鐘敏，岳蕓蕓*，尚靖,2,3,4*

（1.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學(xué)江蘇省中藥評價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京211198；3.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；4.國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

0 引言

黑素細(xì)胞中的黑素小體是黑色素合成和儲(chǔ)存的細(xì)胞型特異性細(xì)胞器，黑素在黑素小體中合成后，黑素小體被進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞，最終隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的分化而被降解。成熟黑素小體的功能決定了人類皮膚的顏色。深色皮膚的黑素小體比白色皮膚的黑素小體更大，色素更稠密[1]，并且更頻繁地轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞[2]。色素紊亂性疾病的發(fā)生和黑素小體發(fā)育、轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，研究證明黑素小體的功能異常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的色素性疾病的發(fā)生。

1 黑素小體的來源及分類

黑素合成是黑素細(xì)胞最重要的生物學(xué)功能，黑素小體作為黑素細(xì)胞特有的細(xì)胞器是合成和貯存黑素的主要場所，也是一種溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器[3]。它起源于核周的多囊泡小體，隨著囊泡的不斷分化、成熟，多種黑素合成相關(guān)蛋白進(jìn)入囊泡，使得前黑素小體具有了黑素合成能力[4]。根據(jù)所包含的黑色素不同，分為真黑素小體和褐黑素小體。真黑素小體呈橢圓形，往往比褐黑素小體大，有明顯的蛋白質(zhì)樣纖維基質(zhì)，它是真黑色素在黑素小體成熟早期整齊有序排列所必需的；而褐黑素小體是呈圓形，色素表面粗糙，所包含的蛋白多于真黑素小體，且為無定型的蛋白纖維基質(zhì)[5-6]。早期的真黑素小體可以在透射電鏡下觀察到完整的黑色素纖維堆積產(chǎn)生的條紋，而褐黑素小體在鏡下呈不完全黑化斑點(diǎn)狀的條紋[7]。

2 黑素小體的發(fā)生

2.1 黑素小體成熟過程

黑素小體經(jīng)過四個(gè)階段成熟并產(chǎn)生黑色素（圖1）。第Ⅰ階段為前黑素小體階段，這一階段含有很多腔內(nèi)囊泡 (intraluminal vesicles，ILVs)，PMEL(也稱為Pmel17或gp100)一種膜蛋白在此被蛋白水解，從而使腔內(nèi)囊泡伸出不規(guī)則纖維[8]，此階段不含任何色素且細(xì)胞器呈球狀。第Ⅱ階段，黑素小體伴隨著腔內(nèi)囊泡延長，外部形成纖維狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部產(chǎn)生纖維基質(zhì)，這一階段有黑素生成酶從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)或早期內(nèi)體系統(tǒng)運(yùn)輸來[9]；第Ⅲ階段，合成的黑素存儲(chǔ)在PMEL有序纖維上，產(chǎn)生第三階段黑素小體特有的厚紋[10]；第Ⅳ階段，黑色素繼續(xù)在淀粉樣纖維上合成和沉積直到充滿內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)，形成完全著色的成熟黑素小體[11]。

2.2 黑素小體的生物發(fā)生及功能行使

2.2.1 第一階段

第Ⅰ階段為前黑素小體階段，這一階段含有很多腔內(nèi)囊泡 (intraluminal vesicles，ILVs)，PMEL(也稱為PMEL17或GP100)是一種膜蛋白，它被轉(zhuǎn)運(yùn)到未成熟的黑素小體是黑素小體生物發(fā)生的早期步驟，但其實(shí)現(xiàn)機(jī)制尚不完全清楚。PMEL被帶入I期未成熟黑素小體的管腔，并被蛋白水解，這一過程是腔內(nèi)囊泡伸出不規(guī)則纖維所必需的[12]。許多蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維與神經(jīng)退行性疾病(包括阿爾茨海默病和帕金森氏病)等有關(guān)。而PMEL纖維，由于一種名為ApoE[13]的脂蛋白的存在，表現(xiàn)為生理性、非致病性的淀粉樣纖維[14]，并且表現(xiàn)出有序的纖維化。這種脂蛋白集中在ILV的表面，并覆蓋PMEL的片段，推測ApoE通過ILV來引導(dǎo)PMEL有組織的纖維化[15]，此階段不含任何色素且細(xì)胞器呈球狀。

2.2.2 第二階段

第Ⅱ階段，黑素小體伴隨著囊泡延長，在Pmel17的促進(jìn)下，黑素小體外部形成纖維狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部產(chǎn)生纖維基質(zhì)[16]。這一階段有酪氨酸酶等黑素小體蛋白從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)或早期內(nèi)體系統(tǒng)運(yùn)輸來[17]。據(jù)報(bào)道，參與黑素小體蛋白運(yùn)輸主要有兩種途徑：一種是溶酶體相關(guān)細(xì)胞器復(fù)合體(BLOC-1)依賴途徑，另一種是BLOC-1非依賴/AP-3依賴途徑（圖1）。BLOC-1是由8個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體，最初定位于早期內(nèi)體，具有彎曲結(jié)構(gòu)[18],主要調(diào)節(jié)某些黑素小體蛋白（包括ATP7A和Tyrp1）從早期核內(nèi)體到黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)[19-20]。BLOC-2是由三個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體，也定位于早期內(nèi)體，研究推測它在BLOC-1下游發(fā)揮運(yùn)輸載體的作用，并且能夠促進(jìn)含有黑素小體蛋白的循環(huán)核內(nèi)體和成熟黑素小體之間的融合[21]。APs是四聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠介導(dǎo)蛋白進(jìn)入囊泡后的分選。目前已有五種APs被報(bào)道，其中AP-3依賴途徑主要用于酪氨酸酶向黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。

圖1 調(diào)節(jié)黑素小體生物發(fā)生的內(nèi)體和黑素小體運(yùn)輸系統(tǒng)示意圖[31]

2.2.3 第三階段

這一階段，BLOC-3作為Rab32/38特定的鳥嘌呤核苷酸交換因子，能夠使Rab32/Rab38與GTP結(jié)合從而被激活[23]。研究發(fā)現(xiàn)BLOC-3基因表達(dá)缺陷會(huì)導(dǎo)致無法招募Rab32/Rab38-錨蛋白重復(fù)蛋白(ankyrin repeat protein，Varp)，并且使包括酪氨酸酶、Tyrp1和Dct在內(nèi)的黑素生成酶的運(yùn)輸受阻[24-27]。Rab32/Rab38-Varp復(fù)合體也被認(rèn)為能調(diào)節(jié)酪氨酸酶和Tyrp1從早期內(nèi)體到黑素小體的順行運(yùn)輸[28]。在黑素小體第Ⅲ階段，黑素小體膜上a-促黑素皮質(zhì)激素(a-MSH)與黑皮質(zhì)素受體1(MC1R)結(jié)合后，通過上調(diào)cAMP水平，激活真黑素的合成， 這一過程在各種黑素生成酶催化下將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴醌類，并最終生成真黑素[29]。若Agouti基因編碼的刺豚鼠信號蛋白高表達(dá)，就會(huì)與a-MSH競爭性結(jié)合MC1R，從而下調(diào)cAMP水平，激活褐黑素的合成[30]。最終黑素合成并存儲(chǔ)在淀粉樣纖維上，并使其變黑增厚。

2.2.4 第四階段

第四階段Rab32/Rab38-Varp復(fù)合體通過與肌球蛋白Ⅵ合作，能夠從成熟的黑素小體中回收膜囊泡蛋白7 (VAMP7)[26]?；厥盏腣AMP7被認(rèn)為會(huì)返回到早期的內(nèi)體中，進(jìn)行下一輪的黑素生成酶運(yùn)輸。在這一階段黑色素繼續(xù)在淀粉樣纖維上合成和沉積直到充滿內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)，形成完全著色的成熟黑素小體[11]。

3 黑素小體的運(yùn)輸與轉(zhuǎn)運(yùn)

3.1 黑素小體在黑素細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸

20世紀(jì)70年代的開創(chuàng)性工作表明，在非哺乳動(dòng)物黑素細(xì)胞中，微絲[32]和微管[33]負(fù)責(zé)將黑素小體從細(xì)胞體向外運(yùn)輸?shù)綐渫患舛?即離心)，并從樹突的遠(yuǎn)端返回細(xì)胞體(向心)。非洲爪蟾的黑素細(xì)胞表達(dá)Kinesin-Ⅱ和dynein，前者是一種微管相關(guān)的負(fù)責(zé)正端定向運(yùn)動(dòng)的蛋白，后者是一種微管相關(guān)的負(fù)端定向運(yùn)動(dòng)蛋白[34]。在低等脊椎動(dòng)物中，黑素小體沿著樹突的雙向移動(dòng)更快。這種黑素小體在細(xì)胞內(nèi)的選擇性移位可以使其在細(xì)胞體內(nèi)聚集，也可以分散在樹突上，這種特性與皮膚顏色的深淺相關(guān)，能夠很快地適應(yīng)環(huán)境。相反，哺乳動(dòng)物黑素細(xì)胞中黑素體沿樹突的運(yùn)動(dòng)不是通過雙向運(yùn)動(dòng)的方法進(jìn)行的。

在哺乳動(dòng)物皮膚黑素細(xì)胞中，黑素小體在核周區(qū)域成熟，并與驅(qū)動(dòng)蛋白(一種正端導(dǎo)向的微管馬達(dá))結(jié)合。黑素小體以離心方式沿著微管向細(xì)胞外圍移動(dòng)。一旦黑素小體到達(dá)細(xì)胞的外圍，它就會(huì)從微管中分離出來，并通過分子馬達(dá)肌球蛋白Ⅴa與臨近的肌動(dòng)蛋白細(xì)絲結(jié)合在一起，在其上經(jīng)歷局部的短程運(yùn)動(dòng)(圖2)[35]。這一步驟將黑素小體均勻分布在細(xì)胞的外圍，從那里它們可以轉(zhuǎn)移到相鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞。

圖2 表皮黑素細(xì)胞中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)模型[36]

那么哺乳動(dòng)物中肌球蛋白Ⅴa又是如何與黑素小體連接的呢？目前研究發(fā)現(xiàn)主要有Rab27a、leaden一起參與了黑素小體的運(yùn)輸,猜測可能存在2種模型機(jī)制:在模型1中，Rab27a的膜結(jié)合需要leaden，Rab27a進(jìn)而通過其尾巴招募肌球蛋白Ⅴa。在模型2中，Rab27a首先與成熟的黑素小體結(jié)合，然后招募leaden，leaden又將肌球蛋白Ⅴa招募到黑素小體。在這兩種模型中，肌球蛋白Ⅴa的頭部結(jié)構(gòu)域與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的結(jié)合將黑素小體與外周肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來(圖3)[36]。

圖3 黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制模型[36]

3.2 黑素小體從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞

3.2.1 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

黑素小體從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞是唯一已知的細(xì)胞器在細(xì)胞間移動(dòng)的例子。近年來提出了4種黑素小體在黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制(圖4)[38]。

①細(xì)胞吞噬模型(圖4A)：Singh等人[39]通過檢測和跟蹤正在發(fā)育的黑素小體表面的蛋白gp100得到證實(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞可以吞噬黑素細(xì)胞中富含黑素小體的樹突尖端。②膜融合模型(圖4B)：在人類皮膚中，Scott等人[40]研究發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞樹突在肌球蛋白Ⅴa的存在下，能夠形成絲狀偽足，隨后有一列單獨(dú)的黑素小體沿著絲狀偽足移動(dòng)，并穿過這個(gè)快速形成的通道進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞。③脫落吞噬模型(圖4C)：Wu等人[41]研究報(bào)導(dǎo)黑素細(xì)胞將黑素小體包裝成珠狀，然后將其轉(zhuǎn)移在黑素細(xì)胞外圍，角質(zhì)形成細(xì)胞隨后捕獲并吞噬這些黑素小球。④胞外分泌內(nèi)吞模型(圖4D)：黑素細(xì)胞通過胞外分泌作用將不含黑素小體膜的黑色素內(nèi)核釋放到黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的細(xì)胞外間隙。隨后，黑色素內(nèi)核通過吞噬作用被角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)化，并在核周區(qū)域成簇存在[38]。目前多項(xiàng)研究支持黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過機(jī)制3和機(jī)制4完成。

3.2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白

最近有研究表明，質(zhì)膜糖蛋白、凝集素可能調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間黑素小體的識別、相互作用以及物質(zhì)轉(zhuǎn)移。Kieda等人發(fā)現(xiàn)各種凝集素或新糖蛋白可以抑制人黑色素瘤細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌來源的角質(zhì)形成細(xì)胞之間的黑素小體轉(zhuǎn)移[42-43]。作者通過一種體外模型，用熒光染料(羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯)預(yù)先標(biāo)記黑素細(xì)胞，隨后與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)，通過共聚焦顯微鏡監(jiān)測熒光的轉(zhuǎn)移并通過流式細(xì)胞術(shù)定量證實(shí)黑素小體的轉(zhuǎn)移。利用該模型系統(tǒng)，證實(shí)了Kieda等人的觀察結(jié)果，即各種凝集素和新糖蛋白可以抑制黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。此外，也有研究證明了煙酰胺也能抑制黑素小體的轉(zhuǎn)移[44]。

蛋白激酶受體2（PAR-2）在角質(zhì)形成細(xì)胞吞噬黑素小體的過程中也非常重要。它是質(zhì)膜上的一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，被絲氨酸蛋白酶在細(xì)胞外切割發(fā)生自激活[45]。Seiberg等人通過一系列實(shí)驗(yàn)證明，PAR-2受體位于角質(zhì)形成細(xì)胞的膜上，通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞對分離的黑素小體[46]或微球[47]的吞噬活性參與黑素小體的轉(zhuǎn)移從而調(diào)節(jié)色素顆粒的吞噬量。

3.3 黑素小體在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的分布

黑素小體在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的分布根據(jù)膚色的不同而不同[48-49]。在深色皮膚的個(gè)體中，黑素小體直徑約0.8mm，以單個(gè)細(xì)胞器的形式存在于角質(zhì)形成細(xì)胞的胞質(zhì)中。相反，在淺色皮膚的個(gè)體中，黑素小體直徑明顯小于0.8mm，并聚集成由4-8個(gè)細(xì)胞器組成的膜結(jié)合簇。目前還不確定這些不同的分布模式是由轉(zhuǎn)移的黑素小體內(nèi)的因素決定的，還是由于受體角質(zhì)形成細(xì)胞固有的性質(zhì)決定。在最近的一項(xiàng)研究中，利用不同膚色的幾組黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，評估了體外皮膚重建模型角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素小體的分布，研究人員得出結(jié)論，受體黑素小體的分布模式由供體黑素細(xì)胞的類型決定[50]。相反，最近在黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)中的實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)移的黑素小體的分布模式受受體角質(zhì)形成細(xì)胞來源的皮膚類型調(diào)節(jié)[51]。然而，這兩種實(shí)驗(yàn)方法都相對主觀，因此黑素小體在皮膚中的分布調(diào)節(jié)問題仍然沒有解決。

4 黑素小體的降解

隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化，受體黑素小體也會(huì)發(fā)生降解。最終，除極少數(shù)出現(xiàn)在顏色非常深的皮膚情況下，當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞變成角質(zhì)細(xì)胞后，黑素小體結(jié)構(gòu)將不復(fù)存在[52]。

黑素小體的解體是一個(gè)漸進(jìn)的過程。輕度解體的色素顆粒在邊緣出現(xiàn)磨損，附近有黑色素碎片。隨著解體程度的加深，黑素小體出現(xiàn)解體，密度降低。在晚期，黑素小體的基質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變得明顯并與黑色素碎片混合[53]。但目前研究發(fā)現(xiàn)，除了黑素小體成分可被水解降解，黑素小體中的黑色素部分很難被分解。日本科學(xué)家在用溶酶體水解酶處理放射性標(biāo)記的黑素小體后，注意到黑素小體的脂類快速降解，蛋白質(zhì)成分緩慢降解，但黑色素部分仍然很穩(wěn)定[54-56]。有研究表明黑素小體的黑色素部分能在120℃抵抗強(qiáng)鹽酸 72小時(shí)[57-58]。在組織學(xué)中，黑色素主要是通過用氧化劑如高錳酸鹽[59]或過氧化氫[60]進(jìn)行色素漂白來去除的。用過氧化氫高溫加熱會(huì)使黑色素部分分解，并產(chǎn)生強(qiáng)熒光，可用于黑色素定量[61-62]。但產(chǎn)生的熒光素的性質(zhì)尚不清楚，目前有人提出熒光表明黑色素聚合物中的結(jié)構(gòu)發(fā)生損壞[63]。

5 調(diào)節(jié)黑素小體形態(tài)和內(nèi)環(huán)境的相關(guān)基因

除了黑素小體結(jié)構(gòu)蛋白和黑素生成酶外，黑素合成還需要某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(或離子通道)來優(yōu)化黑素小體的管腔pH和其他離子(如Cu2+和Zn2+)的濃度。最近，一些定位于黑素小體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能已被揭示。

5.1 OCA2

OCA2是眼皮膚白化病的致病基因產(chǎn)物，在黑色素細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞黑色素生物合成中有著重要作用[64-65]。研究發(fā)現(xiàn)OCA2蛋白有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，相當(dāng)于Na+/H+離子泵，OCA2通過泵出H+來維持黑素小體腔內(nèi)PH，使酪氨酸酶發(fā)揮最佳活性來催化酪氨酸產(chǎn)生黑色素[66]。OCA2表達(dá)量降低可使黑素小體內(nèi)PH降低，從而導(dǎo)致酪氨酸酶活性減低，黑色素合成減少[67]。S.Park等[68]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，下調(diào)OCA2的表達(dá)，將導(dǎo)致黑素小體形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及黑色素含量顯著減少。

5.2 P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，在pink-eyed dilute小鼠和人類眼皮膚白化病2型患者中缺乏。P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變影響了黑素小體的酸性、形態(tài)和蛋白定位[69-71]。基于P蛋白與某些細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源性，Brilliant提出P蛋白通過轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子來抵消未成熟黑素小體中的高質(zhì)子含量[72]。通過改變管腔內(nèi)的酸堿度或膜電位，P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺乏可能影響轉(zhuǎn)運(yùn)小泡與靶前黑素小體融合的能力，導(dǎo)致小泡聚集或錯(cuò)誤靶向溶酶體。

5.3 TPC2

兩孔通道2(Two-pore channel 2，TPC2)也與人類色素沉著疾病有關(guān)。據(jù)推測，TPC2可以使Na+、Ca2+等陽離子穿過黑素小體膜。已有研究表明抑制TPC2可提高黑素小體的管腔pH值來促進(jìn)色素沉著。雖然TPC2是通過轉(zhuǎn)運(yùn)哪種陽離子來對黑素小體的酸化起作用尚不清楚，但已提出通過Na+或Ca2+外流介導(dǎo)的黑素小體膜電位的增加來調(diào)節(jié)V-ATPase酸化黑素小體的功能[73-74]。

6 總結(jié)

黑素小體是一種特殊的含有黑色素的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。它在高度樹突化的黑素細(xì)胞內(nèi)發(fā)育，從無色素前體開始，到黑色素包被膜包住的階段結(jié)束。在表皮黑素細(xì)胞中，黑素小體被運(yùn)輸?shù)綐渫坏捻敹耍S后轉(zhuǎn)移到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞（黑素小體轉(zhuǎn)移到大約36個(gè)相鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞[75]），角質(zhì)形成細(xì)胞在基底層保留黑色素，并在黑色素移動(dòng)到皮膚表面分化時(shí)將其降解。黑素小體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定依賴于OCA2、P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TPC2等對腔內(nèi)PH的調(diào)控，酸性環(huán)境的破壞將會(huì)影響酪氨酸酶活性，直接導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生受阻。所以以黑素小體為核心黑素小體的形態(tài)發(fā)生和成熟，黑素小體蛋白的正常轉(zhuǎn)入，黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)以及其穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，都是黑色素合成的基礎(chǔ)條件。因此對黑素小體的正確認(rèn)識將有助于對色素性疾病的治療提供重要的研究思路和理論指導(dǎo)。