-19]。為了更好地開發(fā)利用該種植物,筆者對(duì)滇南美登木中總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行了研究,以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,總?cè)祁惡繛橹笜?biāo),5%香草醛-冰醋酸、高氯酸為顯色劑,采用紫外分光光度法分別考察了提取方法、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)、超聲功率5種因素對(duì)滇南美登木總?cè)祁惓煞痔崛〉挠绊?,篩選出最優(yōu)提取工藝,以期對(duì)滇南美登木化學(xué)成分及藥理活性的深入研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器設(shè)備

        ME104E電子天平,精度:0.0001 g,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;島津AUX120D分析天平(精度:0.01 mg,島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司);UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器(蘇州)有限公司));超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(上海秋佐科學(xué)儀器有限公司);ST-510Y 1000 g高速搖擺粉碎機(jī)(浙江瑞安市塞特機(jī)電有限公司)。

        1.2 試劑

        甲醇、冰醋酸、高氯酸均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;齊墩果酸分析對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)308D027,CAS:508-01-01,HPLC≥98.0%)。

        1.3 藥材

        滇南美登木藥材產(chǎn)自云南省西雙版納,經(jīng)江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系張濤教授鑒定為衛(wèi)矛科美登木屬植物滇南美登木Maytenus austroyunnanensisS.J.Pei et Y.H.Li的莖和葉。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 含量測(cè)定

        2.1.1 溶液的制備1)對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取7.96 mg齊墩果酸對(duì)照品,置于10 mL容量瓶中,加適量的甲醇,超聲溶解,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,即得濃度為0.7960 mg/mL對(duì)照品溶液。

        2)供試品溶液的制備

        取干燥后的滇南美登木藥材,粉碎,過60目篩,精密稱取1.5 g粉末,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇30 mL,超聲提取1 h,過濾,回收溶劑,浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中,甲醇定容到刻度,過濾,續(xù)濾液即為供試品溶液。

        3)顯色溶液的制備

        精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液、供試品溶液和蒸餾水各0.1 mL,分別置于10 mL容量瓶中,分別加入0.3%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL,搖勻,再加入高氯酸溶液1 mL,搖勻,置于60℃水浴中加熱25 min,冷卻,再加入冰醋酸1 mL,搖勻,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得對(duì)照品顯色溶液、供試品顯色溶液和空白對(duì)照顯色溶液。

        2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定取適量“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品顯色溶液和供試品顯色溶液,照紫外-可見分光光度法,在200~800 nm掃描,結(jié)果二者在553 nm處均有最大吸收,故選553 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

        2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密量取上述齊墩果酸對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL,按“2.1.1”項(xiàng)“顯色溶液的制備”同法操作。以空白顯色溶液為參比,在553 nm處測(cè)定吸光度,以齊墩果酸濃度(C,mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A=0.0165C+0.1791(r=0.9999)。表明齊墩果酸在3.98~27.86 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

        2.1.4 檢測(cè)限和定量限將空白顯色溶液連續(xù)測(cè)定6次,進(jìn)行時(shí)間掃描,記錄吸光度,得到平均吸光度值,即噪音。取對(duì)照品溶液按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“顯色溶液的制備”同法操作,稀釋成不同濃度進(jìn)行吸光度測(cè)定,扣除空白,所得吸光度值為噪音值3倍時(shí)的濃度為檢測(cè)限,得到檢測(cè)限為3.98 mg/L。所得吸光度值為噪音值10倍時(shí)的濃度為定量限,得到檢測(cè)限為12.56 mg/L。

        2.1.5 精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液0.5 mL,置于100 mL容量瓶中,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定6次,記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為0.67%(n=6),表明儀器的日內(nèi)精密度良好。

        日間精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液0.5 mL,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定,連續(xù)3 d,每天2次,記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為1.88%(n=6),表明儀器的日間精密度良好。

        2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)稱取同一批滇南美登木藥材粉末6份,每份約1.5 g,精密稱定,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定,記錄吸光度。結(jié)果總?cè)莆舛鹊腞SD為1.04%,表明方法重現(xiàn)性良好。

        2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取滇南美登木藥材粉末1.5 g,精密稱定,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作,于0、0.5、1、2、6、12、24 h在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定,記錄吸光度。測(cè)得吸光度RSD為1.49%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

        2.1.8 加樣回收試驗(yàn)取樣品藥材粉末約0.5 g,共9份,精密稱定,分別按樣品含量的80%、100%和120%加入標(biāo)準(zhǔn)品,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定,記錄吸光度,計(jì)算平均加樣回收率及RSD,結(jié)果見表1。

        表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of sample adding recovery experiment

        2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

        2.2.1 提取方法考察取滇南美登木藥材粉末2份,每份1.5 g,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,加入甲醇45 mL,分別采用超聲和加熱回流兩種方法提取40 min,過濾,回收溶劑,浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中,甲醇定容,過濾,取續(xù)濾液0.1 mL,按“2.1.1”項(xiàng)下“顯色溶液的制備”同法操作。在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品中總?cè)坪?。每種方法平行測(cè)定3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲提取時(shí)總?cè)坪繛椋?2.37±0.27)mg/g,而加熱回流法提取時(shí)總?cè)坪繛椋?6.84±1.43)mg/g。利用SPSS22.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素分析,表明超聲提取所得總?cè)坪亢图訜峄亓魈崛∷每側(cè)坪吭诮y(tǒng)計(jì)學(xué)上存在非常顯著性差異(P=0.003<0.01),可能由于超聲波可產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化、機(jī)械粉碎以及熱作用,使三萜物質(zhì)更好溶于溶劑中,并且超聲提取法經(jīng)濟(jì)成本更低、操作更加方便,因此,本實(shí)驗(yàn)提取方法采取超聲提取。

        2.2.2 料液比的考察 取滇南美登木藥材粉末5份,每份約1.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別加入甲醇溶液,甲醇體積按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50計(jì)算,分別按“2.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品中總?cè)坪?。平行測(cè)定3次,結(jié)果見表2。同時(shí),在測(cè)得三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件(P>0.05)下,進(jìn)行了料液比對(duì)滇南美登木總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

        從表2中可以看出,滇南美登木總?cè)坪肯入S著料液比的增大而增大,當(dāng)料液比為1∶30時(shí),總?cè)瞥煞趾孔罡邽椋?2.54±0.54)mg/g;1∶20時(shí),次之,為(21.96±0.57)mg/g,可能是因?yàn)殡S著料液比增大,溶劑與藥材接觸能更充分,使更多的有效成分溶解出來。但當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí),其含量驟然下降,隨后變化不大。另外,從表3中可知,料液比1∶20、1∶30時(shí)所得含量與1∶10、1∶40、1∶50時(shí)所得含量之間分別存在非常顯著性或極其顯著性差異,但1∶10、1∶40、1∶50時(shí)所得含量之間以及1∶20、1∶30時(shí)所得含量之間進(jìn)行兩兩比較時(shí)均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。因此,綜合含量以及成本考慮,選取料液比1∶20為滇南美登木總?cè)铺崛r(shí)最佳料液比。

        表2 不同液料比對(duì)滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.2 Effects of different liquid material ratios on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis

        表3 不同料液比組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.3 Multiple comparison results of total triterpene content between different material liquid ratio groups

        2.2.3 提取時(shí)間的考察稱取滇南美登木藥材粉末5份,每份約1.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇溶液30 mL,分別超聲提取30、60、90、120 min,按“2.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品中總?cè)坪俊F叫袦y(cè)定3次,結(jié)果見表4。同時(shí),在測(cè)得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件(P>0.05)下,進(jìn)行了提取時(shí)間對(duì)總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗(yàn),結(jié)果見表5。

        從表4中可以看出,滇南美登木總?cè)坪吭谔崛r(shí)間為60 min時(shí)最高,為(22.72±0.68)mg/g,隨后隨著時(shí)間的增加,含量有所下降,可能是因?yàn)殡S著時(shí)間增加,發(fā)生了副反應(yīng)導(dǎo)致總?cè)频寐氏陆?。另外,從?中可知,提取時(shí)間為60 min時(shí)所得三萜含量與其他提取時(shí)間所得三萜含量之間進(jìn)行兩兩比較時(shí),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著、非常顯著或極其顯著性的差異。因此,選取提取時(shí)間60 min為滇南美登木總?cè)铺崛r(shí)最佳提取時(shí)間。

        表4 不同提取時(shí)間對(duì)滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.4 Effects of different extraction time on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis

        表5 不同提取時(shí)間組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.5 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction time groups

        2.2.4 提取次數(shù)的考察稱取滇南美登木藥材粉末3份,每份約1.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇溶液30 mL,超聲提取60 min,分別超聲提取1、2、3次,按“2.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品中總?cè)坪?。平行測(cè)定3次,結(jié)果見表6。同時(shí),在測(cè)得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件(P>0.05)下,進(jìn)行了提取次數(shù)對(duì)總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗(yàn),結(jié)果見表7。

        從表6中可以看出,滇南美登木總?cè)坪吭谔崛〈螖?shù)為1時(shí)最高,為(22.90±0.58)mg/g,隨后總?cè)频寐氏陆?。從?中可知,提取1次、2次和3次時(shí)所得三萜含量之間進(jìn)行ANOVA單因素LSD多重比較時(shí),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)出無明顯差異(P>0.05)。因此,從節(jié)約時(shí)間以及溶劑成本方面考慮,選取提取次數(shù)為1次作為滇南美登木總?cè)铺崛r(shí)最佳提取次數(shù)。

        表6 不同提取次數(shù)對(duì)滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.6 Effects of different extraction times on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis

        表7 不同提取次數(shù)總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.7 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction times groups

        2.2.5 超聲功率的考察取滇南美登木藥材粉末5份,每份1.5 g,精密稱定,并置于具塞錐形瓶中,分別設(shè)定超聲功率為300、350、400、450、500 W,按“2.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品中總?cè)坪?。平行測(cè)定3次,結(jié)果見表8。同時(shí),在測(cè)得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件(P>0.05)下,進(jìn)行了超聲功率對(duì)總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗(yàn),結(jié)果見表9。

        從表8中可以看出,在超聲功率為450 W時(shí)提取滇南美登木總?cè)坪孔罡撸瑸椋?3.27±0.66)mg/g。同時(shí),從表9中可知,在超聲功率為450 W時(shí)所得三萜含量與其他4種功率提取所得總?cè)频暮吭诮y(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異(P<0.05)或非常顯著性差異(P<0.01),而超聲功率為300、350、400以及500 W時(shí)提取滇南美登木總?cè)坪恐g在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異(P>0.05)。因此,選取超聲功率為450 W作為提取滇南美登木總?cè)茣r(shí)最佳超聲功率。

        表8 不同超聲功率對(duì)滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.8 Effects of different ultrasonic power on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis

        表9 不同超聲功率總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.9 Multiple comparison results of total triterpene content between different ultrasonic power groups

        2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

        取滇南美登木藥材粉末3份,每份1.5 g,精密稱取,在最優(yōu)提取工藝條件下,按“2.1.1溶液的制備”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作,在最大吸收波長(zhǎng)553 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算滇南美登木中總?cè)坪?。結(jié)果滇南美登木中總?cè)破骄繛?3.99 mg/g(n=3,RSD=0.69%),表明該提取工藝合理。

        3 結(jié)論

        美登木屬植物具有良好的抗腫瘤活性,其中滇南美登木為我國(guó)特有物種,其主要成分三萜類具有良好的抗腫瘤活性,但文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),目前人們對(duì)其研究較少。本實(shí)驗(yàn)建立了滇南美登木中總?cè)祁惡康臏y(cè)定方法,并通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了提取方法、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)、超聲功率5種因素對(duì)總?cè)坪康挠绊?,利用SPSS22.0軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素統(tǒng)計(jì)分析和兩兩間多重比較LSD檢驗(yàn),篩選出最優(yōu)滇南美登木總?cè)频奶崛」に嚄l件:超聲提取,料液比(g/mL)為1∶20,超聲功率為450 W,提取1次,時(shí)間為60 min,所得到滇南美登木三萜含量最高,為23.99 mg/g。該方法提取率高、操作簡(jiǎn)單、方法可靠、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,為滇南美登木化學(xué)成分及藥理活性的深入研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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