蔣晶晶 趙嬌嬌 陳愛(ài)昌 曹素芳 李繼平 李青青 徐美蓉 漆永紅,*

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3 定西市植保植檢站，甘肅 定西 743000；4 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070；5甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)植物，是多年生草本植物。從藥用植物學(xué)角度，黃芩分為根、莖葉、種子和種殼四個(gè)部位，主要有效成分為黃酮類化合物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。黃芩廣泛分布于溫帶和熱帶山脈地區(qū)，遍及歐洲、北美和東亞[1]。在我國(guó)，黃芩主產(chǎn)于甘肅、陜西、山西等省[2]，其中甘肅省定西市作為道地黃芩主產(chǎn)區(qū)之一，生產(chǎn)的黃芩具有產(chǎn)量高、品質(zhì)佳、功效好等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，由于市場(chǎng)需求量的增加，黃芩種植面積逐步擴(kuò)大，生產(chǎn)上連年種植，導(dǎo)致黃芩病害出現(xiàn)明顯加重的趨勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的黃芩病害和其病原種類為：由鐮孢屬(Fusariumsp.)引起的根腐病[3]、北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynehapla)引起的根結(jié)線蟲(chóng)病、齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的葉枯病、白粉菌屬(Erysiphesp.)引起的白粉病[4]、立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn.)引起的莖基腐病和灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的灰霉病[5]等，但引起黃芩葉斑病的病原菌相關(guān)研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

鏈格孢屬(Alternariasp.)是一種極為常見(jiàn)的病原菌，具有適應(yīng)強(qiáng)、寄主范圍廣、為害嚴(yán)重等特點(diǎn)[6]。全世界已描述的鏈格孢種有約500個(gè)，其中95%以上寄生在植物上，可引起萵筍[7]、櫻桃[8]、枸杞[9]、甜葉菊[10]和二月蘭[11]等多種作物葉斑病。甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所經(jīng)濟(jì)作物病害研究室于2020年8月在甘肅省隴西縣對(duì)黃芩病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉斑病的病田率達(dá)50%，病株率達(dá)20%～35%。田間大面積黃芩葉片上普遍出現(xiàn)不規(guī)則的黑褐色病斑，擴(kuò)展至整個(gè)葉面，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，枯萎；植株光合作用嚴(yán)重受阻，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響黃芩的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)采用組織分離法對(duì)黃芩葉斑病的病原菌進(jìn)行分離，柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，旨在明確該病害的病原菌種類，為科學(xué)診斷和研究病害發(fā)生規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，室內(nèi)測(cè)定了4種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力，以期篩選出高效、低毒、低殘留的藥劑，為該病害的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 于2020年8月在甘肅省隴西縣黃芩主產(chǎn)區(qū)福星鎮(zhèn)、首陽(yáng)鎮(zhèn)、菜子鎮(zhèn)和文峰鎮(zhèn)進(jìn)行樣品采集，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)選取3～5塊田進(jìn)行病葉調(diào)查和采集，共獲得38份病葉，及時(shí)帶回甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所經(jīng)濟(jì)作物病害研究室進(jìn)行病原菌分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g；馬鈴薯胡蘿卜瓊脂(potato carrot agar，PCA)培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g；玉米粉(corn meal agar，CMA)培養(yǎng)基：玉米粉300 g、瓊脂14 g；蔗糖碳酸鈣(sucrose CaCO3agar，SA)培養(yǎng)基：蔗糖20 g、碳酸鈣30 g。以上培養(yǎng)基均加入瓊脂14 g、蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌備用。

1.1.3 供試材料 供試菌株：茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)。

供試藥劑：0.3%丁子香酚可溶液劑(保定市亞達(dá)益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司)、0.4%蛇床子素可溶液劑(楊凌馥稷生物科技有限公司)、98.5%腐霉利(Procymidone)原藥(江西禾益化工有限公司)、97%咯菌腈(Fludioxonil)原藥(河北冠龍農(nóng)化有限公司)。

1.2 病原菌分離和純化

采用常規(guī)組織分離法[12-13]進(jìn)行病原菌分離。選擇具有典型葉斑病癥狀的葉片，剪病健交界處5 mm×5 mm的病組織，用1%次氯酸鈉消毒40 s，75%酒精消毒40 s，無(wú)菌水沖洗2次后置于滅菌濾紙上晾干。將病組織塊接種于PDA培養(yǎng)基上，每皿4塊，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4 d，待長(zhǎng)出菌落后挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化，并轉(zhuǎn)接至PDA斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)鑒定

1.3.1 純培養(yǎng)特征 用滅菌打孔器在菌落邊緣打出直徑5 mm的菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基的中央，每個(gè)菌株重復(fù)3次，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后觀察記錄菌落形態(tài)和顏色等特征。

1.3.2 分生孢子形態(tài)觀察和鑒定 將菌餅分別接種至PDA、PCA、CMA和SA培養(yǎng)基中央，18℃恒溫黑暗培養(yǎng)10 d后觀察產(chǎn)孢情況。將產(chǎn)生的分生孢子用無(wú)菌水沖洗，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)鏈格孢的分生孢子大小、顏色、產(chǎn)生的橫隔、縱隔數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，參考張?zhí)煊頪14]和Simmons等[15]對(duì)鏈格孢屬種的描述來(lái)鑒定病原菌的種類。

1.3.3 產(chǎn)孢表型觀察 將濾紙剪成比載玻片小的長(zhǎng)方形，并在濾紙中間剪約1 cm×2 cm的孔，將其置于載玻片上，放入培養(yǎng)皿內(nèi)濕熱滅菌后備用。從菌落邊緣取適量菌絲和孢子均勻涂抹在小孔一側(cè)，加適量無(wú)菌水將濾紙浸濕，后置于25℃生化培養(yǎng)箱，保濕并在12 h光照/12 h 黑暗交替下培養(yǎng)5～9 d后在光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.4 病原菌基因組DNA提取及多基因分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后收集菌絲，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)法[16]提取菌株基因組DNA。將提取的DNA用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)[17]、過(guò)敏原基因(Alta1)[18]、質(zhì)膜腺苷三磷酸基因(ATPase)[19]、組蛋白基因(His3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，72℃延伸45 s，72℃補(bǔ)充延伸5 min，退火溫度ITS、Alta1、ATPase、His3分別為54、57、59、66℃，反應(yīng)30 s，共30個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR Master Mix 12.5 μL，DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。

制備1.2%瓊脂糖凝膠，120 V電泳30 min，0.5 mg·L-1EB溶液中染色10 min，置于Gel.Doc 2000型凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行拍照保存。將具特異性條帶PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，所測(cè)序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知核酸序列進(jìn)行相似性比較。采用DNAMAN 7軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，對(duì)序列進(jìn)行剪切拼接。使用遺傳進(jìn)化軟件MEGA 5.2，以鄰接法(neighbor-joining, NJ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用自展法(bootstrap method)進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次。

1.5 致病性測(cè)定

分別采用離體葉片菌餅接種法和孢子懸浮液活體噴霧接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。菌餅的制備：將試管斜面保存的菌種接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)4 d后，用5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔待用；孢子懸浮液的制備：將供試菌株接種在PCA平板上，18℃ 12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)11 d后，用滅菌水沖洗分生孢子，用血球計(jì)數(shù)器配置成濃度為1×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液待用。

1.5.1 菌餅有傷(針刺)和無(wú)傷接種法 選擇健康的黃芩葉片，先用75%酒精表面擦拭消毒，再用無(wú)菌水清洗2次，置于鋪有保濕紗布的盤(pán)內(nèi)待用。將供試菌株用打孔器切取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面朝下、貼于已消毒處理的黃芩葉片正面，每個(gè)葉片接種2個(gè)菌餅，重復(fù)3次，同時(shí)接種空白PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.5.2 孢子懸浮液噴霧接種法 使用小噴壺將添加0.5%吐溫-20的孢子懸浮液均勻噴霧接種到健康的盆栽黃芩葉片上，只噴霧0.5%吐溫-20的處理作為對(duì)照，之后正常溫室管理，每天觀察發(fā)病癥狀并照相。待接種后的黃芩葉片發(fā)病，將病原菌再次分離純化，觀察分離物與接種菌是否相同。

1.6 藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定[20]。將供試菌株活化培養(yǎng)5 d后，在接近菌落邊緣生長(zhǎng)一致的地方打取直徑為5 mm的菌餅，分別接入含不同濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基平板中央，每種殺菌劑均設(shè)5個(gè)不同的濃度梯度(表2)，以不含藥PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察，第8天采用十字交叉法量取菌落直徑，計(jì)算不同藥劑下菌絲生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)殺菌劑濃度的對(duì)數(shù)值(x)和抑菌生長(zhǎng)率的幾率值(y)建立回歸方程y=ax+b，采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算得到相關(guān)系數(shù)(R)和致死中濃度(EC50)。根據(jù)EC50分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病原菌的毒力。

表2 4種殺菌劑的濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩葉斑病田間發(fā)病癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃芩葉斑病始發(fā)于7月初，8月中下旬為害最嚴(yán)重。該病害的典型癥狀為：發(fā)病初期，葉片出現(xiàn)不規(guī)則的黑褐色小病斑(圖1-A)，隨著病情發(fā)展，病斑逐漸擴(kuò)大且相互連接，迅速自下而上蔓延，導(dǎo)致葉片發(fā)黃(圖1-B)，嚴(yán)重時(shí)枯萎，甚至脫落。

注：A: 發(fā)病初期；B: 發(fā)病后期；C：健康葉片。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果表明，分離菌株經(jīng)過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證，表明該菌對(duì)黃芩葉片均有致病性，其中代表性菌株HQ23-5和HQ13-5離體葉片接種第3天開(kāi)始發(fā)病，有傷和無(wú)傷接種均可發(fā)病(圖2-A～D)，發(fā)病率均達(dá)100%，兩種菌株致病力差異較小，而對(duì)照有傷和無(wú)傷接種均沒(méi)有發(fā)病(圖2-E、F)。孢子懸浮液接種6 d后葉片上出現(xiàn)零星病斑，發(fā)病初期病斑呈黑褐色小斑點(diǎn)(圖3-A)，后逐漸擴(kuò)大為不規(guī)則融合斑(圖3-B)，甚至出現(xiàn)幼芽枯死(圖3-C)，而對(duì)照葉片未發(fā)病(圖3-D)。將上述發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌再分離、純化培養(yǎng)，得到與原接種菌相同的病原菌，分離率為100%，表明HQ23-5和HQ13-5均為黃芩葉斑病的致病菌。

注：A：菌株HQ23-5有傷接種；B：菌株HQ23-5無(wú)傷接種；C：菌株HQ13-5有傷接種；D：菌株HQ13-5無(wú)傷接種；E：有傷接種CK；F：無(wú)傷接種CK。

注：A、B：葉片病斑變黑；C：芽枯死；D：對(duì)照。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)采集的38份病葉進(jìn)行分離培養(yǎng)、單孢純化后，共獲得20株分離物(表3)，分別編號(hào)為福星鎮(zhèn)HQ6-(5株)，首陽(yáng)鎮(zhèn)HQ9-(2株)，菜子鎮(zhèn)HQ13-(7株)，文峰鎮(zhèn)HQ23-(6株)。根據(jù)培養(yǎng)基基質(zhì)色、菌落正反面顏色、PDA培養(yǎng)基是否產(chǎn)孢和喙的形態(tài)以及菌株rDNA-ITS序列比對(duì)依據(jù)序列相似度大于99%的菌株為同一個(gè)種的原則進(jìn)行歸類[21]，將獲得的20株菌株分為兩大類，在每一類中隨機(jī)選取代表性病原菌HQ23-5和HQ13-5進(jìn)行研究。

表3 20株病原菌分離物的特征

菌株HQ23-5在PDA平板上培養(yǎng)初期時(shí)菌絲為白色，呈放射狀生長(zhǎng)，后逐漸變?yōu)榛液稚蚰G色絨狀，邊緣整齊，背面深橄欖綠或黑色，菌絲粗壯，6 d后菌落直徑達(dá)8.5 cm(圖4-A、B)。分生孢子梗淺褐色，多數(shù)單生于菌絲側(cè)面，偶有分支，直立或略彎曲，有分隔。分生孢子淺褐色或褐色，橢圓形、卵形、棍棒狀，少數(shù)倒梨形，有1～7個(gè)橫隔膜，0～5個(gè)豎或斜隔膜，分隔處有明顯縊縮現(xiàn)象，成熟的孢子有1～4個(gè)較粗而色深的主橫隔膜，呈黑褐色。分生孢子大小(24.3～58.5)μm×(3.4～5.3)μm，呈鏈狀生長(zhǎng)，不分支或少分支，每條鏈上有6～10個(gè)孢子。喙或假喙柱狀或錐狀，淺褐色，有隔膜，基部略微膨大，大小為(3.3～3.4)μm×(3.4～4.9)μm(圖4-C、D)。綜合以上結(jié)果，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可初步鑒定為細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)。

菌株HQ13-5在PDA平板上培養(yǎng)初期時(shí)菌落為灰白色，后逐漸變?yōu)榛疑?，氣生菌絲發(fā)達(dá)(圖4-E、F)，培養(yǎng)基基質(zhì)變黃褐色。此菌在PDA和CMA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢。PCA和SA上易產(chǎn)孢，11 d即可產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子常單生，倒棍棒形，青暗褐色，具7～13個(gè)橫隔膜及1～7個(gè)縱、斜隔膜，橫隔膜處縊縮，孢身大小為(60～136)μm×(16.5～28)μm。分生孢子頂端有細(xì)長(zhǎng)的喙，喙絲狀，淺褐色，分枝或不分枝。分生孢子梗褐色，直或彎曲，具隔膜(圖4-G、H)。綜合以上結(jié)果，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可初步鑒定為茄鏈格孢(A.solani)。

注：A～D為菌株HQ23-5。A：菌落正面；B：菌落背面；C：分生孢子形態(tài)；D：產(chǎn)孢表型。E～H為菌株HQ13-5。E：菌落正面；F：菌落背面；G：分生孢子；H：產(chǎn)孢表型。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定及親緣關(guān)系分析

提取菌株HQ13-5和HQ23-5的基因組DNA后，使用引物ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶清晰，無(wú)拖尾雜帶現(xiàn)象，分別獲得518和515 bp的片段，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，分別獲得登錄號(hào)MZ305073和MZ305076。經(jīng)Nucleotide BLAST分析發(fā)現(xiàn)，菌株與A.tomatophila、A.alternata、A.solani和A.tenuissima的同源性相近，無(wú)法將其區(qū)分開(kāi)。因此選用過(guò)敏原基因(Alta1)和質(zhì)膜腺苷三磷酸基因(ATPase)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Alta1引物分別獲得大小為444和450 bp的片段(菌株HQ13-5的Alta1登錄號(hào)為MZ305071，菌株HQ23-5的Alta1登錄號(hào)為MZ305074)，ATPase引物分別獲得大小為1 205和1 198 bp的片段(菌株HQ13-5的ATPase登錄號(hào)為MZ305072，菌株HQ23-5的ATPase登錄號(hào)為MZ305075)。

利用ITS、Alta1、ATPase的基因序列結(jié)合鏈格孢菌屬的模式菌株參考序列，以鄰接法構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，菌株HQ23-5與A.alternate(鏈格孢)和A.tenuissima(細(xì)極鏈格孢)同聚為一個(gè)大分枝，菌株HQ13-5與A.solani(茄鏈格孢)聚為一支(圖5)?；诙嗷蜩b定結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)一步進(jìn)行組蛋白基因(His3)基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序。結(jié)果表明，菌株HQ23-5獲得大小為550 bp的片段，而菌株HQ13-5獲得大小為489 bp的片段，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以準(zhǔn)確的將細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)、鏈格孢(A.alternata)和茄鏈格孢(A.solani)區(qū)分(圖6)。綜合以上結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)特征，甘肅省定西市隴西縣黃芩葉斑病的病原菌鑒定為茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)，其中福星鎮(zhèn)的5個(gè)菌株均為細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)，菜子鎮(zhèn)的7個(gè)菌株均為茄鏈格孢(A.solani)，而首陽(yáng)鎮(zhèn)和文峰鎮(zhèn)茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)均有分布。

圖5 基于rDNA-ITS, Alt a1和ATPase基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 基于His 3基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)茄鏈格孢(A. solani)和細(xì)極鏈格孢(A. tenuissima)產(chǎn)孢的影響

由表4可知，PDA、CMA、PCA和SA四種培養(yǎng)基均可以促進(jìn)細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)產(chǎn)孢，四者差異顯著；四種培養(yǎng)基對(duì)茄鏈格孢(A.solani)的產(chǎn)孢量有明顯影響，其中PDA、CMA分別與PCA和SA差異顯著，而PDA與CMA之間差異不顯著。茄鏈格孢(A.solani)只在PCA和SA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢且在SA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大。培養(yǎng)11 d觀察到菌株HQ13-5上有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)且產(chǎn)孢量為4.2×104個(gè)·mL-1，說(shuō)明SA培養(yǎng)基可促進(jìn)茄鏈格孢(A.solani)產(chǎn)孢。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響

2.6 殺菌劑對(duì)茄鏈格孢(A. solani)和細(xì)極鏈格孢(A. tenuissima)菌絲生長(zhǎng)的影響

4種殺菌劑對(duì)茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用(表5)，各藥劑對(duì)菌絲的抑制率隨著處理濃度的增大而增加，其中97%咯菌腈對(duì)茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)的菌絲抑制作用最強(qiáng)，EC50分別為0.06和0.04 mg·L-1，其次為0.3%丁子香酚可溶液劑和0.4%蛇床子素可溶液劑，而98.5%腐霉利的抑制作用最差，EC50分別為5.03和4.82 mg·L-1。從毒力回歸方程b值來(lái)看，97%咯菌腈對(duì)茄鏈格孢(A.solani)、0.3%丁子香酚可溶液劑對(duì)細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)的b值均大于其他藥劑，表明茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)對(duì)97%咯菌腈和0.3%丁子香酚可溶液劑的敏感性比其他藥劑高。綜合EC50和b值篩選出對(duì)茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)菌絲有較強(qiáng)抑制作用的藥劑為97%咯菌腈。

表5 4種殺菌劑對(duì)茄鏈格孢和細(xì)極鏈格孢菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

3 討論

葉斑病是近年來(lái)黃芩主要葉部病害之一，發(fā)生較為普遍，導(dǎo)致黃芩產(chǎn)量降低，品質(zhì)受到影響。本試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害田間主要為害葉片，表面呈不規(guī)則的黑褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)全部葉片枯死、脫落。

鏈格孢屬真菌引起的病害在經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物和果蔬生產(chǎn)中均有發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展[22]。鏈格孢屬真菌具有明顯的孢子形態(tài)特征，較其他真菌易于區(qū)分和鑒別，但由于寄主、培養(yǎng)條件，特別是營(yíng)養(yǎng)條件、pH值、溫度、光照等諸多因素的不一致，使孢子的形態(tài)和菌落形態(tài)變化較大，因此鏈格孢屬下種的準(zhǔn)確描述和鑒定非常困難。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核苷酸序列分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在鏈格孢分類中被廣泛應(yīng)用，多個(gè)核苷酸序列或基因片段被引入鏈格孢的系統(tǒng)發(fā)育分析，如ITS、mtLSU、endoPG、TUB[23]、mtSSU、ATPase、ACT、CHS、EF-1a、Alta1、gpd、CAL[24]、OPA2-1[25]、IGS[26]、His3[27]等。本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)、致病性測(cè)定、柯赫氏法則驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合ITS、Alta1、ATPase和His3這4個(gè)基因序列對(duì)鏈格孢菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究，首次明確了甘肅省隴西縣不同地區(qū)黃芩葉斑病的病原菌為茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)。

據(jù)報(bào)道，鏈格孢屬真菌在國(guó)內(nèi)外引起多種植物病害[28]，如馬鈴薯早疫病[29]和葉斑病[30]、紅棗黑斑病[31]、藍(lán)莓葉斑病[32]等。Moreno等[33]報(bào)道，鏈格孢屬真菌不僅通過(guò)菌絲和孢子侵入寄主，還能在寄主植物上分泌毒素，人畜食用后會(huì)對(duì)健康造成危害，甚至?xí)鸢┳儯虼?，關(guān)于由茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)引起的黃芩葉斑病應(yīng)受到更大的關(guān)注。

毒力回歸方程能有效反映不同濃度殺菌劑與抑菌效果的關(guān)系，EC50是衡量殺菌劑毒力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)[34]。目前14α-脫甲基抑制劑類(14α-demethylation inhibitors, DMIs)殺菌劑(如咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑)大量應(yīng)用于細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)引起的植物病害防治，雖效果較好，但基于藥材對(duì)農(nóng)藥要求的特殊性，其造成的農(nóng)殘超標(biāo)和環(huán)境污染不容忽視。本試驗(yàn)在室內(nèi)篩選出咯菌腈對(duì)黃芩葉斑病的兩種病原菌茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)的菌絲抑制作用最強(qiáng)，EC50最低，其次為丁子香酚、蛇床子素，而腐霉利的抑制作用最差。據(jù)報(bào)道，丁子香酚作為一種新型植物源殺菌劑，對(duì)鏈格孢菌(A.alternata)[35]具有很好的防治效果，咯菌腈和腐霉利對(duì)蕓薹鏈格孢(A.braassiciola)的抑菌效果最好[36]，這可能與病原菌對(duì)藥劑的敏感性不同有關(guān)。本試驗(yàn)僅在室內(nèi)測(cè)定了不同殺菌劑對(duì)茄鏈格孢和細(xì)極鏈格孢的毒力，關(guān)于咯菌腈對(duì)黃芩葉斑病的田間防治效果仍有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

黃芩葉斑病發(fā)生普遍，主要為害葉片，通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS、Alta1、ATPase、His3等4個(gè)基因序列首次明確了甘肅省不同地區(qū)黃芩葉斑病的病原菌為茄鏈格孢(A.solani)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)，室內(nèi)篩選出咯菌腈的抑菌效果較好。