孫 心，李叔偉

（1.哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾大學，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

由H5和H7亞型禽流感病毒（AIV）引起的高致病性禽流感（HPAI）已被世界動物衛(wèi)生組織列為一類動物疫病[1]。近年來，由于我國家禽養(yǎng)殖密度過大，生物安全措施不到位，防控意識不到位，從而造成了高致病性禽流感病毒頻頻出現(xiàn)變異，增加了防控難度。2021年高致病性禽流感發(fā)生率升高，H5亞型2.3.4.4d分支是目前影響我國部分地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV，以2.3.4.4d分支為代表的是H5N6亞型。同時，目前禽流感H5N8亞型已在全球廣泛傳播，在歐洲國家以及美國均已檢出[2-4]，現(xiàn)在也嚴重危害我國養(yǎng)禽業(yè)。近年我國白羽肉雞雞群也開始發(fā)生高致病性禽流感，發(fā)生日齡多在30日齡以后，因母源抗體無法保護21日齡之后的雞群，白羽肉雞免疫高致病性禽流感疫苗是一個趨勢，尤其在秋冬季節(jié)免疫是必要的。本試驗應用重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株和H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株）進行免疫監(jiān)測，以掌握該疫苗的免疫效果，為今后高致病性禽流感疫苗在白羽肉雞上的應用提供數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 疫苗及試劑

重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株滅活疫苗，哈藥集團生物疫苗有限公司生產(chǎn)。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及陽性血清，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；紅細胞懸液（SPF級公雞紅血球），購自哈藥集團生物疫苗有限公司。

1.2 試驗動物

1日齡白羽肉雞3 300羽，平均體重50 g·羽-1，黑龍江省哈爾濱市某白羽肉雞養(yǎng)殖場提供，其中正常免疫雞群3 000羽，應激試驗用300羽。

2 方法

2.1 雞群抗體檢測試驗

3 000羽試驗雞隨機分為A、B、C、D 4組，每組750羽。A、B組在雛雞1日齡時分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫劑量分別是0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1；C、D組在雛雞7日齡時分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫劑量分別是0.30mL·羽-1和0.50mL·羽-1。雞群在同一管理條件下進行飼養(yǎng)。

A、B組雛雞在1日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗前隨機抽取20羽，心臟采血，檢測母源抗體；分別在7、14、21、28、35、42日齡各組隨機20羽雞翅靜脈采血，離心制備血清，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體效價檢測。C和D組雛雞7日齡接種疫苗，分別在7、14、21、28、35和42日齡各組隨機取20羽雞翅靜脈采血，離心制備血清，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體效價檢測。待檢血清HI抗體效價≥4 lb為抗體合格。

2.2 應激試驗

300羽雛雞隨機分為A、B、C、D 4組，每組75羽，分別于不同日齡（1日齡、7日齡、1日齡、7日齡）接種不同劑量（0.15 mL、0.30 mL、0.30 mL、0.50 mL）的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），接種后觀察疫苗吸收時間及試驗雞的精神狀態(tài)、采食量，判斷該疫苗對雞群的應激情況。

3 結果與分析

3.1 重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗接種后的抗體消長規(guī)律

3.1.1 1日齡接種0.15 mL·羽-1

1日齡接種0.15 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表1和圖1。

表1 試驗雞1日齡接種0.15 mL·羽-1后各日齡的抗體效價 lb

圖1 試驗雞1日齡接種0.15 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

1日齡白羽肉雞接種0.15 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監(jiān)測結果顯示H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在14日齡時達到4.8 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日齡分別達到7.2 lb、7.3 lb和7.2 lb。從結果看三價滅活疫苗1日齡免疫0.15 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

3.1.2 1日齡接種0.30 mL·羽-1

1日齡接種0.30 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表2和圖2。1日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監(jiān)測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在14日齡時分別為4.7 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日齡時分別為7.3 lb、7.3 lb和7.2 lb。從結果看三價滅活疫苗1日齡免疫0.30 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

表2 試驗雞1日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價lb

圖2 試驗雞1日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

3.1.3 7日齡接種0.30 mL·羽-1

7日齡接種0.30 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表3和圖3。7日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監(jiān)測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在21日齡時分別為4.9 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日齡時分別為6.4 lb、6.6 lb和6.1 lb。從結果看三價滅活疫苗7日齡免疫0.30 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

圖3 試驗雞7日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

表3 試驗雞7日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價lb

3.1.4 7日齡接種0.50 mL·羽-1

7日齡接種0.50 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表4和圖4。7日齡白羽肉雞接種0.50 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監(jiān)測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在21日齡時分別為5.0 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日齡時分別為6.5 lb、6.7 lb和6.2 lb。從結果看三價滅活疫苗7日齡免疫0.50 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

圖4 試驗雞7日齡接種0.50 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

表4 試驗雞7日齡接種0.50 mL·羽-1后各日齡的抗體效價 lb

3.2 不同日齡白羽肉雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

試驗雞應激反應情況見表5。

表5 不同日齡白羽肉雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

1日齡和7日齡白羽肉雞雞群接種不同劑量的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），從完全吸收時間、精神狀態(tài)和采食量方面來評價接種疫苗后雞群的應激狀況，結果表明接種最大劑量0.50 mL·羽-1時，疫苗對雞群應激影響是一過性的，1～2 d可以恢復。通過本試驗可以得出1日齡接種0.15 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應，7日齡接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應。但在實際應用中，接種疫苗時雞群會受到飼養(yǎng)環(huán)境的影響，偶有雞只會出現(xiàn)一過性應激反應。

4 討論

4.1 免疫日齡選擇

近幾年高致病性禽流感在白羽肉雞雞群中的發(fā)生率持續(xù)增高，以往白羽肉雞由于生長周期短的原因，不接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，往往依靠母源抗體來預防高致病性禽流感的侵襲，但母源抗體對于白羽肉雞只能保護到21日齡左右，而近兩年白羽肉雞發(fā)生高致病性禽流感多集中在30日齡以后，所以接種高致病性禽流感疫苗是目前有效預防白羽肉雞發(fā)生高致病性禽流感唯一有效方法，接種日齡是尤為關鍵的。目前白羽肉雞7日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗是比較常見的，但是對于白羽肉雞的保護率有待進一步評估。我國早期使用的重組禽流感病毒H5+H7亞型二價滅活疫苗，在廣西就應用在白羽肉雞雞群中，免疫日齡為1日齡，從抗體監(jiān)測結果看，免疫效果較為理想。白羽肉雞在現(xiàn)地疫苗免疫預防時，有些地區(qū)和省份，新城疫+H9二聯(lián)滅活疫苗、新城疫+H9+雞傳染性支氣管+雞傳染性法氏囊四聯(lián)滅活疫苗習慣在1日齡接種，所以白羽肉雞1日齡不接種重組禽流感病毒H5+H7亞型疫苗。正常在1日齡免疫滅活疫苗是十分謹慎的，因為雛雞有母源抗體的保護，所以容易造成母源抗體的干擾。本試驗選取1日齡和7日齡白羽肉雞分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），并在7、14、21、28、35和42日齡進行抗體監(jiān)測，結果表明1日齡和7日齡接種高致病性禽流三價滅活疫苗在21日齡后監(jiān)測抗體效價，21、28、35和42日齡H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗體效價，1日齡接種要高于7日齡接種的抗體效價，證明1日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗受到母源抗體的干擾很低，而且從母源抗體降低后，在21日齡左右疫苗產(chǎn)生的抗體效價在4 lb以上，所以從白羽肉雞雛雞出殼到出欄，H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗體效價都在4 lb以上，對于白羽肉雞整個生長周期都有保護力。

4.2 免疫劑量選擇

試驗在1日齡白羽肉雞接種0.15 mL·羽-1、0.30 mL·羽-1重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，7日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1、0.50 mL·羽-1重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，從完全吸收時間、精神狀態(tài)和采食量方面來評價接種疫苗后對雞群應激狀況，1日齡接種最大劑量0.30 mL·羽-1、7日齡接種最大劑量0.50 mL·羽-1時，疫苗對雞群應激影響是一過性的，1～2 d可以恢復。通過本試驗可以得出1日齡接種0.15 mL H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應，7日齡接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應。綜合比較1日齡和7日齡接種不同劑量H5+H7亞型三價滅活疫苗后抗體效價，1日齡接種0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1產(chǎn)生的抗體效價無明顯差異，7日齡接種0.30 mL·羽-1和0.50 mL·羽-1產(chǎn)生的抗體效價無明顯差異，選擇最佳接種劑量為1日齡接種0.15 mL·羽-1，7日齡接種0.3 mL·羽-1。