朱鳳儀 ，張濤 ，周小勇 （通信作者*）

（1.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430000 ; 2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

0 引言

肛門濕疹（Anal eczema, AE）是指發(fā)生于肛門周圍皮膚，以瘙癢、潮濕、散在丘疹及滲液為主要表現(xiàn)的皮膚疾病[1]。AE的發(fā)病機制復雜[2]，多與生活環(huán)境、氣候條件等外在因素和感染、免疫、內(nèi)分泌失調(diào)等內(nèi)在因素相互作用有關[3]。當前對AE的治療多以抗組胺類藥物、糖皮質(zhì)激素及對癥治療為主[4]，但因其易復發(fā)，遷延難愈多不易被患者接受。免疫因素在AE 的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，因此從免疫細胞浸潤對AE發(fā)病機制進行探討，對實現(xiàn)AE的精準治療有重要意義。故本次研究基于AE患者基因芯片，篩選差異表達基因，通過CIBERSORT反卷積算法，進行免疫細胞浸潤分析，以期為AE的免疫精準治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AE基因芯片數(shù)據(jù)

登錄GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）， 以“Anal eczema”“Perianal Eczema”“Eczema”為關鍵詞檢索基因芯片數(shù)據(jù)及平臺文件，通過平臺文件將芯片數(shù)據(jù)轉化為基因名稱。

1.2 差異表達基因的確定

借助R軟件的“l(fā)imma”程輯包對AE及健康對照組的基因表達數(shù)據(jù)進行差異分析，以|logFC|≥ 2，P＜0.05為篩選條件[5]，以 logFC 的正負值代表基因的上調(diào)及下調(diào)表達，在R軟件中安裝“ggpubr”“ggplot2”“pheatamp”程輯包，繪制差異表達基因火山圖及熱圖，選取上調(diào)及下調(diào)排名前20的基因繪制偏差圖。

1.3 差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡及核心蛋白篩選

登錄 String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入1.2獲取到的差異表達基因，限定物種為Homo Sapiens，最低交互評分設置為0.9，設置自動刪除游離基因，其余設置保持不變，構建PPI功能蛋白作用網(wǎng)絡，并繪制網(wǎng)絡圖。為篩選核心蛋白，將生成的蛋白相互作用條目Node1、Node2以及Combined-scorce導入到Cytoscape3.8.0，選擇APP條目下的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲分析。

1.4 差異表達基因的GO、KEGG富集分析

基于R軟件對1.2中獲取到的EOA差異表達基因的細胞成分、分子功能、生物學過程以及信號通路進行富集分析。在Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）網(wǎng)站安裝“Biocmanager”“org.Hs.eg.db”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterPr ofiler”“enrichplot”“Pathview”等程輯包。選擇物種為人（Homo spanies），設定P＜0.05，對 EOA 差異表達基因及l(fā)ogFC值進行富集分析，輸出富集結果并繪制圈圖。

1.5 獲取免疫浸潤矩陣

將GEO數(shù)據(jù)庫獲取到的基因芯片數(shù)據(jù)分組，登錄CIBERSORT數(shù)據(jù)庫獲取免疫細胞基因表達矩陣[6]。通過反卷積算法進行免疫浸潤分析，包括T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞等22中免疫細胞的矩陣，為獲取數(shù)據(jù)的準確性，設定P＜0.05，循環(huán)次數(shù)為100次。

1.6 免疫矩陣的主成成分分析

為分析AE患者與健康對照組間的差異，通過R語言對對1.5中獲取的免疫浸潤矩陣進行主成成分分析，借助“ggplot2”程輯包繪制PCA圖。

1.7 免疫浸潤分析

通過R語言對納入樣本的UC與正常對照組的組織樣本進行22種免疫細胞浸潤分析，獲取AE與健康對照組免疫細胞差異情況及特征，繪制相關性熱圖及小提琴圖。

1.8 AE免疫細胞浸潤潛在中藥預測

登錄Coreminemedical數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com），將1.3中獲得關鍵靶基因及1.4中獲得到的免疫相關生物學過程輸入Coreminemedical，設置P＜0.05。繪制網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 EOA差異表達基因結果

通過對GEO數(shù)據(jù)庫AE相關基因探針篩選，確定GSE63741基因芯片數(shù)據(jù)及GPL19471平臺文件作為本次研究對象。包括29名AE患者及30名健康對照組，共59個樣本的基因表達數(shù)據(jù)，獲得差異表達基因92個，其中49個上調(diào)基因，43個下調(diào)基因。選取上調(diào)及下調(diào)排名前20的差異基因繪制差異表達偏差圖和熱圖，見圖1A，圖1B，選取所有差異表達基因繪制火山圖，見圖1C。

圖1 差異表達基因的偏差圖熱圖及火山圖

2.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡構建及關鍵蛋白篩選

在STRING網(wǎng)站構建差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡，去除游離基因后結果見圖2A。為篩選網(wǎng)絡關鍵蛋白，將得到的string_interactions.txt文件導入到Cytoscape3.8.0，選擇CytoNCA對網(wǎng)絡進行拓撲分析。篩選參數(shù)：介度中心性（Betweenness Centrality），緊 密 中 心 性（Closeness Centrality），節(jié) 度 中 心 性（Degree Centrality），特 征 向量（Eigenvector Centrality），局 部 連 通 性（Local Average Connectivity-based method LAC），網(wǎng)絡關鍵蛋白為 CCL2、CCND1、S100A7，見圖2B。

圖2 差異基因PPI網(wǎng)絡圖及網(wǎng)絡關鍵蛋白

2.3 GO及KEGG富集分析

通過R語言對AE差異表達基因進行GO功能及KEGG通路富集分析，GO共富集到137個生物學過程（BP）條目，免疫相關生物學過程涉及到角質(zhì)細胞分化、皮膚角化等免疫相關途徑。KEGG通路富集到了6個通路結果，主要涉及金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號通路、IL17信號通路。根據(jù)富集結果，各自選取排名前5的GO條目及KEGG通路，根據(jù)logFC值，繪制圈圖，見圖3A，3B。

圖3 差異基因富集結果圈圖

2.4 EOA的免疫分布特征

在CIBERSORT數(shù)據(jù)庫中獲得22中免疫細胞矩陣，通過反卷積法以P＜0.05，循環(huán)100次，共獲得59個可信樣本的免疫細胞浸潤矩陣，對免疫細胞浸潤矩陣的組成成分分析，結果顯示AE組與健康組見差異區(qū)分明顯，見圖4A。圖4B顯示了免疫細胞浸潤比例，左側30個為健康組織樣本，右側29個為AE組織樣本。結果顯示，單核細胞（Monocytes）在兩組間均呈現(xiàn)較高比例。靜息樹突狀細胞（Dendritic cells resting）、幼稚 CD4 T細胞（T cells CD4 naive）在AE組占比較高。記憶性B細胞（B cells memory）、活化NK細胞（NK cells activated）在正常組中占比較高。根據(jù)樣本中免疫細胞浸潤比例繪制熱圖，見圖4C。

圖4 AE的免疫分布特征

2.5 免疫浸潤差異分析

根據(jù)免疫細胞在不同組織間的差異表達量，以P＜0.05為標準對AE組及健康組的免疫浸潤差異進行可視化分析，繪制小提琴圖，見圖5，結果顯示，M1型巨噬細胞（Macrophages M1，P=0.01），靜息樹突狀細胞（Dendritic cells resting，P=0.021），活化的樹突狀細胞（Dendritic cells activated，P＜0.001），活化的肥大細胞（Mast cells activated，P＜0.001），在AE組織中表達明顯增加。記憶性 B 細胞（B cells memory，P=0.003），巨噬細胞M2（Macrophages M2，P＜0.001），在正常組織中表達明顯增加。

圖5 AE的免疫浸潤差異分析小提琴圖

2.6 免疫細胞相關性分析

為探究免疫細胞間是否相關，對22中免疫細胞進行相關性分析，見圖6，顏色越紅則正相關性越強，顏色越藍則負相關性越強。幼稚CD4 T細 胞（T cells CD4 naive） 與 CD8 T細 胞（T cells CD8）有較強的正相關（r=0.68），巨噬細胞M0（Macrophages M0）與單核細胞（Monocytes）有較強的正相關（r=0.39）。γT細胞（T cells gamma delta）與活化的NK細胞（NK cells activated）有較強的負相關（r=-0.39），幼稚B細胞（B cells naive）與漿細胞（Plasma cells）有較強的負相關（r=-0.35）。

圖6 EOA的免疫細胞相關性分析

2.7 AE免疫細胞浸潤中藥預測結果

通過Coreminemedical數(shù)據(jù)庫預測UC免疫細胞浸潤有效中藥，設置P＜0.05，結果顯示，黃柏、苦參、蒼術、連翹、梔子、生地黃、龍膽與AE免疫細胞浸潤關聯(lián)度較高，提示其可能作為治療AE的有效中藥通過調(diào)節(jié)免疫細胞及功能起到治療EOA的作用，見圖7。

圖7 EOA免疫浸潤中藥預測網(wǎng)絡圖

3 討論

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，高蛋白高熱量飲食的攝入，AE的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢[7]。肛門皮膚瘙癢、滲液等臨床癥狀典型，雖不危及生命，但病情遷延難愈，反復發(fā)作，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量[8]。AE的發(fā)病與局部炎性因子釋放，免疫變態(tài)反應密切相關。因此尋找新的免疫治療靶點對AE的診療具有重要意義。本次研究通過對AE差異表達基因的PPI網(wǎng)絡構建與富集分析，篩選出CCL2、CCND1、S100A7為關鍵靶基因。CCL2是由細胞分泌的信號蛋白，具有誘導免疫細胞定向趨化的功能[9]，研究表明[10]，CCL2可以在Fas配體的作用下活化，導致濕疹表皮角質(zhì)化，加劇炎癥反應。CCND1為特異性周期蛋白，與細胞增殖密切相關[11]，在AE發(fā)病時，大量免疫細胞在發(fā)病部位浸潤增殖，CCND1介導免疫變態(tài)反應。S100A7是一種促炎蛋白，又被稱為銀屑素，最早發(fā)現(xiàn)于銀屑病患者血清中，與病情程度呈正相關[12]，研究表明[13]，S100A7的水平與銀屑病皮膚組織IL4、IL22、IL26表達正相關。目前有關S100A7與AE的相關性尚未有報道，這可能是AE的新的治療靶點。本次研究篩選到的關鍵靶基因在AE的診療上提供新的治療靶點與研究方向。

對AE差異表達基因的GO、KEGG富集結果顯示，涉及角質(zhì)細胞分化、皮膚角化等免疫相關途徑；與金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號通路、IL17信號通路密切相關。固有免疫功能的正常是避免濕疹發(fā)病的關鍵，GO富集到的角質(zhì)細胞分化，皮膚角化等生物學過程是AE發(fā)病時主要的病理變化，皮膚角化指的是AE發(fā)病時肛周皮膚的炎性退行性病變[14]，角質(zhì)細胞是構成表皮層的主要細胞成分，角質(zhì)細胞分化是皮膚角化的基礎[15]，抑制肛周皮膚的角質(zhì)化對治療AE有重要意義。由于肛門周圍皮膚位置的特殊性，致使其容易受到各種致病菌的感染。研究表明[16]，濕疹患者皮損部位的金黃色葡萄球菌密度要顯著高于非皮損部位，金黃色葡萄球菌感染是導致AE炎性病變的重要原因[17]。激素水平與濕疹的發(fā)病密切相關，研究表明[18]，女性患者濕疹的發(fā)病率顯著高于常人，雌激素的周期性波動會導致皮膚免疫及屏障功能降低，加重炎癥性皮膚病的病情程度。IL-17是Th17細胞的主要效應因子[19]，由活化的T細胞產(chǎn)生[20]，可刺激上皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子導致皮膚炎癥反應[21]。GO及KEGG富集結果綜合顯示了AE的發(fā)病過程是由多種免疫功能及激素水平失調(diào)導致炎性因子的高表達的結果。

為探究免疫細胞浸潤在AE發(fā)病中的作用，采用反卷積法以P＜0.05為標準進行免疫細胞浸潤分析，M1型巨噬細胞，靜息樹突狀細胞，活化的樹突狀細胞等在AE組織中表達明顯增加。巨噬細胞位于胃腸道粘膜固有層中,受NF-κB調(diào)節(jié)，參與Th、Treg介導的免疫反應[22]。單核細胞受不同刺激后活化為M0、M1型或M2型巨噬細胞，M1型分泌促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和趨化因子CXCL8、CXCL10，促進炎癥反應[23]，M2型分泌抑炎因子IL-10及TGF-β，抑制炎癥反應[24]。樹突狀細胞是起哨兵作用的抗原提呈細胞[25]，主要位于表皮固有層，受抗原刺激激活后，其樹突狀突起伸入上皮，交錯進入上皮細胞，粘附抗原和細菌，并釋放IL-2，誘導單純T細胞向Th1細胞分化，激活適應性免疫應答[26]。本次研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞M1在AE皮損組織中高表達，巨噬細胞M2型在正常組中高表達，表明本次免疫細胞浸潤預測的AE免疫分析具有一定的參考意義。

AE屬中醫(yī)學“濕疹”的范疇，濕熱是造成AE發(fā)病的重要原因，或因素體脾虛，濕邪內(nèi)生；或因肆食肥甘厚味，損傷脾胃，內(nèi)生濕熱，濕熱下注肛門發(fā)病；或因久居濕熱之地，外感六淫侵襲機體，濕熱之邪困遏肌表，發(fā)為AE。中醫(yī)藥在AE的診療上可以辨證論治，清熱利濕，祛風止癢，療效穩(wěn)定。本次研究將獲得到的AE關鍵靶基因及免疫生物學過程通過Coremine數(shù)據(jù)庫對潛在治療AE免疫浸潤相關的中藥進行預測，結果顯示，黃柏、苦參、蒼術、連翹、梔子、生地黃、龍膽出現(xiàn)頻次較大，黃柏、苦參可清熱利濕止癢，連翹、梔子清熱解毒，蒼術健脾燥濕，生地養(yǎng)陰生津，龍膽清熱瀉火。本次研究預測的中藥在臨床中皆在AE的治療上有著廣泛的應用，如復方黃柏液，苦參膠囊等，在臨床中治療AE取得了顯著的療效。

綜上所述，本次研究基于生物信息學的分析方法對AE的差異基因進行富集及免疫細胞浸潤機制分析，預測了潛在治療中藥，對后續(xù)的研究及中藥臨床應用具有一定的指導意義。