毛旭娜，李 軍

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城252059)

Toll樣受體(Toll-like-receptors，TLRs)是一個(gè)重要的天然免疫受體家族，能夠感知多種病原相關(guān)的分子模式(patho-associated molecular patterns，PAMPs)，如未甲基化雙鏈DNA(CpG)、單鏈RNA(ssRNA)、脂蛋白、脂多糖(LPS)和鞭毛蛋白[1]。當(dāng)TLRs特異性識(shí)別了PAMPs后，通過(guò)多種接頭分子啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，以抵抗病原體入侵。最早發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體是黑腹果蠅Toll-1，發(fā)現(xiàn)于1985年[2]，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)該基因及其信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守。髓樣分化因子88(Myeloid Differentiation Factor 88，MyD88)在TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用[3]。TLR信號(hào)通路包括MyD88依賴和MyD88非依賴信號(hào)通路[4]。在眾多toll樣受體中，只有少數(shù)TLR(如TLR3)不參與MyD88依賴的信號(hào)通路[5]。

MyD88通常由一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domian，DD)、一個(gè)中間結(jié)構(gòu)域和一個(gè)TIR(Toll/白介素-l受體)結(jié)構(gòu)域組成[3]。MyD88通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域與多種受體的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，對(duì)上游信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；通過(guò)DD結(jié)構(gòu)域之間的相互作用招募并激活I(lǐng)L-1R相關(guān)激酶(IRAK)，進(jìn)而導(dǎo)致下游免疫信號(hào)級(jí)聯(lián)放大[3]。目前的研究顯示，MyD88是多種惡性腫瘤[6]、自身免疫性疾病[7，8]和感染性疾病[8]的潛在治療靶點(diǎn)，在炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞調(diào)控與增殖的研究中發(fā)揮著重要作用，在果蠅和文昌魚中MyD88與TLRs的直接相互作用表明，該途徑在進(jìn)化過(guò)程中功能極為保守[9]。鑒于MyD88作為NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵接頭蛋白，在天然免疫中的重要作用，已有多個(gè)物種的MyD88基因被鑒別，如脊索動(dòng)物門中的文昌魚[10]、人[11]、小鼠[11]、斑馬魚[12]，節(jié)肢動(dòng)物門中的大腹園蛛[13]、果蠅[14]，軟體動(dòng)物門中的海蝸牛、櫛孔扇貝[15]、太平洋牡蠣[16]，棘皮動(dòng)物門中的海星以及刺胞動(dòng)物門中的水螅[17]等物種，但迄今為止，后口生物和原口生物之間的過(guò)渡類群——腕足類動(dòng)物MyD88基因還未鑒別。

鴨嘴海豆芽(Lingulaanatina)，俗稱海豆芽[18]，外形呈殼舌形或長(zhǎng)卵形，具大小不等兩瓣殼體，腹殼后端莖孔伸出一粗大可伸縮肉莖，借肉莖肌肉收縮挖掘泥沙，穴居于潮汐帶細(xì)砂質(zhì)或泥沙質(zhì)淺灘。海豆芽屬于的冠輪動(dòng)物超門(Lophotrochozoa)，腕足動(dòng)物門(Brachiopod)，舌形貝亞門(Linguliformea)。寒武紀(jì)的化石證據(jù)證明舌形貝亞門是最為原始的腕足動(dòng)物[18]，現(xiàn)存舌形貝亞門仍然保留了祖先的形態(tài)和生活方式。目前已有研究人員完成了鴨嘴海豆芽基因組測(cè)序[19]。海豆芽基因組的解析為研究免疫系統(tǒng)的起源和演化提供了新的參考。

本研究成功克隆鴨嘴海豆芽MyD88基因(后均稱laMyD88)全長(zhǎng)序列，并成功構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行定位及功能分析，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(鰻弧菌)細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)在被細(xì)菌挑戰(zhàn)后，laMyD88基因表達(dá)水平發(fā)生了變化，說(shuō)明laMyD88參與鴨嘴海豆芽的天然免疫調(diào)控過(guò)程。我們的研究對(duì)于研究MyD88基因的系統(tǒng)進(jìn)化具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣本采集

鴨嘴海豆芽采自中國(guó)日照劉家灣海灘，選取長(zhǎng)度約為40 mm，寬度約為20 mm的成年海豆芽，用于分離組織以及進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌株和細(xì)胞

細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)所用的菌株為金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)和鰻弧菌(革蘭氏陰性菌)[20]；克隆載體轉(zhuǎn)化所用感受態(tài)菌株為Transl-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，表達(dá)載體所用感受態(tài)菌株為大腸桿菌DH5α。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人胚腎HEK293T細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞系。

1.3 克隆載體及表達(dá)載體

克隆載體構(gòu)建試劑盒pEAZY-Blunt Zero Cloning Kit，載體為pEAZY-Blunt Zero Cloning Vector，(Transgen，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。表達(dá)載體構(gòu)建所用的質(zhì)粒為pDesRed2-N1、pcDNA3.1來(lái)自中山大學(xué)醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc和pRL購(gòu)自Promega公司。

1.4 主要試劑

表1 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 laMyD88預(yù)測(cè)基因序列的獲取和分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得牡蠣MyD88氨基酸序列，在海豆芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù) (https://marinegenomics.oist.jp/lingula/gallery)進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)laMyD88基因的cDNA序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域使用SMART(https://smart.embl.de/)進(jìn)行分析。

2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)基因組預(yù)測(cè)的laMyD88基因的3′和5′UTR區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增laMyD88基因全長(zhǎng)CDS。在上下游引物前加入XhoI、KpnI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體引物[21]。根據(jù)鴨嘴海豆芽的轉(zhuǎn)錄組序列和基因組序列，設(shè)計(jì)內(nèi)參基因及l(fā)aMyD88基因的qPCR引物，所有引物(表2)均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

2.3 鴨嘴海豆芽總RNA的提取和cDNA合成

參照RNAiso(Takara，日本)試劑說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取。約25 mg的鴨嘴海豆芽組織經(jīng)液氮研磨后加入到1 mL RNAiso試劑中劇烈搖晃15 s，靜置后離心，取上清至新的離心管中加入氯仿，劇烈搖晃15 s，靜置后離心，取上層水相至新的離心管中，加入等體積氯仿，劇烈搖晃15 s后靜置，離心后取上層水相至新的離心管中，加入等水相體積異丙醇，輕柔顛倒混勻，-20 ℃靜置1 h，離心，預(yù)冷乙醇輕柔洗滌沉淀。離心后去上清，待沉淀完全干燥至透明狀后，加入DEPC水溶解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及濃度。RNA提取后及時(shí)逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)備用，剩余RNA保存在-80 ℃，盡量避免反復(fù)凍融。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

2.4 laMyD88基因的克隆及鑒定

以鴨嘴海豆芽cDNA為模板，利用擴(kuò)增引物，進(jìn)行l(wèi)aMyD88基因的全長(zhǎng)序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選大小符合的條帶用膠回收試劑盒進(jìn)行純化后備用，進(jìn)行克隆載體與表達(dá)載體的構(gòu)建。

利用pEAZY-Blunt Zero Cloning 試劑盒，將純化的PCR產(chǎn)物與pEAZY-Blunt Zero Cloning Vector連接，并轉(zhuǎn)化至Transl-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂在含有氨芐抗性的瓊脂平板上，該質(zhì)粒含有自殺基因，不需要藍(lán)白斑篩選，所有長(zhǎng)出的菌斑均為含有目的基因的菌落。挑取10個(gè)單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒小提，進(jìn)行菌落PCR進(jìn)行初步驗(yàn)證，并將擴(kuò)增片段大小與目的基因相同的質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，用seqman軟件拼接測(cè)序結(jié)果，用ClustalX軟件比對(duì)。

2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶Xho I、Kpn I分別酶切PCR產(chǎn)物及pDesRed2-N1、pcDNA3.1質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌濃度合適后提取質(zhì)粒，并命名為RFP-MyD88、pc3.1-MyD88，單酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取片段大小正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.6 細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T、HeLa細(xì)胞在添加10% FCS(Gibco)和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)。革蘭氏陰性鰻弧菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。離心收集細(xì)菌，PBS洗滌2次，重懸后計(jì)數(shù)，濃度調(diào)至5×106C/mL。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)在以下條件下進(jìn)行：98 ℃、3 min，98 ℃、10 s，50 ℃、5 s，72 ℃、3 min，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。用SYBR Green I Master Mix在LightCycle 480Ⅱ Real-time PCR系統(tǒng)中進(jìn)行qPCR。檢測(cè)laMyD88和鴨嘴海豆芽β-肌動(dòng)蛋白的Ct值。應(yīng)用比較Ct值法(2-ΔΔCt)進(jìn)行相對(duì)定量，ΔΔCt=處理組(目的基因Ct-內(nèi)參Ct)-未處理組(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)。

2.7.1laMyD88在不同組織的分布差異。利用RNAiso從血液、消化腺、消化道、性腺、觸手圍、肉莖、肌肉、外套膜8個(gè)組織或器官中提取總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。

2.7.2 細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。對(duì)鴨嘴海豆芽進(jìn)行體腔注射，分別于注射后1、4、12、36 h采集不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取鴨嘴海豆芽總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。

2.8 細(xì)胞亞細(xì)胞定位和及熒光素酶雙報(bào)告基因分析

細(xì)胞在孔板培養(yǎng)24 h后，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，用lipofectine2000 (Invitrogen公司) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。RFP-MyD88在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，轉(zhuǎn)染24 h后，PBS清洗蓋層Hela細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定，激光掃描共聚焦顯微鏡共聚焦成像；將構(gòu)建好的pc3.1-MyD88和空載體pcDNA3.1分別與報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc和海腎熒光素酶對(duì)照質(zhì)粒pRL共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，對(duì)照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。根據(jù)公式計(jì)算樣品住(sample)相對(duì)于對(duì)照組(control)報(bào)告基因活性的上調(diào)倍數(shù)：ΔFA=(F/R)sample/(F/R)control，F(xiàn)為報(bào)告質(zhì)粒firefly熒光素酶讀數(shù)值，R為內(nèi)參質(zhì)粒Renilla熒光素酶讀數(shù)值。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)和±SD。顯著性分析采用One-way ANOVA檢驗(yàn)。柱上的星號(hào)(*)表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)與對(duì)照數(shù)據(jù)的顯著差異(*，p<0.05;**，p<0.01;***，p<0.001;****，p<0.000 1)。

3 結(jié)果

3.1 laMyD88目的基因的克隆

利用所設(shè)計(jì)的克隆引物laMyD88-F及l(fā)aMyD88-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段大小與預(yù)測(cè)片段一致，約為1 700 bp。測(cè)序分析表明，所獲得克隆片段全長(zhǎng)cDNA為1 695 bp，ORF為1 320 bp，編碼439個(gè)氨基酸，如圖1(a)所示。我們將所獲得序列在NCBI genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLASTX比對(duì)，結(jié)果顯示，所獲得序列與hsMyD88 (Homosapiens)、musMyD88(Musmusculus)、sjMyD88(Stichopusjaponicus)、bbtMyD88(Branchiostomabelcheri)同源，圖1(a)表明我們成功克隆了鴨嘴海豆芽MyD88全長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼區(qū)CDS(Coding sequence)。

3.2 laMyD88序列和進(jìn)化分析

應(yīng)用SMART數(shù)據(jù)庫(kù) (http://smart.embl.de/)對(duì)laMyD88的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，laMyD88 蛋白序列第18～117 位氨基酸為死亡域 (DD)，第172～306個(gè)氨基酸為TIR結(jié)構(gòu)域，DD和TIRs的存在對(duì)其功能至關(guān)重要，結(jié)果如圖1(a)所示。比較laMyD88與人、小鼠、斑馬魚、文昌魚、刺參、果蠅、大腹園蛛、太平洋牡蠣、九孔螺、鹿角杯形珊瑚(Pocilloporadamicornis)等物種的已報(bào)道MyD88蛋白序列發(fā)現(xiàn)，后口動(dòng)物MyD88只編碼DD和TIR結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)中間結(jié)構(gòu)域。而包括laMyD88在內(nèi)的原口動(dòng)物MyD88在蛋白序列的羧基端還編碼了一段低復(fù)雜度區(qū)域，鹿角杯形珊瑚MyD88由三個(gè)DD+TIR的重復(fù)序列構(gòu)成，結(jié)果如圖1(b，c)所示。使用MEGA7軟件的Neighbor-Joining算法以上述物種的MyD88基因的DD和TIR結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1(d，e)所示。以DD構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，laMyD88與刺胞動(dòng)物MyD88作為外群存在。以TIR構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，laMyD88與同屬冠輪動(dòng)物的軟體動(dòng)物MyD88 TIR結(jié)構(gòu)域與后口動(dòng)物親緣關(guān)系更近。

3.3 laMyD88在不同器官或組織中的分布

采用qPCR方法檢測(cè)laMyD88在鴨嘴海豆芽8個(gè)器官或組織中的特異性表達(dá)。如圖2(a)所示，我們收集了8個(gè)器官或組織，包括血液(blood)、消化腺(digestive cecum)、消化道(gut)、性腺(gonad)、觸手圍(lophophore)、肉莖(pedicle)、肌肉(muscle)、外套膜(mantal)來(lái)研究不同器官或組織的差異。結(jié)果表明，laMyD88在不同器官或組織中的表達(dá)存在明顯差異，與其他組織或器官相比，laMyD88在消化腺和消化道中表達(dá)量較高；其在肉莖和肌肉中的表達(dá)極低。

3.4 細(xì)菌挑戰(zhàn)后laMyD88在鴨嘴海豆芽體內(nèi)的表達(dá)情況

在細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中，注射革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性鰻弧菌(V.anguillarum)后，laMyD88基因的轉(zhuǎn)錄本均發(fā)生了顯著變化，結(jié)果如圖2(b，c)。注射革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌后，laMyD88的相對(duì)表達(dá)量在1 h內(nèi)升高，然后降低。在接下來(lái)的10 h中，出現(xiàn)了波動(dòng)，在12 h，表達(dá)水平達(dá)到了頂峰，然后從第12 h開始下調(diào)。革蘭氏陰性鰻弧菌與革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌的表達(dá)略有不同。1 h，laMyD88的相對(duì)表達(dá)量降低，7 h后逐漸升高。在8 h，表達(dá)水平上升到最高，然后下降。注射革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌鰻弧菌36 h相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照。

注：(a) laMyD88核酸和氨基酸序列；(b) 不同物種MyD88的蛋白序列比對(duì)； (c)鴨嘴海豆芽laMyD88與人hsMyD88、大腹園蛛avMyD88、文昌魚bbtMyD88和刺參sjMyD88的結(jié)構(gòu)域比較。(d) MyD88基因DD結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育樹；(e)MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育樹。物種中英文名稱比對(duì)：人(Homo sapiens，hsMyD88)、小鼠(Mus musculus，MmuMyD88)、斑馬魚(Danio rerio，DrMyD88)、文昌魚(Branchiostoma belcheri，BbtMyD88)、刺參(Stichopus japonicus，SjMyD88)、果蠅(Drosophilid，DroMyD88)、大腹園蛛(Araneus ventricosus，ArMyD88)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas，CgMyD88)、九孔螺(Haliotis diversicolor，HdMyD88)、鴨嘴海豆芽(lingula anatina，laMyD88)、鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis，PdMyD88)。

3.5 laMyD88的蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞分布

將表達(dá)RFP-MyD88融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)laMyD88蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3(a)所示，紅色熒光點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)中，與文獻(xiàn)報(bào)道的文昌魚bbtMyD88基因在細(xì)胞中的表達(dá)一致[22]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)各物種MyD88基因均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核小體中。

3.6 laMyD88參與核因子-κB信號(hào)通路

為了驗(yàn)證laMyD88是否能夠激活NF-κB信號(hào)通路，參與天然免疫應(yīng)答。我們將laMyD88的ORF重組到pcDNA3.1質(zhì)粒中。熒光素酶雙報(bào)告基因分析表明，laMyD88過(guò)表達(dá)能顯著提高熒光素酶的表達(dá)，且具有轉(zhuǎn)染劑量依賴效應(yīng)，圖3(b)。

圖2 (a) laMyD88的組織或器官分布；(b)金黃色葡萄球菌刺激后laMyD88在0、1、4、12、36 h的qPCR分析；(c)鰻弧菌刺激后laMyD88在0、1、4、12、36 h的qPCR分析(*，p<0.05;**，p<0.01;***，p<0.001;****，p<0.000 1)。

4 討論

20世紀(jì)80年代以前，腕足動(dòng)物門因?yàn)榫哂休椛渎蚜押湍c體腔等胚胎發(fā)育特征而被歸于后口動(dòng)物[23]，現(xiàn)代分子生物學(xué)將腕足動(dòng)物劃歸于原口動(dòng)物[24]。盡管腕足動(dòng)物在冠輪動(dòng)物門的準(zhǔn)確系統(tǒng)發(fā)育位置仍然不能確定，但海豆芽為代表的腕足動(dòng)物在系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)研究中具有重要地位。

本文成功克隆了鴨嘴海豆芽MyD88基因，命名為laMyD88，通過(guò)對(duì)laMyD88蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，laMyD88由氨基端的死亡結(jié)構(gòu)域，羧基中間的TIR結(jié)構(gòu)域以及羧基端的一段低復(fù)雜度區(qū)域構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在原口動(dòng)物高度保守。而后口動(dòng)物MyD88只編碼DD和TIR結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)中間結(jié)構(gòu)域，這說(shuō)明MyD88基因在原口動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中的保守性。以DD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)化分析表明，海豆芽與其他原口和后口動(dòng)物物種相比保留了較為原始的祖先特征，而以TIR構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，海豆芽與后口動(dòng)物親緣關(guān)系更近，而蛻皮動(dòng)物則保留了較為原始的祖先特征。以上結(jié)果既符合現(xiàn)代分子生物學(xué)對(duì)腕足動(dòng)物的系統(tǒng)分類，為確定腕足動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化地位提供了新的證據(jù)。

圖3 (a)laMyD88在HeLa細(xì)胞中成功表達(dá)及l(fā)aMyD88免疫熒光情況；(b)HEK293細(xì)胞過(guò)表達(dá)laMyD88后熒光素酶報(bào)告基因pNF-κB-Luc的相對(duì)熒光素酶活性

對(duì)于laMyD88在鴨嘴海豆芽組織中的表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，鴨嘴海豆芽消化腺和消化道的表達(dá)量最高，這與其他物種中的研究基本一致。眾所周知，腕足動(dòng)物僅存在先天免疫，而作為濾食性動(dòng)物在富含微生物的泥土中生活，受環(huán)境的脅迫，消化腺和腸道是免疫系統(tǒng)中重要的器官，因此其表達(dá)量較高；查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，軟體動(dòng)物的血細(xì)胞在先天免疫中有著至關(guān)重要的作用[25]，而本研究中鴨嘴海豆芽的血細(xì)胞表達(dá)量較低，我們推測(cè)laMyD88在鴨嘴海豆芽應(yīng)激狀態(tài)下進(jìn)行大量表達(dá)。肉莖主要是肌肉組織，為鴨嘴海豆芽的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力以及便于固著在泥中，表達(dá)量較低；觸手圍主要用于過(guò)濾礫石等雜質(zhì)，處于脅迫環(huán)境中，在鴨嘴海豆芽中的表達(dá)量高于肌肉。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，pc3.1-MyD88可激活熒光素酶報(bào)告基因pNF-κB-Luc的相對(duì)熒光素酶活性，說(shuō)明laMyD88參與NF-κB信號(hào)通路，與后口動(dòng)物相似[9，26]。無(wú)脊椎動(dòng)物中NF-κB信號(hào)通路是重要的應(yīng)激免疫通路[27]，同時(shí)結(jié)合laMyD88經(jīng)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌刺激后的表達(dá)情況，表明laMyD88依賴的NF-κB信號(hào)通路在鴨嘴海豆芽的先天免疫中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建laMyD88的表達(dá)載體，但對(duì)laMyD88基因功能的研究還不夠深入。TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在天然免疫抗病毒、細(xì)菌及真菌過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而MyD88作為TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的接頭蛋白，其在鴨嘴海豆芽免疫應(yīng)答過(guò)程中可能起著更為關(guān)鍵作用。通過(guò)研究laMyD88基因的功能，進(jìn)一步闡述MyD88在鴨嘴海豆芽免疫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而有可能為人體中免疫應(yīng)答的調(diào)控提供新的補(bǔ)充，為多種自身免疫病、感染性疾病以及惡性腫瘤等疾病的治療提供新的見解。