李心海 朱廣琴 高 峰 張林吉 任士飛 王 巖 崔 燕

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221151；3 江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司，江蘇 徐州 221151)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)又稱F-2毒素，該霉菌毒素常見于玉米等谷物中。在高溫多雨的夏秋季節(jié)，谷物和飼料易受潮而產(chǎn)生霉變[1-2]。杜妮[3]研究發(fā)現(xiàn)，99.5%的谷物及飼料中含有兩種及兩種以上的霉菌毒素，其中ZEN的污染最為常見。周建川等[4]研究發(fā)現(xiàn)，從全國采集到的1 034份目標(biāo)飼料樣品中，ZEN檢出率超80%，且其中28.89%的玉米ZEN含量超標(biāo)。

ZEN會對人類及各種畜禽產(chǎn)生生殖毒性、遺傳毒性，并對其健康造成嚴(yán)重影響[5]。周敏等[6]用含有1.5 mg·kg-1ZEN的飼料飼喂35日齡小母豬，結(jié)果表明，ZEN導(dǎo)致小母豬子宮內(nèi)膜增生、壞死、腺體萎縮。劉秀鳳[7]和Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ZEN能夠?qū)е侣殉膊∽?，從而影響動物的正常排卵，甚至干擾動物發(fā)情，不僅會降低胎仔數(shù)，還有可能導(dǎo)致假孕和子宮內(nèi)膜增生等，進(jìn)而降低受孕率。因此，降低谷物、飼料、食品中ZEN的含量以減少ZEN對人畜的危害勢在必行。目前常用的去除ZEN的技術(shù)方法有射線輻照、臭氧處理、添加吸附劑、生物降解等[9]。60Co-γ輻照技術(shù)是近幾十年出現(xiàn)的一種冷處理技術(shù)，具有高效經(jīng)濟(jì)、環(huán)保實用、安全便捷的優(yōu)勢。研究表明，60Co-γ輻照技術(shù)能夠有效降解ZEN、紅青霉毒素、赭曲霉毒素等[10]。經(jīng)60Co-γ輻照后，玉米中的ZEN可得到有效降解[1]，且玉米營養(yǎng)成分無明顯損失[11]。

以往的研究主要是對經(jīng)60Co-γ輻照后的稻米、小麥等谷物的ZEN降解率及其品質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析[1，6]，而關(guān)于60Co-γ輻照后玉米中ZEN降解效果和品質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對定時人工授精中種公羊和母羊生殖性能影響的研究極少?；诖耍狙芯客ㄟ^檢測不同劑量60Co-γ下受ZEN自然污染玉米中ZEN的降解率、主要營養(yǎng)成分和淀粉的微觀結(jié)構(gòu)變化情況；并將10 kGy60Co-γ輻照后的玉米飼喂定時人工授精的綿羊，檢測綿羊種公羊射精量、精液品質(zhì)及母綿羊同期發(fā)情率、受孕率、死胎率、產(chǎn)羔率、胎兒體質(zhì)等多方面變化，以期為自然污染ZEN的玉米經(jīng)60Co-γ輻照后作為飼料正常飼喂繁育綿羊提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米籽粒(含ZEN)，購自江蘇徐州大華種業(yè)有限公司；ZEN標(biāo)品，購自德國Sigma公司；乙腈、乙酸、甲醇，均為色譜純，購自上海科旺試劑公司；氯仿(分析純)，購自天津市精強(qiáng)化工公司；氮?dú)狻⒀鯕?，購自徐州特種氣體公司。

澳洲白種公羊(體重約70 kg、2～4歲)、湖羊母羊(體重50～60 kg、2～3歲)，購自江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司；60Co-γ射線源，江蘇連云港輻照中心。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 玉米的選取 稱取玉米粒樣品15份，每份樣品1 000 g，用自封袋封裝，置于60Co-γ輻照中心輻照，平均劑量率為0.31 Gy·s-1。按照國際原子能機(jī)構(gòu)規(guī)定的小于10 kGy劑量為安全劑量的標(biāo)準(zhǔn)[12]，設(shè)定0、3、5、8、10 kGy 5個輻照劑量，每個劑量設(shè)3次重復(fù)。輻照后的玉米用于玉米中ZEN的檢測、玉米斷面的觀察及營養(yǎng)成分測定。

1.2.260Co-γ輻照式下玉米對澳洲白種公羊、湖羊母羊定時人工授精中的影響

1.2.2.1 澳洲白種公羊試驗設(shè)計 將15只體重約70 kg，2～4歲的澳洲白種公羊隨機(jī)分成3組，每組5只。試驗于2020年9月—11月在江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司進(jìn)行，試驗設(shè)計30 d，按表1飼料進(jìn)行分組飼喂。每只羊每隔2 d進(jìn)行1次日常采精，對試驗第1、第15和第30天采集到的精液進(jìn)行ZEN含量檢測。

圈舍實行分欄飼養(yǎng)，羊圈統(tǒng)一用丙硫咪唑驅(qū)蟲與常規(guī)免疫，用新潔爾滅消毒液對地面、墻壁、房頂、羊欄進(jìn)行全消毒，房舍進(jìn)行通風(fēng)，保持采光良好。種公羊飼料按養(yǎng)殖場常用配方將飼料原料制成顆粒料，其中玉米占比20%。每天早晨8點(diǎn)和下午5點(diǎn)分兩次投喂飼料，自由采食，自由飲水。

1.2.2.2 湖羊母羊試驗設(shè)計 于2020年9月—2021年3月，選取90只體重約60 kg，2～3歲的經(jīng)產(chǎn)湖羊母羊，隨機(jī)分為3組，按表1飼料進(jìn)行分組飼喂。選擇養(yǎng)殖場正常養(yǎng)殖使用的湖羊種公羊精液授精。

表1 各組綿羊飼料ZEN含量

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米中ZEN的檢測 ZEN檢測參照《GB/T 23504-2009食品中玉米赤酶烯酮的測定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[13]。用LC600A高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)儀(南京科捷儀器公司)對ZEN進(jìn)行定量分析，用MultiSep 226凈化柱(天津迪馬科技公司)對ZEN分離純化的固相進(jìn)行萃取。按照以下公式計算ZEN降解率：

ZEN降解率=(輻照前樣品中ZEN量-輻照后樣品中ZEN量)/輻照前樣品中ZEN量×100%

(1)。

1.3.2 玉米斷面的觀察及營養(yǎng)成分測定 玉米斷面的觀察：橫向掰開玉米粒，使其呈自然斷面，并保持?jǐn)嗝嫫秸?，用吸耳球吹除斷面上的微?xì)粉粒。使用KAS-2000F離子濺射儀(英國布萊特公司)對玉米斷面噴金，以增強(qiáng)玉米斷面的導(dǎo)電性，通過掃描電鏡放大 6 000 倍觀察玉米淀粉的結(jié)構(gòu)。

玉米營養(yǎng)成分測定：委托徐州市畜牧獸醫(yī)站實驗中心進(jìn)行檢測。玉米養(yǎng)分評價指標(biāo)主要包括粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗淀粉和粗灰分。粗蛋白(crude protein, CP)含量采用《GB/T 6432-1994飼料中粗蛋白測定方法》[14]的方法進(jìn)行測定，粗纖維(crude fibre, CF)含量采用FOSS全自動纖維分析儀(丹麥福斯公司)測定[11]，粗脂肪(ether extract, EE)含量采用《GB/T 6433-2006飼料中粗脂肪的測定》[15]的方法進(jìn)行測定，粗灰分(crude ash, ASH)含量采用《GB/T 6438-2007飼料中粗灰分的測定》[16]的方法進(jìn)行測定，樣品重復(fù)3次以上。

1.3.3 精液品質(zhì)分析 精液品質(zhì)分析指標(biāo)主要包括采精量、精子活力、精子密度和精子畸形率。精液采集：將5 μL精液滴加于潔凈載玻片上，顯微鏡下觀察并采集合格的精液，用集精杯(標(biāo)有刻度)收集精液并讀取精液量。將每只羊的精液平均分為2份，用大豆卵磷脂BioXcell和含卵黃Optidyl分作兩部分冷凍保存。精子活力檢測：參照《DB15/T 1769-2019馬、驢冷凍精液制作操作規(guī)程》[17]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，取出冷凍后的精子，在37℃水中放置30 s。取5 μL精液滴加于Leja玻片腔室中，用IVOSⅡ精子分析儀(美國Hamilton Thorne公司)分析其活力情況。精子DNA完整性分析：利用精子頂體染色試劑盒PSA-FITC進(jìn)行DNA完整性分析。

1.3.4 母羊定時人工授精分析 母羊定時人工授精分析指標(biāo)包括同期發(fā)情率和受胎率。發(fā)情狀況主要根據(jù)母羊外陰部和母羊精神狀態(tài)來斷定。配種后50 d，用B型超聲波儀(廣州索諾星信息科技有限公司)妊娠診斷，統(tǒng)計受胎數(shù)。按公式(2)計算同期發(fā)情率；按公式(3)計算受胎率：

同期發(fā)情率=每組發(fā)情羊數(shù)/每組羊總數(shù)×100%

(2)

受胎率=每組懷孕羊數(shù)/每組羊總數(shù)×100%

(3)。

1.3.5 湖羊母羊產(chǎn)羔情況和羔羊初生始重分析 湖羊母羊產(chǎn)羔情況和羔羊初生始重指標(biāo)包括產(chǎn)羔總數(shù)、死胎數(shù)、產(chǎn)羔率、羔羊成活率和羔羊始重。母羊分娩時，根據(jù)實際情況記錄產(chǎn)羔情況，稱取初生羔羊體重，并按公式(4)、(5)計算產(chǎn)羔率、羔羊成活率：

產(chǎn)羔率=出生羔羊數(shù)/分娩母羊數(shù)×100%

(4)

羔羊成活率=出生時活羔羊數(shù)/出生羔羊數(shù)×100%

(5)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件記錄試驗數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計算、對比、繪圖。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ射線輻照條件下玉米中ZEN含量變化情況

由表2可知，未經(jīng)60Co-γ輻照的玉米中ZEN含量為2 153 μg·kg-1，超過《GB 13078.2-2006飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[18]對谷物、飼料中ZEN的限定標(biāo)準(zhǔn)(≤ 500 μg·kg-1)。隨著60Co-γ輻照劑量的增加，玉米中ZEN降解率逐漸增大，但在8～10 kGy劑量下，玉米中ZEN降解率增速低于0～8 kGy劑量處理。在8 kGy劑量下，玉米中67.2%的ZEN被將解，含量降至706 μg·kg-1，超過國家對谷物、飼料中ZEN的限定標(biāo)準(zhǔn)(≤500 μg·kg-1)。在10 kGy劑量下，玉米中83.7%的ZEN被降解，含量降至351 μg·kg-1，符合國家對谷物、飼料中ZEN的限定標(biāo)準(zhǔn)(≤500 μg·kg-1)。

表2 不同60Co-γ射線輻照條件下玉米中ZEN含量變化

2.2 60Co-γ射線處理對玉米淀粉顆粒的影響

將60Co-γ輻照過的玉米淀粉用JSM-6700F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)放大6 000倍觀察(圖1)，可見60Co-γ射線輻照處理的玉米淀粉顆粒表面光滑，無凸凹不平及孔洞出現(xiàn)；3 kGy60Co-γ射線輻照處理后，個別淀粉顆粒破裂；5 kGy60Co-γ射線輻照處理后，少量淀粉顆粒破裂；8 kGy60Co-γ射線輻照處理后，破裂淀粉顆粒增多；10 kGy60Co-γ射線輻照處理破裂的淀粉顆粒明顯增多。由此可見，60Co-γ輻照未破壞玉米淀粉顆粒表面形態(tài)，但破壞了玉米淀粉顆粒的完整性。

圖1 電子顯微鏡放大6 000倍下不同60Co-γ輻照劑量處理的玉米淀粉顆粒

2.3 60Co-γ輻照對玉米營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，0～10 kGy60Co-γ輻照處理后，玉米粗蛋白含量為6.85%～6.94%，最大相差0.09個百分點(diǎn)。隨著輻照劑量的增加，玉米中水分含量呈逐漸降低趨勢，最高含量(14.10%)比最低含量(13.80%)高0.03個百分點(diǎn)，差異不顯著(P>0.05)；粗脂肪含量呈逐漸升高趨勢，最高含量(0.28%)比最低含量(0.27%)高0.01個百分點(diǎn)，差異不顯著(P>0.05)；粗纖維最高含量(0.45%)比最低含量(0.43%)高0.02個百分點(diǎn)，差異不顯著(P>0.05)；粗灰分含量最高為0.12%，最低為0.11%，差異不顯著(P>0.05)。綜上，0～10 kGy劑量60Co-γ輻照處理，對玉米粗蛋白、水分、粗淀粉、粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量均無顯著影響。

表3 60CO-γ輻照處理后玉米主要營養(yǎng)成分

2.4 60Co-γ輻照模式下含有ZEN的玉米對澳洲白種公羊在定時人工授精中的影響

由表4可知，Ⅰ對照組與試驗Ⅱ組的種公羊在第30天時的采精量、精子活力、精子密度均無顯著差異(P>0.05)。試驗Ⅲ組種公羊在第30天時的采精量、精子密度、精子活力與試驗Ⅱ組、對照組相比顯著下降(P<0.05)；而精子畸形率與試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組相比明顯升高。顯微鏡下觀察綿羊種公羊精子，有雙尾精子、精子聚集、精子頭部尾部不完整、雙頭精子、無尾精子等現(xiàn)象。以上數(shù)據(jù)表明，自然污染ZEN含量為 2 153 μg·kg-1的玉米，經(jīng)10 kGy60Co-γ輻照后，符合《GB 13078.2-2006飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[18]，可以作為飼料飼喂種公羊，對綿羊種公羊采精量、精子畸形率、精子活力、精子密度不產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表4 澳洲白種公羊精液品質(zhì)檢測

2.5 60Co-γ輻照模式下含有ZEN的玉米對湖羊母羊定時人工授精的影響

2.5.1 飼喂經(jīng)60Co-γ輻照含有ZEN的玉米對湖羊母羊同期發(fā)情率和受胎率的影響 由表5可知，Ⅰ對照組、試驗Ⅱ組母湖羊的同期發(fā)情率分別比試驗Ⅲ組顯著提高16.71、15.96個百分點(diǎn)(P<0.05)；受胎率分別比試驗Ⅲ組顯著提高20.72、16.97個百分點(diǎn)(P<0.05)。Ⅰ對照組母湖羊的同期發(fā)情率、受胎率與試驗Ⅱ組無顯著差異(P>0.05)。

表5 湖羊母羊同期發(fā)情率和受胎率

2.5.2 飼喂經(jīng)60Co-γ輻照含有ZEN的玉米對湖羊母羊產(chǎn)羔情況和羔羊始重的影響 由表6可知，試驗Ⅱ組的產(chǎn)羔總數(shù)、產(chǎn)羔率、羔羊成活率、羔羊始重與Ⅰ對照組無顯著差異(P>0.05)，說明對湖羊母羊飼喂經(jīng)10 kGy60Co-γ輻照后含144 μg·kg-1ZEN的玉米(表1)，對湖羊產(chǎn)羔及羔羊始重影響不顯著(P>0.05)。試驗Ⅲ組產(chǎn)羔總數(shù)比Ⅰ對照組、試驗Ⅱ組分別少22、20只(P<0.05)；產(chǎn)羔率比試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組分別顯著降低31、32個百分點(diǎn)(P<0.05)；羔羊成活率比試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組分別顯著降低9.8、11.2個百分點(diǎn)(P<0.05)；羔羊始重與試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組相比分別顯著降低0.55、0.57 kg(P<0.05)。說明對母湖羊飼喂未經(jīng)10 kGy60Co-γ輻照的自然污染ZEN的玉米，能夠顯著降低湖羊產(chǎn)羔總數(shù)、產(chǎn)羔率、羔羊成活率和羔羊始重。

表6 湖羊母羊產(chǎn)羔情況和羔羊初生重結(jié)果

3 討論

3.1 60Co-γ射線輻照后玉米ZEN含量變化

本研究結(jié)果顯示，在8～10 kGy劑量下，對試驗II組玉米進(jìn)行降解處理，ZEN降解率增速低于0～8 kGy劑量降解率增速，可能是由于玉米粒表面的ZEN被降解，而玉米粒內(nèi)部的ZEN降解難度增大[19]，這與郭東權(quán)等[20]的研究結(jié)果基本一致。由此推斷，當(dāng)玉米中ZEN降解率為67.2%時，玉米中的自由基減少，ZEN與自由基反應(yīng)的幾率下降。因此，8～10 kGy劑量下玉米中ZEN降解率增速降低。

本研究中，未經(jīng)60Co-γ輻照的無污染的玉米中ZEN含量為2 153 μg·kg-1，在8 kGy劑量下，ZEN含量降至706 μg·kg-1(降解率67.2%)，超國家標(biāo)準(zhǔn)；在10 kGy劑量下，ZEN含量降至351 μg·kg-1(降解率83.7%)，這與尹青崗[21]的研究結(jié)果基本一致。說明ZEN含量不超過2 153 μg·kg-1的玉米經(jīng)過10 kGy劑量60Co-γ輻照后，玉米中的ZEN被有效降解，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可以用作飼料。

3.1.160Co-γ射線輻照處理對玉米淀粉顆粒的影響 本研究電鏡觀察結(jié)果顯示，10 kGy60Co-γ輻照未破壞玉米淀粉顆粒表面形態(tài)，但會破壞玉米淀粉顆粒的完整性?？赡苁怯捎谠谳椪兆饔孟拢矸鄯肿渔湵淮蜷_，斷鏈部位失去電子，生成帶電活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的生物活性，能夠與周圍物質(zhì)發(fā)生物化反應(yīng)，生成共聚物，進(jìn)而改變了淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，破壞淀粉顆粒的完整性。

3.1.260Co-γ輻照對玉米營養(yǎng)成分的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，隨著60Co-γ輻照劑量的增加，玉米中粗脂肪含量增多。經(jīng)0、3、5、8、10 kGy60Co-γ輻照處理后玉米的粗蛋白、水分、粗淀粉、粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量無顯著差異(P>0.05)，即低劑量60Co-γ輻照對玉米營養(yǎng)成分無顯著影響。與崔龍等[22]、徐遠(yuǎn)芳等[23]、羅莉[24]的研究結(jié)果基本一致。

3.2 不同試驗組的效果和機(jī)制

3.2.160Co-γ輻照模式下含有ZEN的玉米對澳洲白種公羊在定時人工授精中的影響 ZEN生殖毒性較強(qiáng)，可導(dǎo)致雄性老鼠生殖能力損傷，并通過多種作用機(jī)制導(dǎo)致精液品質(zhì)下降[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，對試驗Ⅲ組飼喂自然污染ZEN含量為2 153 μg·kg-1的玉米，試驗Ⅲ組澳洲白種公羊的采精量、精子活力、精子密度與試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組相比顯著下降，精子畸形率顯著上升。逄健等[26]對小鼠飼喂ZEN，發(fā)現(xiàn)ZEN使雄性小鼠睪丸體積、質(zhì)量顯著下降，精子活力、射精量顯著減少，生殖能力下降。這與本次研究結(jié)果一致。董雙等[25]對雄性小鼠注射ZEN，發(fā)現(xiàn)ZEN破壞睪丸細(xì)胞，降低了睪酮合成，減少了精液生成。本研究也證實了動物攝入ZEN能導(dǎo)致其精液生成減少。

本研究發(fā)現(xiàn)，試驗Ⅱ組與Ⅰ對照組澳洲白種公羊的采精量、精子畸形率、精子活力、精子密度均無顯著差異(P>0.05)，說明ZEN含量為2 153 μg·kg-1的玉米經(jīng)過10 kGy劑量60Co-γ輻照后，對澳洲白種公羊生殖性能無顯著影響。而對其飼喂ZEN含量為2 153 μg·kg-1的玉米后，精子品質(zhì)顯著降低。因此10 kGy劑量輻照后的玉米，可以正常飼喂澳洲白種公羊。

3.2.260Co-γ輻照模式下含有ZEN的玉米對湖羊母羊定時人工授精的影響 ZEN與雌二醇結(jié)構(gòu)相似[27-30]，會使子宮內(nèi)膜卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程受到阻礙，顆粒細(xì)胞增生速度減緩[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗Ⅰ組與Ⅱ組的湖羊母羊同期發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)羔總數(shù)、產(chǎn)羔率、羔羊成活率、羔羊始重?zé)o顯著差異(P>0.05)，這與王相生[33]的研究結(jié)果基本一致。說明ZEN含量不超過2 153 μg·kg-1的玉米經(jīng)過10 kGy劑量60Co-γ輻照后，玉米中的ZEN被有效降解，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可以用作飼料正常飼喂繁育母綿羊。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，隨著60Co-γ輻照劑量的增大，玉米含水量減少；輻照處理后玉米的淀粉顆粒及主要營養(yǎng)成分無顯著變化。對試驗Ⅲ組飼喂自然污染ZEN含量為2 153 μg·kg-1的玉米，發(fā)現(xiàn)試驗Ⅲ組的澳洲白種公羊與試驗Ⅱ組、Ⅰ對照組相比，采精量、精子活力、精子密度顯著下降，精子畸形率顯著上升。選用10 kGy劑量60Co-γ輻照后，玉米中ZEN降解率達(dá)83.7%；將輻照后的玉米飼喂試驗Ⅱ組澳洲白種公羊后，其精液品質(zhì)與Ⅰ對照組無顯著差異；將輻照后的玉米飼喂試驗Ⅱ組湖羊母羊，母羊發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)羔情況和羔羊始重與Ⅰ對照組無顯著差異。因此，ZEN含量低于2 153 μg·kg-1的玉米經(jīng)10 kGy60Co-γ輻照后，可以正常飼喂繁育綿羊，對綿羊定時人工授精無顯著影響。