李 鑫，方 超，李建華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

在動(dòng)物血清抗體監(jiān)測(cè)過程中，常進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)，如新城疫病毒抗體、禽流感病毒抗體、減蛋綜合征病毒抗體等，均需要新鮮的1%雞紅細(xì)胞作為材料輔助進(jìn)行試驗(yàn)。但新鮮雞紅細(xì)胞的制備需要特定環(huán)境（無(wú)病毒感染）下的SPF大公雞，且保存期較短，配制繁瑣，所以使用方便和穩(wěn)定的雞紅細(xì)胞保存方法是必然的需求。本研究通過借鑒相關(guān)研究制備了醛化雞紅細(xì)胞、凍干雞紅細(xì)胞，并與1%新鮮的雞紅細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，以期為適用于現(xiàn)地實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

磷酸緩沖鹽溶液（PBS），購(gòu)自Biosharp公司，按說明書添加雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4；2.5%戊二醛溶液（C5H8O2），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；血凝-血凝抑制用新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體、血凝-血凝抑制用禽流感H9病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體，均為哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

2 方法

2.1 新鮮雞紅細(xì)胞的制備

參照楊志峰[1]制備雞紅細(xì)胞的方法，選擇12個(gè)月以上的SPF公雞，翅下靜脈無(wú)菌采集血液至抗凝管中，低速（3 000 r·min-1）離心5 min，去除上層液，留取下層雞紅細(xì)胞，用PBS液洗滌，再離心，去上清，重復(fù)2次。最后，采用PBS重懸雞紅細(xì)胞，配制成10%的雞紅細(xì)胞懸液，置于4℃冰箱中保存。

2.2 1%雞紅細(xì)胞的制備

取新鮮配制的10%雞紅細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，參考王宇波等[2]的方法，按血細(xì)胞比容用pH為7.2～7.4的PBS液重懸，得到1%雞紅細(xì)胞，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 醛化紅細(xì)胞的制備

根據(jù)萬(wàn)勇虎等[3]、孫軍杰等[4]試驗(yàn)結(jié)果，確定醛化紅細(xì)胞的制備方案。將雞紅細(xì)胞緩慢加入2.5%戊二醛溶液中，配制成1%紅細(xì)胞懸液，在4℃條件下醛化5 h，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 凍干紅細(xì)胞的制備

曾麗亞[5]在《診斷用凍干雞紅細(xì)胞的制備》研究中，制定了適合紅細(xì)胞凍干的條件：將醛化后紅細(xì)胞懸液置于液氮?dú)庀嘀衅胶?0 min，凍干體系達(dá)到超冷狀態(tài)但未出現(xiàn)結(jié)冰，再置于冷凍干燥機(jī)中抽真空，凍干時(shí)間設(shè)置為20 h，凍干隔板溫度為-35℃，最后將西林瓶壓蓋、封裝。取凍型完整、顏色均勻和空隙致密的凍干紅細(xì)胞，放置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 微量血凝-血凝抑制試驗(yàn)

設(shè)2個(gè)試驗(yàn)組，分別為醛化紅細(xì)胞試驗(yàn)組、凍干紅細(xì)胞試驗(yàn)組，以及對(duì)照組（1%新鮮雞紅細(xì)胞），見表1。以上各組同時(shí)進(jìn)行新城疫病毒和禽流感H9病毒的微量血凝-血凝抑制比較試驗(yàn)，具體步驟參照康華玲等[6]、黃艷羚等[7]的試驗(yàn)方法。

表1 試驗(yàn)分組

2.6 現(xiàn)地臨床血清樣本檢測(cè)

隨機(jī)無(wú)菌采集取某雞場(chǎng)現(xiàn)地雞血10份，進(jìn)行3 500 r·min-1離心5 min，分離血清，分別使用2.5%醛化紅細(xì)胞、2%凍干紅細(xì)胞、1%新鮮雞紅細(xì)胞進(jìn)行新城疫病毒抗體和禽流感H9病毒抗體檢測(cè)，觀察各試驗(yàn)組的差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗(yàn)（NDV HAHI）

通過新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗(yàn)，重復(fù)3次同時(shí)比較試驗(yàn)，取平均值（保留整數(shù)），可以看出：對(duì)照組與試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2存在明顯差異。在血凝試驗(yàn)中，對(duì)照組較試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的血凝價(jià)均高，且試驗(yàn)組1比對(duì)照組低2個(gè)效價(jià)、試驗(yàn)組2比對(duì)照組低3個(gè)效價(jià)，具體見表2；在血凝抑制試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1比對(duì)照組的新城疫血凝抑制價(jià)

高1個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2比對(duì)照組的血凝抑制價(jià)高2個(gè)效價(jià)。通過重復(fù)試驗(yàn)比較可知，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2與對(duì)照組的血凝價(jià)-血凝抑制價(jià)差異穩(wěn)定，具體見表2、表3。

表2 新城疫病毒血凝試驗(yàn)結(jié)果

表3 新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

3.2 禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗(yàn)（AIVH9 HA-HI）

通過禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗(yàn)，重復(fù)3次同時(shí)比較試驗(yàn)，取平均值（保留整數(shù)），在血凝試驗(yàn)中，對(duì)照組較試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2的血凝價(jià)均高，且試驗(yàn)組1比對(duì)照組低1個(gè)效價(jià)、試驗(yàn)組2比對(duì)照組低2個(gè)效價(jià)，具體見表4；在血凝抑制試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1比對(duì)照組禽流感血凝抑制價(jià)高1個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2比對(duì)照組血凝抑制價(jià)高2個(gè)效價(jià)，具體見表5?？煽闯觯瑢?duì)照組與試驗(yàn)組仍存在明顯差異。重復(fù)試驗(yàn)可以看出，差異存在是穩(wěn)定的。

表4 禽流感H9病毒血凝試驗(yàn)結(jié)果

表5 禽流感H9病毒血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

3.3 現(xiàn)地臨床樣本檢測(cè)

在某雞場(chǎng)現(xiàn)地采集的血液，分離得到血清約0.75 mL·只-1，使用不同紅細(xì)胞懸液，各重復(fù)3次。新城疫、禽流感H9的血凝抑制試驗(yàn)中，使用2.5%醛化紅細(xì)胞、2%凍干紅細(xì)胞的抗體效價(jià)結(jié)果均高于1%新鮮雞紅細(xì)胞（分別為8.2 lb、9.7 lb和7.4 lb；7.0 lb、8.0 lb和6.3 lb；），且符合試驗(yàn)組中兩者之間的抗體差異規(guī)律。詳細(xì)結(jié)果見表6。

表6 現(xiàn)地臨床樣本血清檢測(cè)結(jié)果lb

4 分析與討論

禽類抗體監(jiān)測(cè)是養(yǎng)殖業(yè)的重點(diǎn)項(xiàng)目，從抗體檢測(cè)結(jié)果中可以得到禽類的免疫情況及有無(wú)潛在的疫病存在。禽類抗體檢測(cè)通常在實(shí)驗(yàn)室采用瓊括試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、微量血凝抑制試驗(yàn)等進(jìn)行，但在現(xiàn)地抗體臨檢通常采用微量血凝-血凝抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)中需要新鮮的雞紅細(xì)胞，但新鮮雞紅細(xì)胞制備需要離心機(jī)、SPF大公雞等條件，現(xiàn)場(chǎng)制備麻煩，因此這成為限制臨床檢測(cè)禽類血清樣本的因素[8]。通過醛化紅細(xì)胞和凍干紅細(xì)胞替代新鮮雞紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可為現(xiàn)地臨床試驗(yàn)提供便利。

通過2.5%醛化紅細(xì)胞（試驗(yàn)組1）、2%凍干紅細(xì)胞（試驗(yàn)組2）與1%新鮮雞紅細(xì)胞（對(duì)照組）比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在新城疫病毒血凝試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1與對(duì)照組比低2個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2與對(duì)照組比低3個(gè)效價(jià)；而在禽流感-H9病毒血凝試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1較對(duì)照組低1個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2較比照組低2個(gè)效價(jià)。在新城疫血凝抑制試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1較對(duì)照組高1個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2較對(duì)照組高2個(gè)效價(jià)；在禽流感-H9病毒血凝抑制試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1較對(duì)照組高1個(gè)效價(jià)，試驗(yàn)組2較對(duì)照組高2個(gè)效價(jià)。3組之間的差異存在著一定的規(guī)律性[9]。

有報(bào)道表明，2.5%戊二醛可改變紅細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)，從而使紅細(xì)胞的血凝活性發(fā)生改變[10]，所以醛化的雞紅細(xì)胞與新鮮的雞紅細(xì)胞的血凝價(jià)等存在一定差異。新鮮的雞紅細(xì)胞保存期短，僅能維持5 d左右，之后會(huì)發(fā)生紅細(xì)胞破裂，但由于戊二醛存在2個(gè)具有反應(yīng)活性的醛基，可與新鮮紅細(xì)胞上的自由氨基或者巰基結(jié)合，從而增加了紅細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，不容易發(fā)生破碎，延長(zhǎng)了紅細(xì)胞的保存期[11]。

凍干紅細(xì)胞是通過醛化后的雞紅細(xì)胞冷凍真空干燥制備而成，凍干紅細(xì)胞加水復(fù)原后，細(xì)胞形態(tài)完整，仍可進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)，原則上血凝價(jià)與醛化后的雞紅細(xì)胞相同，但在凍干前分裝或操作不當(dāng)均會(huì)造成紅細(xì)胞的破壞，所以在血凝-血凝抑制試驗(yàn)中，醛化的雞紅細(xì)胞與冷凍真空干燥的雞紅細(xì)胞存在1～2個(gè)效價(jià)差。醛化的雞紅細(xì)胞保存時(shí)間大概為3個(gè)月以上[12]，而凍干紅細(xì)胞在4℃條件下可維持半年以上[13]。

通過現(xiàn)地臨床檢測(cè)雞的新城疫病毒、禽流感H9病毒抗體情況，可以看出醛化紅細(xì)胞、凍干紅細(xì)胞與新鮮的雞紅細(xì)胞的抗體效價(jià)之間的差異是穩(wěn)定存在的，且醛化紅細(xì)胞與新鮮雞紅細(xì)胞及凍干紅細(xì)胞與新鮮紅細(xì)胞之間的差值也是相對(duì)穩(wěn)定的。所以，在現(xiàn)地進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)，可應(yīng)用醛化紅細(xì)胞或凍干紅細(xì)胞來(lái)代替1%新鮮雞紅細(xì)胞。

新鮮的雞紅細(xì)胞制備簡(jiǎn)單，但在4℃條件下保存期僅為5 d左右，醛化的紅細(xì)胞保存期所有延長(zhǎng)，但兩者在現(xiàn)地檢測(cè)中，存在運(yùn)輸問題，若路途顛簸，可能造成紅細(xì)胞的二次破裂，影響試驗(yàn)結(jié)果。而凍干雞紅細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，不易再受外界影響破壞紅細(xì)胞，對(duì)結(jié)果影響較小。綜上所述，在現(xiàn)地進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)時(shí)可使用2%凍干雞紅細(xì)胞來(lái)代替1%新鮮雞紅細(xì)胞。