于 明 王 丹, * 王 鋼 高 鵬 黃 敏 陳麗娟

(1 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2 四川省原子能研究院，輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101；3 成都默森輻源科技有限公司，四川 成都 610101)

天麻(Gastrodiaelata)是蘭科天麻屬天麻(GastrodiaelataBlume)的干燥塊莖[1-3]，廣泛分布于我國西南部和中部地區(qū)，有治療頭痛、降血壓、鎮(zhèn)靜和抗炎等效用[4-5]。天麻含天麻素、對羥基苯甲醇、多糖、蛋白質等多種營養(yǎng)成分，且天麻素和對羥基苯甲醇作為《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定測定的活性成分，是評價天麻品質的主要指標[6-7]。目前中華人民共和國國家衛(wèi)生和健康委員會已將天麻納入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質管理試點》中。天麻既可加工成天麻飲片、天麻復方顆粒，又可加工成降壓咀嚼片和飲料等[8-9]。但由于天麻活性成分多、營養(yǎng)價值高，導致天麻表面微生物含量嚴重超標。傳統(tǒng)的硫磺熏蒸和磷化鋁熏蒸方法存在化學殘留[10]等缺陷，氣調貯藏成本高，熱壓滅菌會破壞天麻素成分[11]。因此，尋求新的滅菌貯藏方式是促進天麻產業(yè)發(fā)展的當務之急。

電子束輻照技術是一種綠色冷殺菌技術[12]，因殺蟲滅菌效果顯著、安全等受到廣泛關注[13-14]。與傳統(tǒng)硫熏滅菌方法相比，電子束輻照技術具有無污染、無殘留等優(yōu)點。與60Co-γ射線輻照滅菌方式相比，電子束輻照技術穿透能力較弱，具有單位時間內可加工產品量大、效率高、可控性強，且無環(huán)境污染隱患[15]等優(yōu)勢，已被廣泛用于食品、藥品及醫(yī)療用品的滅菌工藝中[16]，如蒸煮小龍蝦[17]、冷鮮雞[18]、葛根粉[19]等。

目前，電子束輻照在食品和中藥材中的應用仍以滅菌殺蟲為主，而有關電子束輻照處理對天麻色澤、活性成分含量及指紋圖譜等品質影響方面的研究尚鮮見。本研究采用不同劑量0(CK)、5、7、9、11、13 kGy高能電子束輻照處理天麻，測定天麻的微生物數量、色澤、理化性質、活性成分含量及高效液相色譜(high performance liquid charamatography, HPLC)指紋圖譜等指標，以期為電子束輻照技術在天麻滅菌加工中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻藥材為市售，購自成都市國際商貿城中藥材市場。

天麻素、對羥基苯甲醇、巴森利苷A(純度均≥ 98%)，成都埃法生物科技有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖瓊脂，購于北京奧博星生物技術有限責任公司；重鉻酸銀劑量計，四川原子能研究院實驗室自制。

1.2 儀器與設備

NH300電腦色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司；KQ-250DB超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GH6000型隔水培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司；HH-S6數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；UltiMate3000DGLC雙三元、二維液相色譜儀系統(tǒng)，美國賽默飛世爾公司；IS1020高能電子加速器，同方威視科技(北京)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理 將天麻樣品粉碎(過50目篩)，用聚對苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯(polyethylene glycol terephthalate/polyethylene, PET/PE)復合材料包裝，每袋400 g，平均厚度約2 cm，送至重慶恒德輻照有限公司進行輻照處理，輻照吸收劑量分別設置為0(CK)、5、7、9、11、13 kGy。高能電子加速器參數為：電子束能量10 MeV，功率20 kW。采用四川原子能研究院自制的重鉻酸銀劑量計測定吸收劑量，實際測定吸收劑量為5.2、7.2、9.5、11.9、13.9 kGy。文中均以設定吸收劑量表示。

1.3.2 微生物限度指標測定 按《中華人民共和國藥典》[2]2020版通則1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法測定天麻樣品中的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數。

1.3.3 色差測定 天麻色澤測定參照武艷雪等[20]的方法。對儀器黑白版校正以后，取適量天麻樣品置于粉末測試盒中進行測定，每個樣品重復測定3次，記錄其L*、a*、b*值。總色差ΔE由以下公式計算得出：

式中，ΔL*、Δa*、Δb*分別為劑量組與對照組L*、a*、b*的差值。

1.3.4 理化性質測定 按照《中華人民共和國藥典》[2]2020版中的方法分別對天麻水分、醇溶性浸出物及總灰分含量等指標進行測定。

1.3.5 活性成分測定 參照《中華人民共和國藥典》[2]2020版中的方法測定天麻素及對羥基苯甲醇總含量。

1.3.6 天麻HPLC指紋圖譜測定

1.3.6.1 對照品溶液制備 取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A對照品適量，精密稱定0.01 mg，加10%的甲醇混合溶液制成每1 mL含天麻素25 μg、對羥基苯甲醇50 μg、巴利森苷A 50 μg的混合溶液。

1.3.6.2 供試品溶液制備[21-22]取天麻細粉2.0 g，置于150 mL具塞磨口錐形瓶中，加入50 mL 55%甲醇溶液，搖勻，稱定重量，振蕩器振搖2 min后超聲(400 W，40 kHz)提取45 min，冷卻放至室溫，再次稱定重量，用上述溶液補足失量，搖勻并過濾，取續(xù)濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.6.3 高效液相色譜色譜條件 色譜柱：Hyersil GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液；按照表1進行梯度洗脫；波長：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃，進樣量：10 μL。

表1 流動相時間程序

1.4 數據處理

采用Excel 2007對數據進行分析計算，SPSS 25軟件Duncan’s多重檢驗法分析結果之間是否存在顯著差異(P<0.05)，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照對天麻微生物數量的影響

天麻經電子束輻照后立即檢測需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，結果見表2。天麻經電子束輻照后，其微生物數量明顯減少。天麻的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數原始含菌量分別為 3.23×107、3.20×107(CFU·g-1)，經5 kGy劑量輻照后，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均減少了4個數量級；經7 kGy劑量輻照后，微生物含量降低了99.99%；經9 kGy劑量輻照后，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數含量均未檢出，滿足《中華人民共和國藥典》[2]2020版規(guī)定。

表2 電子束輻照對天麻微生物總數的影響

2.2 電子束輻照處理對天麻色澤的影響

中藥材色澤是影響藥材經濟價值的因素之一。用色差儀測定其L*、a*、b*與△E值，獲得的數據可以判斷電子束輻照對天麻色澤的影響，其中L*值表示明度，值越大，光澤度越好；a*值代表紅綠值；b*值則代表黃藍軸上顏色的飽和度。由表3可知，電子束輻照處理后天麻的色澤發(fā)生變化。不同吸收劑量電子束輻照處理后天麻的色度L*值分布在11.03～13.81之間。與對照組相比，輻照后的天麻L*值均降低，尤其是當輻照劑量為5、11、13 kGy時，其L*值顯著低于對照組。a*值分布于22.74～26.33之間，表明顏色偏向紅色，在13 kGy時達到最大值。b*值分布在32.03～35.18之間，均為正值，偏黃色。與對照組相比，各劑量組的b*值無顯著差異，但5、7 kGy分別與13 kGy之間存在顯著差異，且13 kGy時達最大值。總色差△E值在9 kGy時與對照組之間的差異最小，5 kGy的總色差則差異最大。

表3 電子束輻照對天麻色澤的影響

2.3 電子束輻照處理對天麻理化性質的影響

由表4可知，不同劑量電子束輻照處理對天麻的水分、總灰分含量無顯著影響(P>0.05)。不同劑量電子束輻照處理天麻的醇溶性浸出物含量在16.90%～19.06%之間。與對照組相比，輻照處理后的天麻醇溶性浸出物含量略有上升，在9 kGy輻照時達到顯著水平(P<0.05)。

表4 電子束輻照對天麻貯藏期內理化性質的影響

2.4 電子束輻照對天麻HPLC指紋圖譜的影響

天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A對照品指紋圖譜如圖1所示。在天麻藥材高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜上共選擇標定了20個共有特征峰，與對照品指紋圖譜比對，可確認6號峰為天麻素、7號峰為對羥基苯甲醇、15號峰為巴利森苷A。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2.0軟件分別對不同劑量電子束輻照天麻的指紋圖譜進行多點位校正、自動匹配，用中位數法生成對照圖譜 R，即共有模式圖，并計算相似度(表5)。以6號峰天麻素為參比峰，計算天麻活性成分特征峰的相對保留時間(表 6)。由表5和表6可知，6個輻照劑量下的天麻特征峰相似度均達到0.99，相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)均小于0.2%，說明在5～13 kGy吸收劑量范圍內不會對天麻的化學成分一致性產生顯著影響。

注：6：天麻素；7：對羥基苯甲醇；15：巴利森苷A。

注：R：對照圖譜；S1：0 kGy；S2：5 kGy；S3：7 kGy；S4：9 kGy；S5：11 kGy；S6：13 kGy。下同。

表5 電子束輻照前后天麻藥材指紋圖譜相似度計算表

表6 電子束輻照對天麻指紋圖譜相對保留時間的影響

2.5 電子束輻照處理對天麻活性成分含量的影響

為探究電子束輻照對天麻活性成分含量的影響，對電子束輻照處理后的天麻藥材進行了活性成分定量檢測，結果見表7。各輻照組與對照組間天麻素含量無顯著差異，吸收劑量為5 kGy時，天麻素含量顯著低于11 kGy吸收劑量組(P<0.05)；對羥基苯甲醇含量隨著吸收劑量的增加而逐漸降低，在13 kGy時顯著降低至最小值。盡管不同處理組間的天麻素、對羥基苯甲醇含量存在差異，但電子束輻照對天麻主要有效成分天麻素、對羥基苯甲醇總百分含量無顯著影響(P>0.05)，表明天麻有效成分經5種劑量處理后無大幅度降解。

表7 電子束輻照對天麻活性成分的影響

3 討論

3.1 電子束輻照對天麻微生物含量的影響

輻照直接或間接使微生物內的DNA雙鏈斷裂、蛋白質變性，從而使微生物喪失繁殖能力或死亡，且不會因溫度升高而使熱敏性物質發(fā)生破壞[11]。目前已有利用60Co-γ射線探究輻照天麻的滅菌效果的報道，而利用電子束輻照天麻滅菌的報道較為鮮見。本研究結果表明，電子束輻照能夠有效降低天麻藥材中需氧菌、霉菌和酵母菌數量以達到滅菌效果，且隨著電子束吸收劑量的增加，對微生物的抑制作用逐漸增強，在輻照劑量為9 kGy時，天麻的微生物數量降至檢測限以下，基本達到無菌水平。蘇文俏[23]研究表明，采用輻照劑量為2、4、6 kGy的60Co-γ射線輻照天麻生藥粉，能有效降低產品中細菌、霉菌及酵母菌的含量，其中6 kGy的60Co-γ射線輻照滅菌率能達到99%以上，與本研究中輻照能有效降低天麻中需氧菌、霉菌與酵母菌含量的結果一致。何毅等[24]研究表明，采用2 kGy電子束輻照處理即可在保證藥材品質的前提下有效殺滅川產麥冬中的微生物，也說明電子束輻照能有效殺滅藥材中的微生物。

3.2 電子束輻照對天麻色澤及理化性質的影響

中藥材有其固有的色澤，是評價藥材品質優(yōu)劣最直觀且重要的指標，它與中藥材成分變化也有密切關系[25]。水分、灰分、浸出物含量是評價藥材質量的指標。中藥材水分含量過高不利于貯藏，容易滋生病蟲和微生物，導致發(fā)霉、變質以及有效成分的減少，降低藥效[26]。中藥材灰分中的礦物質直接或間接地來自土壤，能反映藥材中的金屬礦物質水平。當總灰分含量控制在藥典規(guī)定范圍內則說明藥材在種植、生產、運輸和貯藏的各個環(huán)節(jié)中均無外界無機物的污染[27]。中藥材浸出物作為藥典規(guī)定的控制其品質的關鍵指標，具有保障中藥材質量的作用。

本研究結果表明，電子束輻照對天麻亮度值有一定影響，即隨著電子束吸收劑量的增大，天麻L*值降低。郭一丹等[28]研究發(fā)現60Co-γ射線和電子束處理使冬棗L*值降低，與本研究結果一致。有研究表明，總色差介于0～6之間時，色差不明顯[24]，說明本研究中輻照對天麻總色差的影響較小，但總體呈現出隨電子束吸收劑量增加先下降后上升的趨勢，其中9 kGy輻照劑量對天麻總色差的影響最小。

本研究結果表明，電子束輻照處理對天麻藥材中的水分和總灰分含量無顯著影響。韓振明等[29]研究發(fā)現蜈蚣藥粉中水分、總灰分、醇溶性浸出物含量在60Co-γ射線輻照前后均無顯著差異，與本研究結果一致。電子束輻照在輻照過程中并不會引起溫度的上升，因此對水分的影響較小。本研究結果表明天麻藥材醇溶性浸出物含量隨著吸收劑量的增加而增加。蔡汶莉[12]研究表明輻照后百合的水溶性浸出物含量顯著上升，與本研究結果一致。這可能是由于電子束輻照引起了天麻藥材中醇溶性生物大分子的降解，造成天麻醇溶性浸出物含量的上升。

3.3 電子束輻照對天麻HPLC指紋圖譜的影響

研究者利用中藥指紋圖譜分析比對中藥材的主要特征峰數量、峰面積或比例來達到對其質量的綜合控制，保證中藥材質量的穩(wěn)定安全[30]。中藥指紋圖譜技術能在一定程度上反映電子束輻照前后天麻質量的變化。本研究結果表明，不同劑量電子束輻照處理并不會對天麻的HPLC指紋圖譜產生明顯影響，且各指紋圖譜相似度均大于0.99，具有良好的相似性，不會對天麻化學成分的一致性產生明顯影響。楊孝容等[31]研究發(fā)現天麻中某些化學成分會隨著60Co-γ射線輻照劑量的增加而減少。鄒瓊[21]研究發(fā)現低于10 kGy劑量60Co-γ射線輻照天麻后指紋圖譜相似度為0.918～0.999，結合5種成分含量變化情況后建議輻照天麻滅菌的劑量不超過6 kGy。以上研究均表明使用60Co-γ射線對天麻進行輻照滅菌時宜采用較低劑量，與本研究中13 kGy以內劑量輻照天麻不會對其成分產生明顯影響的結果不一致，這可能與輻射源不同有關，但仍需進一步研究。

3.4 電子束輻照對天麻活性成分含量的影響

天麻素和對羥基苯甲醇是天麻的兩種主要藥用成分，也是評價天麻品質優(yōu)劣的重要指標。天麻素具有催眠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、防治再灌注損傷、降低血壓、擴張血管等藥理作用[32]。研究表明，對羥基苯甲醇作為天麻素的水解產物，同樣也具有神經保護作用[33]。本研究發(fā)現，與對照組相比，各吸收劑量組天麻素含量均無顯著差異。胥雙等[34]研究發(fā)現天麻素含量在6 kGy的60Co-γ 射線輻照后無變化。陳艷[11]研究表明60Co-γ射線輻照對天麻素含量影響小。陳梅紅等[35]研究發(fā)現4.20～8.40 kGy60Co-γ射線輻照不會破壞天麻素結構，其含量無顯著變化。以上研究均表明較低輻照劑量的60Co-γ射線輻照處理不會影響天麻素含量，與本研究結果一致。說明天麻素結構在較低劑量輻照下較為穩(wěn)定。張曉彬等[36]采用5～30 kGy的電子束和60Co-γ射線分別輻照天麻藥材，結果表明天麻素含量隨輻照劑量的增加而降低，這與本研究結果不一致，可能是由于高劑量60Co-γ 射線輻照致使天麻素分子中醚鍵斷裂。楊孝容等[31]研究表明天麻素和對羥基苯甲醇在3～13 kGy60Co-γ射線輻照下相對穩(wěn)定。這與本研究中對羥基苯甲醇的含量在輻照劑量為13 kGy時顯著降低的結果不一致，但與輻射源是否有關還需進一步探討?？傮w而言，電子束輻照處理對天麻藥材中兩者的總百分含量無顯著影響。

4 結論

本研究結果表明，電子束輻照能有效降低天麻藥材細粉中的微生物含量，且對其整體品質無顯著影響。天麻中吸收劑量為9 kGy時，其微生物含量能滿足《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，色澤變化最小，且有助于提高醇溶性浸出物含量，不會對天麻主要活性成分含量及化學成分一致性產生顯著影響。