冉帆凡，李露

（1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2.青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

酶是一種多功能催化劑，在最佳條件下具有高特異性和催化活性[1-2]，在大規(guī)模實際生產(chǎn)中擁有巨大的潛力。然而酶的低穩(wěn)定性、難以回收和重復利用等缺點阻礙了其在工業(yè)催化生產(chǎn)中的應用。為了克服這些缺點，通常對酶作固定化處理[3-5]。

固定化酶通常指將酶附著在適當?shù)妮d體表面或內(nèi)部并且保持活性，再將其加入反應體系的一項技術(shù)，是酶工程中酶催化應用的主流，已廣泛應用于各個領域[6-8]。固定化酶不僅擁有酶的催化特性，還能降低酶對環(huán)境變化的敏感性（溫度、pH值），提升酶的回收性和重復使用性，從而提高生物催化效率，減少催化過程的成本，為實際生產(chǎn)應用提供更多的選擇[9-12]。

固定化方法和載體是保持固定化酶優(yōu)良性能的關(guān)鍵。固定化載體的選擇要依據(jù)酶和載體的性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、應用目標等[13]。迄今為止，傳統(tǒng)的載體材料包括無機材料、有機材料、復合材料三大類。無機介孔材料因其穩(wěn)定性強、成本低、純度高、無菌性、化學惰性等優(yōu)點在眾多固定化載體中脫穎而出[14]。根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，UPAC）命名法，介孔材料被定義為孔徑在2 nm～50 nm的納米結(jié)構(gòu)[15-16]。其中，介孔硅基分子篩SBA-15具有比表面積大、孔隙結(jié)構(gòu)規(guī)則明確、孔徑分布窄且易調(diào)整、結(jié)合金屬原子能力強、合成條件溫和等優(yōu)點，被認為是固定化酶的理想載體[17-19]。近年來，越來越多的學者制備了不同形狀、孔徑、比表面積的SBA-15作為固定化酶的載體，這些載體均展示出優(yōu)良的催化性能。本文綜述了介孔硅基分子篩SBA-15固定化酶的研究進展和實際應用，以期對其未來的深入開發(fā)研究提供理論支持。

1 SBA-15固定化酶的方法

SBA-15固定化酶的方法可以分為物理法和化學法兩大類，其中物理法包括吸附法和包埋法，化學法包括共價結(jié)合和交聯(lián)法，表1列舉了4種固定化方法的優(yōu)缺點。

表1 SBA-15固定化酶方法比較Table 1 Comparison of SBA-15 immobilized enzyme methods

1.1 物理吸附

物理吸附法是SBA-15固定化酶最簡單和使用最多的固定方法，它通過SBA-15表面和酶分子表面的次級鍵的相互作用（范德華力、疏水作用、離子鍵等），將酶黏附在載體基質(zhì)表面[20]。在溫和的吸附條件下，酶通常能最大程度的地保留完整的結(jié)構(gòu)和活性。

通過物理吸附法，SBA-15固定化酶可以保持較高的活性和熱穩(wěn)定性。夏峰[21]通過物理吸附法將漆酶成功固定在SBA-15的孔道內(nèi)，在pH3、給酶量48 mg/g時固定化漆酶表現(xiàn)出最佳活性。經(jīng)8批次反應后剩余活性仍能達到85%以上，具有較好的操作穩(wěn)定性。孟繁蓉等[22]將α-淀粉酶固定在SBA-15介孔材料上，分別測試固載前后的酶學性質(zhì)。結(jié)果顯示，與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性及重復使用性都得到明顯提升。

物理吸附過程易受載體、酶分子及外界環(huán)境因素的影響，溶液pH值、溫度以及作為支撐的固體材料的特性都有可能影響吸附效率。

1.1.1 孔徑對SBA-15固定化酶效果的影響

有研究表明，SBA-15的孔徑大小可直接影響固定化酶的吸附量。莊凱等[23]采用物理吸附法將葡萄糖氧化酶固定在SBA-15上，考察了SBA-15孔徑對酶吸附量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，SBA-15的孔徑和水熱溫度呈線性關(guān)系。當水熱溫度達到145℃時，葡萄糖氧化酶的吸附量達到最大值128 mg/g，此時孔徑為8.77 nm。這是因為葡萄糖氧化酶分子形態(tài)大小約為8 nm，當SBA-15孔徑在8 nm附近時有利于酶進入載體中。芮銀[24]研究了不同孔徑的SBA-15對固載乙酰膽堿酶的影響。研究顯示，介孔材料SBA-15孔徑在12.5 nm時，載酶量最高可達250 mg/g，遠高于孔徑在6.1 nm時的載酶量（85 mg/g）。Matsuura等[19]制得孔徑分別為 5.4 nm和10.6 nm的介孔材料SBA-15（孔徑為5.4 nm）、SBA-15（孔徑為10.6 nm），評估了孔徑對SBA-15吸附大腸桿菌谷氨酰胺酶YbaS的影響。結(jié)果顯示，SBA-15（孔徑為10.6 nm）具有更高的熱穩(wěn)定性，且吸附量是SBA-15（孔徑為5.4 nm）的3倍。這表明固定化效率和熱穩(wěn)定性很大程度上取決于SBA-15的孔徑，SBA-15（孔徑為5.4 nm）上的酶分子暴露在孔徑入口周圍，易受外界環(huán)境影響導致酶變性。相比之下SBA-15（孔徑為10.6 nm）上的酶分子附著在孔道內(nèi)，能夠有效保護蛋白質(zhì)從而增加固定效率和熱穩(wěn)定性。

上述研究表明，SBA-15孔徑能夠直接影響固定化酶的效果。當孔徑小于酶分子大小時，酶分子難以進入載體內(nèi)只能附著于表面而導致吸附量較低；反之孔徑過大時，酶分子在吸附過程中易脫落，也無法得到較高的吸附量。因此將SBA-15的孔徑控制在與酶分子形態(tài)大小接近時最為理想。

1.1.2 載體形態(tài)對SBA-15固定化酶效果的影響

研究顯示，固定化載體的形態(tài)同樣能夠影響吸附率。Kingchok等[25]合成了球狀和3種棒狀形態(tài)的介孔硅SBA-15，研究了SBA-15的形態(tài)對細胞色素C的吸附作用和相對活性的影響。結(jié)果表明，與棒狀SBA-15固定化酶相比，球狀SBA-15更有助于底物進入活性位點，從而產(chǎn)生更高的活性和催化效率。

1.1.3 pH 值和等電點（isoelectric point，PI）對 SBA-15固定化酶效果的影響

蛋白質(zhì)的吸收主要受靜電吸附作用的控制，溶液pH值和酶分子等電點pI會影響酶與載體間的靜電作用，進而影響吸附效果。莊凱等[23]研究了溶液pH值對SBA-15固定化酶的影響。結(jié)果表明，在pH4.0時SBA-15載酶量達到頂峰92 mg/g。這是因為酶與載體的等電點相近時，靜電吸附作用較強。Chong等[26]使用孔徑為10 nm的SBA-15固定阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，F(xiàn)AE），在5～9的pH值范圍內(nèi)檢測6種重組菌FAE的固定化效率。結(jié)果顯示，有80%～90%的蛋白質(zhì)在5～7的pH值范圍內(nèi)被有效固定。在pH 9時，所有阿魏酸酯酶的固定化效率都下降到20%。

綜上，SBA-15物理吸附法固定化酶避免了化學修飾對酶分子構(gòu)象的影響，最大程度保留了酶活，從而提高催化性能。SBA-15的孔徑、溶液pH值、酶分子等電點pI等會影響固定化效果。然而，僅靠較弱的范德華力等物理力量不足以將酶牢牢結(jié)合在載體上，一些環(huán)境因子如高溫、pH值可能會削弱鍵的作用力，進而導致酶保留時間縮短、重復使用次數(shù)減少[27]。

1.2 包埋法

包埋法是將酶固定在聚合物材料的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空隙載體中。包埋法將酶包埋在載體內(nèi)，同時允許底物等小分子自由出入，底物仍能滲入空隙與酶接觸并與之反應。Takimoto等[28]利用不同孔徑的SBA-15介孔材料通過包埋法固定纖維素酶，結(jié)果顯示酶分子成功固定在SBA-15載體上，固定化效率隨孔徑增大而增加。

1.3 共價結(jié)合

為了減少酶脫落的現(xiàn)象，需要增強酶和載體間的連接力，常用方法是采用共價結(jié)合對酶進行固定化[29]。酶與載體的共價偶聯(lián)通常需要幾個步驟來實現(xiàn)，首先是載體的功能化，然后酶偶聯(lián)到活化的載體上，最后去除多余的和未結(jié)合的分子。

1.3.1 表面化學修飾

對SBA-15功能化處理不僅使催化劑再生，而且展示出更優(yōu)異的催化性能。在眾多功能化液體中，董姝婷[30]選擇3-氨丙基-3-乙氧基硅烷[（3-aminopropyl）triethoxysilane，APTES]對 SBA-15進行氨基修飾制得NH2-SBA-15，并對胰蛋白酶進行固定化。結(jié)果顯示氨基化后的NH2-SBA-15不僅載酶量有所提高，且在不同溫度、pH值環(huán)境下的穩(wěn)定性也有所提高。Zhong等[31]采用16種有機硅烷化合物對SBA-15硅烷化改性，制得功能化的SBA-15負載根瘤菌脂肪酶（rhizobium lipase，RL）并研究其酶學性質(zhì)。結(jié)果顯示，與游離酶和未修飾的SBA-15相比，功能化的SBA-15固定化酶降低了對pH值的敏感性，且有機基團為RML耐高溫和保護酶構(gòu)象不受破壞提供了微環(huán)境，從而提高了固定化酶熱穩(wěn)定性。

1.3.2 離子液體修飾

關(guān)于二氧化硅負載離子液體應用于催化反應的研究逐漸深入，離子液體可通過陽離子共價結(jié)合到二氧化硅表面[32]，因其優(yōu)異的導電性、穩(wěn)定性、非揮發(fā)性等，成為最具吸引力的修飾劑之一。Xiang等[33]成功利用羧基功能化離子液體（carboxyl-functionalized ionic liquid，CIL）結(jié)合SBA-15作為橋接劑與殼聚糖（chitosan，CS）復合形成了新型納米復合材料SBA-CILCS，并將其應用于固定豬胰脂肪酶的研究。研究結(jié)果顯示，固定化酶的吸附率可達到132.1 mg/g，且具有良好的活性、操作穩(wěn)定性和重復利用性。Bian等[34]用離子液體（onic liquids，RTIL）修飾SBA-15用于木瓜蛋白酶的固定化，發(fā)現(xiàn)修飾后的RTIL-SBA-15負荷量顯著高于未修飾的SBA-15，說明離子液體能夠促進木瓜蛋白酶的共價結(jié)合。同時，在酪蛋白水解中，固定在RTIL-SBA-15上的木瓜蛋白酶也表現(xiàn)出更優(yōu)異的活性，這意味著離子液體有利于提高固定化木瓜蛋白酶的活性。Zhong等[35]采用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽修飾SBA-15后負載南極假絲酵母脂肪酶，與SBA-15直接固定化酶相比，離子液體修飾后的固定化酶活性顯著提升且有較高的甘油解能力。

介孔硅基材料SBA-15與酶分子通過化學反應形成共價鍵固定化酶，這種固定化方法是不可逆的，且固定化效果牢固，不易洗脫，提高了固定化酶的穩(wěn)定性和負載量。

1.4 交聯(lián)法

交聯(lián)法是在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價鍵從而達到固定化酶的目的。Dai等[36]采用重復凍融循環(huán)法合成了菠蘿皮羧甲基纖維素/聚乙烯醇/SBA-15水凝膠復合材料，通過吸附-交聯(lián)的方法固定木瓜蛋白酶。與游離木瓜蛋白酶相比，水凝膠復合材料固定化酶顯示出更高的pH值敏感性、活性、熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。

2 應用

介孔硅基分子篩SBA-15孔徑可調(diào)、壁厚、比表面積大且穩(wěn)定性高，在各領域有巨大的應用潛力。近年來，SBA-15固定化酶生物催化因其具有綠色環(huán)保、節(jié)約成本和資源符合可持續(xù)性戰(zhàn)略發(fā)展等優(yōu)勢被廣泛應用于生物質(zhì)能源、生物傳感器、高分子化合物降解等各大領域。

2.1 生物基化學物質(zhì)的制備

生物催化是合成生物基化學物質(zhì)的首選途徑。與化學方法相比，生物催化帶來了更明顯的優(yōu)勢，例如反應條件溫和（通常在30℃～60℃下進行）且不產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此制備綠色的活性生物催化劑在工業(yè)生產(chǎn)中極為重要[37]。

2.1.1 生物柴油的生產(chǎn)

作為可再生能源，生物柴油被認為是同時解決能源安全與環(huán)境保護的可行途徑之一[38]。使用生物酶催化技術(shù)制備生物柴油具有反應條件溫和、副產(chǎn)物（甘油）純度高、廢水處理要求低、對環(huán)境影響較小等優(yōu)點[39-40]?，F(xiàn)階段研究中，通常使用脂肪酶催化甘油三酯羧酯鍵的水解，但在水活性低的反應條件下，脂肪酶可以催化醇的羧酸酯化，或催化羧酸酯的轉(zhuǎn)酯化[41]。Katiyar等[42]采用物理吸附法將制備的SBA-15用于固定紅色念珠菌脂肪酶，利用所獲得的固定化酶作為催化劑，催化棉籽油與甲醇進行酯交換反應制備生物柴油。結(jié)果表明，在反應溫度為40℃、棉籽油與甲醇摩爾比為6∶1、固定化酶的質(zhì)量分數(shù)為5%的條件下反應68 h，脂肪酸甲酯的產(chǎn)率可達（98±2）%。Pinto等[43]探究了介孔材料SBA-15固定脂肪酶以催化棕櫚仁油生成脂肪酸乙酯。結(jié)果顯示，固定化酶具有良好的催化性能。其中，物理吸附法制備的催化劑能更有效地進行酯交換反應，催化劑表觀收益率均＞90%，乙酯轉(zhuǎn)化率均＞98%。

2.1.2 甘油二酯的制備

天然油脂中甘油二酯（diacylglycerol，DAG）含量較低，可通過酶促甘油解法制備DAG[44]。酶促甘油解法是指在酶催化下，將甘油和三酰甘油（triacylglycerols，TAG）催化生成DAG的方法?？苊玔45]分別使用不同基團修飾的SBA-15固定化磷脂酶（lecitaseultra，LU），并將其用于大豆油甘油解反應制備DAG的催化反應。結(jié)果顯示，不論修飾與否的SBA-15固定化酶均能催化甘油解反應，且修飾后的固定化酶具有更優(yōu)異的重復使用性。其中，在優(yōu)化C5H13N-SBA-15-LU催化甘油解的最佳條件下，TAG轉(zhuǎn)化率最高可達（93.84±0.71）%。Wang等[46]將介孔材料SBA-15經(jīng)過鹵素和鹵烷烴修飾后分別固定化南極假絲酵母脂肪酶、米曲霉脂肪酶、磷脂酶、米黑根霉脂肪酶，再將其用于催化大豆油的甘油解反應。結(jié)果顯示，固定化酶均能有效地催化生成DAG。其中，固定化米黑根霉脂肪酶的甘油解性能最好，TAG轉(zhuǎn)化率達到了71.47%～89.41%，DAG質(zhì)量分數(shù)含量達到了52.79%～59.22%。

2.1.3 生物乙醇的生產(chǎn)

生物乙醇是一種可再生生物燃料資源，通常被用作汽油添加劑，以增加辛烷值以及減少CO排放[47]。一般來說，生物乙醇的生產(chǎn)過程包括預處理（第一次水解）、糖化（第二次水解）、解毒、發(fā)酵和分離。然而，生物乙醇生產(chǎn)的重要步驟是水解過程，因為在這一步驟中需要使用高成本的酶[48]。Wongvitvitchot等[49]將里氏木霉酶分別固定在MCM-48、TUD-1和SBA-15載體上，研究不同載體的固定化效率。結(jié)果顯示，SBA-15固定化酶吸附性能最高，能達到100%，因此選擇SBA-15固定化木霉酶用于纖維素的水解。在纖維素水解的最佳條件下，使用1.2 g固定化酶水解3 d能得到90%的糖。即使循環(huán)使用3次，固定化酶仍然具有較高的催化效率，這表明SBA-15固定化木霉酶在工業(yè)應用上具有一定的潛力。

2.2 生物傳感器

生物傳感器是一種能將生物信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕膫鞲衅鳎嘤糜谑称钒踩娃r(nóng)產(chǎn)品檢測。常見的生物傳感器通過固定在電極上的酶和底物反應前后產(chǎn)生的電流信號變化得出酶被抑制的程度，抑制程度和農(nóng)藥濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，因此可以檢測出農(nóng)藥殘留[50]。芮銀等[24]對合成的SBA-15氨基化修飾制得NH2-SBA-15，再用吸附-交聯(lián)法將乙酰膽堿酶（acetylcholine enzyme，AChE）固定在上述載體，得到AChE-NH2-SBA-15。農(nóng)藥可以抑制AChE的活性，因此可以用固定化酶分別檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。結(jié)果顯示，與游離酶相比，固定化酶在農(nóng)藥檢測的靈敏度、線性范圍和檢出限方面均表現(xiàn)出更好的效果。向固定化酶中添加一定量的農(nóng)藥進行檢測，檢測出的農(nóng)藥回收率為94%～103%，且相對標準偏差＜5%，說明檢測準確，誤差小。

2.3 環(huán)境保護

木質(zhì)纖維農(nóng)業(yè)廢棄物作為陸地植物中第二豐富的生物廢棄物，是很有前景的天然、低成本、可再生和持久性原料[51]。木質(zhì)纖維素利用的第一個主要步驟是預處理，旨在通過降解木質(zhì)素成分和降低纖維素結(jié)晶度來增加纖維素和半纖維素的可及性[52]。Sadeghian-Abadi等[53]以SBA-15固定化漆酶用于木質(zhì)素的降解。研究結(jié)果顯示，在孵育12 h后，固定化酶能夠有效地將木質(zhì)素以可溶形式去除，脫木質(zhì)素效率可達91%。固定化酶也能夠去除從木質(zhì)素中釋放出來的酚類化合物，使用SBA-15固定化漆酶降解木質(zhì)素4 h后從上清液中去除了30%以上的酚類化合物，12 h后固定化漆酶僅保留10%的酚類物質(zhì)。

Qiu等[54]以羧基功能化離子液體為橋接劑，將無機材料SBA-15與殼聚糖結(jié)合，得到的納米復合材料固定化漆酶并用于酚類污染物的去除。漆酶將2，4-二氯苯酚氧化成活性自由基，聚合形成二聚體，使其在水中的溶解度和毒性降低，從而更容易從水中分離。結(jié)果顯示，固定化酶能有效地除去酚類污染物，去除率最高可達到90%。

3 總結(jié)及展望

目前，SBA-15固定化酶已涉及醫(yī)藥、食品、能源、生物清潔等多個領域。隨著介孔材料的研究不斷深入，SBA-15固定化酶的研究愈加成熟。盡管如此，SBA-15固定化酶仍留存一些問題需要解決：（1）僅靠較弱物理吸附的作用力不足以將酶牢牢固定在載體上，且固定化酶易受外界環(huán)境因素影響發(fā)生解吸附；（2）對SBA-15功能化處理步驟繁瑣，成本較高，且一定程度上損失了酶活，限制了其在工業(yè)上的廣泛應用；（3）現(xiàn)階段的研究集中在SBA-15固定化單酶上，而將其應用于多酶偶聯(lián)催化反應較少。因此，仍需要深入研究或創(chuàng)造新型固定化載體和方法，實現(xiàn)多酶的有序連接，在保證酶活性的前提下穩(wěn)固酶和載體的連接力，降低生產(chǎn)成本以滿足實際工業(yè)需求。