李 震，王 瑞

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎已經(jīng)成為一個(gè)世界性安全問(wèn)題，給世界各國(guó)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大的損失[1]。雖然疫苗的特異性強(qiáng)，但其研發(fā)成本高且周期長(zhǎng)，而且RNA病毒的變異速度較快，這使疫苗的有效性大大降低[2，3]。針對(duì)新冠病毒如此高的變異速度，當(dāng)務(wù)之急是研發(fā)一種既對(duì)當(dāng)前的病毒有效，也對(duì)變異的病毒有治療效果的“特效藥”。有研究表明，病毒入侵細(xì)胞時(shí)，首先病毒S蛋白R(shí)BD與人體細(xì)胞的表面受體ACE2結(jié)合，隨后病毒膜和細(xì)胞膜融合，病毒被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，重新組裝成大量新的病毒，又去繼續(xù)感染其他細(xì)胞。S蛋白受體結(jié)合域(RBD)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的結(jié)合是SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式[4，5]，不管病毒是否變異，均主要通過(guò)此種方式入侵細(xì)胞，故可以針對(duì)這種結(jié)合方式設(shè)計(jì)一種抑制劑阻斷兩者結(jié)合，從而阻止新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。小分子抗病毒藥物在治療由病毒引起的疾病方面有著舉足輕重的地位。瑞德西韋、洛匹那韋、 依米丁、高三尖杉酯堿等多種小分子抗病毒藥物已被證明可以抑制病毒的復(fù)制，其中瑞德西韋是2019年批準(zhǔn)的第一種治療新冠病毒的藥物[6，7]。小分子抗病毒藥物在阻斷蛋白與蛋白結(jié)合方面效果欠佳，而多肽藥物在這方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[8]。PDB(Protein Data Bank)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為6M0J的RBD與ACE2的熱點(diǎn)結(jié)合殘基通過(guò)100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬已分析得到[9]，ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被驗(yàn)證具有阻斷RBD與ACE2結(jié)合的活性，且27～38這段多肽不能與RBD結(jié)合[10]，通過(guò)對(duì)接也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。通過(guò)丙氨酸掃描，三種不同的對(duì)接方式以及50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證了兩條肽段(18肽：28～45和23肽：23～45)具有相近的結(jié)合效率[11]。肽的長(zhǎng)度雖然縮短，但對(duì)結(jié)合效率的影響較小，提示或許存在一條更短的多肽仍具有阻斷病毒入侵的能力。本研究使用DS軟件確定最佳多肽對(duì)接分?jǐn)?shù)，通過(guò)突變提高多肽的親和力，設(shè)計(jì)了一系列長(zhǎng)度較短的多肽并通過(guò)對(duì)接和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，這將為新冠病毒的治療提供新的方式。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；293-ACE2細(xì)胞(上海藥物所)；多肽合成(南京肽業(yè)生物科技有限公司)；新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus (GFP)(吉滿生物科技(上海)有限公司GM-0220PV07)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；胎牛血清(美國(guó)Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；MTT(上海阿拉丁試劑有限公司)；DMSO(上海阿拉丁試劑有限公司)；RG005螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；CKX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(美谷分子儀器(上海)有限公司)；XP6百萬(wàn)分之一超微量天平(德國(guó)梅特勒公司)；多功能微孔板檢測(cè)Synergy H1(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 多肽設(shè)計(jì)、篩選與驗(yàn)證

1.2.1 三維結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備。從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)[12]中檢索到了ACE2-RBD復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：6M0J)用于肽段的設(shè)計(jì)和開發(fā)。使用DS軟件對(duì)6M0J蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行預(yù)處理[13]。所有設(shè)計(jì)的肽的復(fù)雜結(jié)構(gòu)均是從與SARS-CoV-2-RBD結(jié)合的ACE2-PD的螺旋的晶體結(jié)構(gòu)中獲得，同時(shí)查看RBD和ACE2的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 初始構(gòu)象設(shè)定。將熱點(diǎn)殘基設(shè)置為結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)均方根誤差截止值(RMSD Cutoff) 設(shè)置為6.0；相互作用面的截止距離(Interface Cutoff)設(shè)置為9.0；最大分組數(shù)(Maximum Number of Clusters )設(shè)置為60，進(jìn)行ZDOCK對(duì)接。同時(shí)在對(duì)接的蛋白質(zhì)姿勢(shì)的初始排名中使用形狀互補(bǔ)性，去溶劑化作用和靜電能。使用默認(rèn)參數(shù)將對(duì)接結(jié)果中ZRank分?jǐn)?shù)[14]排名前10的構(gòu)象進(jìn)行RDOCK對(duì)接，來(lái)對(duì)構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。使用蛋白質(zhì)疊合工具對(duì)RDOCK對(duì)接結(jié)果產(chǎn)生的構(gòu)象進(jìn)行疊合，同時(shí)以6M0J原始構(gòu)象為基準(zhǔn)計(jì)算各構(gòu)象的RMSD值。

1.2.3 多肽重設(shè)計(jì)。使用DS軟件的計(jì)算突變結(jié)合能(Calculate Mutation Energy (Binding))模塊先進(jìn)行單點(diǎn)突變(丙氨酸掃描)[15]，然后對(duì)非關(guān)鍵的氨基酸殘基進(jìn)行三點(diǎn)突變，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。使用DS軟件的側(cè)鏈重設(shè)定(Side-Chain Refinement)功能[16]對(duì)突變后的配體構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。使用DS軟件的能量最小化(Full Minimization)模塊對(duì)配體和受體結(jié)合的復(fù)合物進(jìn)行能量最小化，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4 CDOCKER對(duì)接。使用DS軟件的CDOCKER對(duì)接模塊對(duì)30～38的原始序列，最佳三種突變方式以及最差的一種突變方式與RBD進(jìn)行CDOCKER對(duì)接，最大最佳構(gòu)象數(shù)量(Top Hits)設(shè)置為100，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。

1.3 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)。293T細(xì)胞和293-ACE2細(xì)胞均使用DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%。顯微鏡下觀察細(xì)胞，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，密度達(dá)到80%～90% 即可傳代，傳代時(shí)用0.25% 胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)的均值×104為每mL所含細(xì)胞數(shù))。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液按照實(shí)驗(yàn)需要接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)所需。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293-ACE2細(xì)胞以3 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L的多肽，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)處理4 h后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入120 μL DMSO，輕微震蕩10 min，在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定OD值讀數(shù)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率 Relative survival/control=測(cè)試組OD值/對(duì)照組OD值。

1.3.3 多肽活性測(cè)定。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T和293-ACE2細(xì)胞以5 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)計(jì)2個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。將不同濃度的多肽與帶有綠色熒光標(biāo)記的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)拍照，并進(jìn)行熒光檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度 Fluorescence relative to control =測(cè)試組熒光值/對(duì)照組熒光值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值(Mean ± SD)表示，各組數(shù)據(jù)差異性比較采用t-test(非參數(shù)檢驗(yàn))方法進(jìn)行分析，p>0.05表示差異性不顯著；*，0.01

2 結(jié)果

2.1 初始構(gòu)象設(shè)定

使用DS軟件查看6M0J中RBD與ACE2的結(jié)合殘基，與已報(bào)道的關(guān)鍵殘基基本一致，將這些殘基設(shè)置為結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行ZDOCK對(duì)接，共產(chǎn)生2 000個(gè)構(gòu)象。將結(jié)果中Zdock值前10的構(gòu)象與6M0J進(jìn)行疊合后發(fā)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果較好，這10個(gè)構(gòu)象的RMSD值有9個(gè)小于0.2 nm，其中有4個(gè)構(gòu)象的RMSD值小于0.1 nm，如表1所示。再次使用DS軟件查看這4個(gè)構(gòu)象的結(jié)合殘基并與已有報(bào)道中的關(guān)鍵殘基進(jìn)行比較，如表1所示。結(jié)果顯示Pose2與關(guān)鍵殘基相比，缺少19，355，387，但這三個(gè)殘基是氫鍵維持時(shí)間最短的三個(gè)；Pose3缺少19，35，37，38，41，355，387；Pose4缺少35，37，41，42，355，387；Pose5缺少35，37，355，387，除Pose2外都涉及較重要的關(guān)鍵殘基。而比較RMSD值，Pose2的也是最小的。同時(shí)計(jì)算RBD與ACE2的結(jié)合力為-57.347 48 kcal/mol。綜上，選擇Pose2中RBD-ACE2復(fù)合物的構(gòu)象作為初始構(gòu)象，并將對(duì)接結(jié)果作為參照。

表1 Zdock分?jǐn)?shù)排名前10且RMSD值小于1的4個(gè)構(gòu)象以及原始構(gòu)象的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 初始肽段構(gòu)建

圖1 ACE2、21～43、27～38、30～38與RBD對(duì)接后親和力計(jì)算

ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被驗(yàn)證具有阻斷RBD與ACE2結(jié)合的活性，且27～38這段多肽不能與RBD結(jié)合[10]。使用這兩段已被驗(yàn)證親和力的多肽(a.a.21～43 和a.a.27～38)與RBD進(jìn)行對(duì)接，并與初始構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證通過(guò)對(duì)接設(shè)計(jì)多肽抑制劑的可靠性，如表2所示。結(jié)果顯示21～43肽段的對(duì)接結(jié)果確實(shí)和RBD與ACE2的對(duì)接結(jié)果相當(dāng)，而27～38肽段的對(duì)接結(jié)果較差，通過(guò)計(jì)算親和力得知，RBD與ACE2的親和力為-57.347 48 kcal/mol，21～43肽段與RBD的親和力為-60.384 57 kcal/mol，27～38肽段與RBD的親和力為-38.220 76 kcal/mol，如圖1所示。通過(guò)計(jì)算親和力也進(jìn)一步驗(yàn)證21～43這段多肽的親和力相當(dāng)，而27～38這段多肽的親和力較低，表明對(duì)接結(jié)果較好。

針對(duì)熱點(diǎn)結(jié)合殘基，設(shè)計(jì)一系列不同長(zhǎng)度的多肽，并分別與RBD進(jìn)行對(duì)接，如表2所示。結(jié)果顯示30～38這段多肽是長(zhǎng)度較短且對(duì)接結(jié)果相當(dāng)?shù)碾亩?。雖然它的親和力只有-45.235 03 kcal/mol，但熱點(diǎn)結(jié)合殘基最為密集，且ZDock值也較大，說(shuō)明這段多肽的形狀互補(bǔ)性更好，更能與RBD緊密的結(jié)合。綜上這段多肽具有較高的潛力并設(shè)定為初始肽段。

表2 多肽與RBD的對(duì)接結(jié)果

2.3 對(duì)初始肽段進(jìn)行突變

對(duì)初始肽段首先進(jìn)行單點(diǎn)突變(丙氨酸掃描)，來(lái)確定初始肽段中的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)。其中32、33、37號(hào)位氨基酸殘基突變?yōu)楸彼崮芰可咔页^(guò)0.5 kcal/mol，為關(guān)鍵氨基酸殘基，30、34、38突變能升高小于0.5 kcal/mol，而31和35號(hào)位氨基酸殘基突變能降低。故選擇31、35以及36號(hào)位ALA氨基酸殘基進(jìn)行三點(diǎn)突變，共產(chǎn)生6 156種突變方式，其中共有3532種突變方式的突變能小于0.5 kcal/mol，最佳突變方式為K31I，E35Y，A36H。為更加方便的了解突變?cè)谡w上的情況，對(duì)突變能小于-4 kcal/mol的突變結(jié)果進(jìn)行分析，如圖2所示。

結(jié)果顯示，這條多肽更傾向于突變成堿性殘基，而在親疏水性方面不太明顯。這或許為設(shè)計(jì)新冠病毒的阻斷劑做出了提示。將原始構(gòu)象(pro1)，最佳前三種突變構(gòu)象(pro2～pro4)以及最差突變構(gòu)象(pro5)共五個(gè)構(gòu)象與RBD的親和力進(jìn)行比較，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)親和力和突變結(jié)果相符合，其中 pro2與RBD的結(jié)合力最高，pro2～pro4與RBD的結(jié)合力均在-100 kcal/mol以下，但pro4卻表現(xiàn)出更高的范德華力。從結(jié)合能方面看，設(shè)計(jì)的肽段都要比RBD與ACE2的結(jié)合能高。使用DS軟件的CDOCKER對(duì)接模塊對(duì)這5條肽與RBD進(jìn)行對(duì)接同時(shí)計(jì)算產(chǎn)生的每一個(gè)構(gòu)象的結(jié)合能，如圖4所示。結(jié)果顯示pro4對(duì)接結(jié)果最好，pro5結(jié)果最差，這或許和范德華力的大小有關(guān)系。

圖2 突變能小于0.5 kcal/mol的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 五條多肽與RBD的親和力

圖4 五條多肽與RBD的-CDOCKER能量值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：5條多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分別在5種濃度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)下對(duì)293-ACE2細(xì)胞的毒性。Relative survival/control=測(cè)試組OD值/對(duì)照組OD值，所有的點(diǎn)表示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5 多肽細(xì)胞毒性分析

2.4 多肽細(xì)胞毒性分析

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293-ACE2細(xì)胞以3 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。 每孔分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 的多肽，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，MTT法測(cè)定不同多肽的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，不同濃度的多肽在293-ACE2細(xì)胞中均顯示出較高的細(xì)胞活力(圖5)，與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，因此推測(cè)5條多肽對(duì)細(xì)胞均無(wú)明顯毒性。

2.5 多肽活性分析

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T和293-ACE2細(xì)胞以5 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)計(jì)2個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。將不同濃度的多肽與帶有綠色熒光標(biāo)記的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入細(xì)胞，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)結(jié)果顯示，加入5條多肽后，與對(duì)照相比，進(jìn)入細(xì)胞的病毒熒光強(qiáng)度明顯減弱，并隨多肽濃度的上升，熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖6(a))，因此推測(cè)5條多肽均具有阻斷病毒入侵細(xì)胞的能力。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，pro1多肽和pro4多肽在最高濃度1 μM時(shí)的熒光強(qiáng)度最小，因此在該濃度下pro1和pro4阻斷病毒入侵細(xì)胞的能力最強(qiáng)(圖6(b))。

注：(a) 5條多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分別在4種濃度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)下對(duì)病毒的阻斷作用;(b) 熒光強(qiáng)度的定量統(tǒng)計(jì)。相對(duì)熒光強(qiáng)度 Fluorescence relative to control =測(cè)試組熒光值/對(duì)照組熒光值，誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6 多肽活性測(cè)定

3 討論

由新冠病毒引起的疫情對(duì)人類的健康和世界的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的破壞。S蛋白受體結(jié)合域(RBD)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的結(jié)合是新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式。ACE2表達(dá)于人體的多種器官和組織中，例如心臟、腎臟、睪丸、肺、肝臟、結(jié)腸、呼吸道以及血管[17]，因此ACE2在人體中扮演著極其重要的角色，這也是患者感染新冠病毒后，出現(xiàn)呼吸困難以及多種器官受損的原因所在[18]。阻斷RBD與ACE2的結(jié)合，將會(huì)有效的抑制新冠病毒對(duì)人體細(xì)胞的感染。

本研究利用DS軟件對(duì)接設(shè)計(jì)了一條含有9個(gè)氨基酸的多肽(pro1)，并通過(guò)突變進(jìn)一步提高了其與RBD的親和力(pro2-pro4)，從而阻斷RBD與ACE2的結(jié)合。有研究表明，存在于hACE2上的一段多肽(a.a.21～43)與RBD的親和力較高，且另一段多肽(a.a.27～38)不能與RBD結(jié)合[10]。對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)這條多肽更傾向于突變成堿性殘基，而在親疏水性方面不太明顯，這為新冠病毒抑制劑的開發(fā)提供了重要依據(jù)。本研究進(jìn)一步在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證明計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的多肽具有一定的阻斷病毒入侵的能力，與對(duì)接結(jié)果相似。pro5作為最差的突變體，與pro2、3的熒光強(qiáng)度相似，也具有一定的阻斷病毒入侵的能力。這是因?yàn)樵茧亩闻cRBD已具有較高的親和力，雖突變結(jié)果較差但是仍然會(huì)表現(xiàn)出一定的親和力。其次，設(shè)計(jì)的多肽的目的是為了和RBD-ACE2的結(jié)合面相結(jié)合，但也不排除設(shè)計(jì)的多肽會(huì)結(jié)合到其他位置，導(dǎo)致表現(xiàn)出了抑制作用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)虛擬對(duì)接設(shè)計(jì)的多肽對(duì)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞具有阻斷作用，這種方法是可行的，但同時(shí)也表明虛擬對(duì)接設(shè)計(jì)與真實(shí)情況會(huì)存在一定的差別。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在一定程度上縮短了藥物篩選的時(shí)間，加快藥物研發(fā)的速度，助力藥物研究。