李大命，劉 洋,2，劉燕山，張彤晴，殷稼雯，張 偉，穆新武，蔣琦辰

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點實驗室，江蘇南京 210017；2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210046；3.江蘇省駱馬湖漁業(yè)管理委員會辦公室，江蘇宿遷 223800)

我國是魚類資源較為豐富的國家之一，近幾十年來，受氣候變化、環(huán)境污染、過度捕撈及水利工程的影響，我國漁業(yè)資源量銳減，物種多樣性和遺傳多樣性下降，嚴重威脅漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展利用?？焖?、準確鑒定魚類，是科學(xué)保護和管理魚類資源的前提和基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的魚類鑒定是建立在魚類形態(tài)特征基礎(chǔ)之上，對分類人員的專業(yè)知識和鑒定能力要求較高。另外，由于魚類的生物棲息環(huán)境多樣，其形態(tài)結(jié)構(gòu)易受到地理環(huán)境和不同發(fā)育階段的影響，且魚類“同種異形”和“異種同形”現(xiàn)象廣泛存在，給魚類種類鑒定造成困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析而進行物種鑒定的技術(shù)，該技術(shù)具有不受樣品性別、發(fā)育階段、形態(tài)學(xué)變化限制的優(yōu)點，且可以使物種鑒定過程實現(xiàn)標準化和信息化，近年來已成為生物分類學(xué)研究的熱點。線粒體COI基因的進化速度比核DNA快，所積累的遺傳變異足以區(qū)分近緣種，且該基因容易被通用引物擴增，因此COI基因被選定為動物界物種鑒定的標準基因。目前，COI基因作為DNA 條形碼在魚類的物種鑒定和多樣性分析上也得到廣泛應(yīng)用，且已經(jīng)建立了多個魚類條形碼數(shù)據(jù)庫，為開展魚類物種鑒定提供了便利。

建立水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)是水產(chǎn)種質(zhì)資源就地保護的一種有效形式，對保護水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)揮了重要作用。經(jīng)原農(nóng)業(yè)部批準，駱馬湖國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)于2009年批準成立，保護區(qū)總面積3 160 hm，其中核心區(qū)面積1 000 hm，試驗區(qū)面積2 160 hm。保護區(qū)的主要保護對象是鯉魚和鯽魚。近年來，有關(guān)駱馬湖漁業(yè)資源調(diào)查的研究已有較多報道，但鮮見有關(guān)駱馬湖魚類DNA條形碼的研究報道。該研究通過PCR擴增和測序，獲得了駱馬湖國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)20種魚類的COI條形碼，并對COI基因序列特征、種內(nèi)與種間遺傳距離及分子系統(tǒng)進化關(guān)系進行分析，探索COI條形碼在魚類物種鑒定和分類中的適應(yīng)性，以期為保護區(qū)魚類資源保護和可持續(xù)開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

該研究魚類樣本來源于2019年4月和9月對保護區(qū)開展的漁業(yè)資源監(jiān)測所得漁獲物。根據(jù)《江蘇魚類志》對魚類樣本進行種類鑒定，所分析的20種魚類樣本信息及其分類地位見表1。剪取魚類樣品背部的肌肉組織置于95%乙醇中保存，用于后續(xù)基因組DNA提取。

表1 魚類樣品信息及分類地位

采用TaKaRa公司的廣譜型基因組DNA小量試劑盒提取魚類樣本的基因組DNA，并對DNA的完整性進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

采用魚類DNA條形碼通用引物進行PCR擴增，引物序列F1：TCAACCAACCACAAA GACATTGGCAC，R1：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括0.4 μL聚合酶(5 U/μL)、4 μL dNTP (2.5 mmol/L)、5 μL 10×PCR Buffer (含Mg)，上、下游引物各2 μL (10 mmol/L)，2 μL DNA模板，剩余部分超純水補足。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s,共30個循環(huán)；最后在72 ℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程股份有限公司純化并進行雙向測序，測序引物與擴增引物相同。

利用BioEdit 7.0.5.3軟件讀取原始序列并進行人工校對，采用Clustal X1.83軟件對序列進行多重比對分析，獲得長度一致的同源序列，并在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi) 和BOLD (http://www.boldsystems.org)分別進行相似性檢索。采用DnaSP 6.12.03軟件定義序列的單倍型。利用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計序列的堿基組成、變異位點、簡約信息位點、單一信息位點等，并基于Kimura′s 2-parameter雙參數(shù)替代模型計算不同分類界元間的遺傳距離。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)進化樹，并進行1 000次自展分支檢驗。

2 結(jié)果與分析

通過PCR擴增、測序和分析，共獲得20種魚類的201條COI基因條形碼序列，COI條形碼長度為630 bp。COI序列堿基的平均含量分別為A 24.4%、C 28.3%、T 28.5% 和G 18.8%，堿基A+T的含量(52.9%)高于G+C的含量(47.1%)，表現(xiàn)出明顯堿基組成偏倚性，符合多數(shù)魚類線粒體COI序列的堿基組成特征。另外，各密碼子的堿基含量差異明顯，第1密碼子位點G+C的含量(58.8%)明顯高于第2和第3密碼子位點G+C的含量(分別為44.2%和38.5%)。所有COI序列沒有插入或缺失位點，保守位點有379個，變異位點有251個，簡約信息位點有239個，單一信息位點有12個。

表2 不同分類界元間的遺傳距離

基于20種魚類的COI基因序列，構(gòu)建COI序列單倍型NJ系統(tǒng)進化樹(圖1)。從圖1可以看出，同一種類的所有個體都聚為一支，且置信度很高，20種魚類全都形成了單系類群，與基于形態(tài)學(xué)的物種鑒別一致。且同一屬內(nèi)、科內(nèi)、目內(nèi)的不同種類也能很好的聚類，形成了獨立的進化分支，表明COI條形碼對于不同分類界元的魚類具有廣適性。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.1 NJ phylogenetic tree constructed based on COI sequence

3 討論與結(jié)論

近20年來，DNA條形碼技術(shù)發(fā)展迅速并被廣泛應(yīng)用，它突破了分類學(xué)只能依靠形態(tài)特征來完成的傳統(tǒng)，為分類學(xué)開辟了一條新的途徑，將完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定手段無法完成的工作。隨著魚類DNA條形碼序列的積累和全球魚類條形碼數(shù)據(jù)庫的建立，DNA條形碼在魚類物種鑒定的準確性進一步提高，應(yīng)用范圍也越來越廣泛。

截至目前，線粒體的COI基因是動物DNA條形碼研究中使用最為廣泛的標準基因，它具有DNA條形碼理想序列的3個基本判斷標準：①序列變異水平適宜；②變異區(qū)域兩端的序列高度保守；③序列長度適宜且易于獲得。一般來說，基于DNA 條形碼進行物種鑒定取決于2個方面:①同一物種的種內(nèi)遺傳距離要小，不同物種的種間距離要大，且種間距離要明顯大于種內(nèi)距離；②在系統(tǒng)進化樹上，同一物種的不同個體能聚為同一分支。有研究指出，利用線粒體COI 基因作為條形碼對物種鑒別時認為種內(nèi)的遺傳距離不得大于0.02， 且種間距離至少是種內(nèi)距離的10倍以上才可有效判別物種。該研究首次獲得了駱馬湖國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)20種魚類的COI條形碼序列，并計算了各個分類單元的遺傳距離。結(jié)果顯示，20種魚類的種內(nèi)遺傳距離均小于0.02，種內(nèi)遺傳距離平均值為0.002 9；種間遺傳距離為0.008 0～0.308 8，平均值為0.202 5，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的70倍。從系統(tǒng)進化樹來看，20種類魚類均形成單系群，說明基于COI條形碼對魚類進行物種鑒別是可行和有效的。該研究結(jié)果進一步證明了COI條形碼在魚類鑒定中的適用性，也補充和豐富了魚類條形碼數(shù)據(jù)。另外，科內(nèi)屬間的遺傳距離平均為0.150 3，目內(nèi)科間的遺傳距離平均值為0.206 1，目間的遺傳距離平均為0.236 4，表明遺傳距離隨著分類階元的提高而增大，且不同的目科屬內(nèi)的種類也都獨立聚為一支，說明COI條形碼對于高階分類單元的系統(tǒng)進化分析也有重要的參考價值。

線粒體的COI基因作為DNA條形碼在不同生物類群中應(yīng)用的有效性得到了越來越多的驗證，COI通用引物的廣泛適用性也已在魚類研究中得到良好證明。然而，COI條形碼在近緣魚類物種鑒定過程中仍存在一定局限性。比如，該研究中大鰭鱊和興凱鱊的種間遺傳距離較小，僅為0.008 0。還有研究表明，光澤黃顙魚與瓦氏黃顙魚和長須黃顙魚以及長須黃顙魚與瓦氏黃顙魚的種間遺傳距離均小于種內(nèi)遺傳距離的10倍。因此，對于親緣關(guān)系較近的魚類，可以選擇其他DNA條形碼(線粒體Cytb基因或控制區(qū)序列)和COI條形碼聯(lián)合進行物種鑒定和進化分析，以獲得更加準確的結(jié)果。