戰(zhàn)余銘，張 珂，周 強(qiáng)，蘇月娟

（1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心/山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250109；2.山東華昌動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南 250117；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營養(yǎng)研究所，成都 611130）

絲蘭皂苷具有很強(qiáng)的表面活性，可改變消化道上皮細(xì)胞的形態(tài)，能夠減少腸壁細(xì)胞的表面張力，提高腸壁細(xì)胞的滲透性，促進(jìn)脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更容易與腸黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通道及載體蛋白結(jié)合，促進(jìn)大分子營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[1]；通過清理腸道內(nèi)積蓄的廢物，可以增加營養(yǎng)物質(zhì)與腸絨毛的接觸面積[2-3]。

皂苷和多糖能夠結(jié)合腸道內(nèi)的氨氣，轉(zhuǎn)化成無害的可被利用的氮化物，被腸道有益菌轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，進(jìn)一步被機(jī)體所利用；另一方面，對(duì)氨氣的結(jié)合可降低氨氣對(duì)腸道的刺激，減少腸組織增生，由于減輕了腸黏膜的損傷，所以減少了因黏膜修復(fù)和組織更新導(dǎo)致的能量、蛋白質(zhì)及氧氣的消耗，進(jìn)而提高了營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用率；另外，絲蘭提取物也有利于維持腸道酸堿平衡，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，有利于腸道菌群平衡，提高消化酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化更加完全[3-4]。

本試驗(yàn)研究了日糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率以及糞便微生物的影響，旨在研究絲蘭提取物在仔豬促生長和腸道健康方面的作用效果，為絲蘭提取物在豬飼料和養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 添加劑

絲蘭提取物，山東某動(dòng)物保健品有限公司提供，商品名為優(yōu)蘭寶（天然類固醇薩灑皂角苷），皂角苷≥12%，B50值≤4 mg。

皂角苷：絲蘭提取物中最主要的功效成分，其含量高低直接影響著絲蘭提取物產(chǎn)品的作用效果[5]。

B50值：衡量絲蘭提取物產(chǎn)品結(jié)合氨氣能力的一個(gè)指標(biāo)，即結(jié)合50%的氨氣所需絲蘭提取物的質(zhì)量（mg）。數(shù)值越低表示結(jié)合氨氣的能力越強(qiáng)[5]。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選取21日齡、體重為（7.00±0.20）kg的杜長大三元雜交斷奶仔豬24頭，隨機(jī)分為2組，每組12頭豬。試驗(yàn)組（YUCCA組）和對(duì)照組（CONT組）在同一豬舍中單欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)周期共28 d，分兩個(gè)階段進(jìn)行，分別為斷奶后第1～14天（第Ⅰ階段）和斷奶后第15～28天（第Ⅱ階段）。

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地的豬場進(jìn)行。該豬場豬群健康狀況和精神狀態(tài)良好，生產(chǎn)成績穩(wěn)定。試驗(yàn)期間每天給仔豬定時(shí)（8:00、12:00、16:00和20:00）飼喂4次，所有仔豬自由采食和飲水，每天清理仔豬糞便，每周使用過硫酸氫鉀和戊二醛交替消毒2～3次，保持豬舍通風(fēng)和清潔，圈舍內(nèi)溫度控制在26～28℃，濕度控制在60%～70%。

1.3 試驗(yàn)日糧

CONT組和YUCCA組的基礎(chǔ)日糧一致，CONT組兩個(gè)試驗(yàn)階段的基礎(chǔ)日糧配方及其主要營養(yǎng)指標(biāo)見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及其主要營養(yǎng)指標(biāo)

YUCCA組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加絲蘭提取物150 g·t-1。

1.4 樣品采集與處理

試驗(yàn)第2周進(jìn)行消化試驗(yàn)，飼料中均勻混入0.3%Cr2O3指示劑，前3 d為適應(yīng)期，后4 d為收糞期。收糞完成后加入HCl固氮，并加入1 mL甲苯防腐，-20℃保存待測(cè)。

試驗(yàn)第29天，稱重完成后采用直腸刺激法采集仔豬糞便5 g，分裝于3個(gè)凍存管中液氮速凍，-80℃保存待測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 生產(chǎn)性能

于試驗(yàn)第1、8、15、22天和第29天早晨8:00對(duì)仔豬空腹稱重，并記錄每天的投料量，每周結(jié)束時(shí)結(jié)算余料量和損失料量，用于計(jì)算仔豬兩個(gè)階段以及全期的生產(chǎn)性能，具體指標(biāo)包括平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

平均日增重（g·d-1）=頭平均增重（g）/飼喂天數(shù)（d）

平均日采食量（g·d-1）=頭平均采食量（g）/飼喂天數(shù)（d）

1.5.2 養(yǎng)分消化率

收集的所有糞便和飼料樣品于65℃充分烘干72 h，室溫下平衡濕度，然后粉碎并過40目篩，用以測(cè)定養(yǎng)分消化率。使用Cr2O3作為外源性指示劑，采用原子吸收法測(cè)定鉻含量（參見GB 13082—1991）。按照張麗英[6]的方法測(cè)定飼料及糞便中的粗蛋白、總能和干物質(zhì)及脂肪的消化率。

1.5.3 糞便微生物

糞便樣品采用QIAamp糞便DNA提取試劑盒（Qiagen，GmbH Hilden，德國）測(cè)定，按照試劑盒說明書操作，從CONT組和YUCCA組的12個(gè)糞便樣品中分別隨機(jī)選取8個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。從0.25 g解凍糞便樣品中提取微生物基因組DNA，1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因DNA的完整性，基因測(cè)序和生物學(xué)信息分析由華易基因科技（廣州）有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0（IBM?SPSS?Statistics，美國）軟件獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析之前進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，所有指標(biāo)以重復(fù)個(gè)體為統(tǒng)計(jì)單位，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，0.05≤P≤0.1表示差異有趨勢(shì)，P＞0.1表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)全期YUCCA組和CONT組斷奶仔豬的ADG、ADFI和F/G，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與CONT組相比，YUCCA組斷奶仔豬的ADG和ADFI均顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)/G顯著降低（P＜0.05）；YUCCA組仔豬的ADG比CONT組提高了8.81%，ADFI提高了5.59%，F(xiàn)/G降低了4.52%。

表2 飼糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分消化率的影響

測(cè)定營養(yǎng)成分消化率，結(jié)果見表3。由表3可知，YUCCA組仔豬各養(yǎng)分消化率均顯著高于CONT組（P＜0.05），其中總能比CONT組提高了1.79%，干物質(zhì)提高了1.79%，粗蛋白和粗脂肪分別提高了2.82%和3.62%。

表3 飼糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分消化率的影響 %

2.3 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬糞便微生物的影響

2.3.1 基因測(cè)序及OTU聚類

所謂OTUs（Operational taxonomic units）即可執(zhí)行的分類操作單位，主要是按照16S DNA測(cè)序結(jié)果計(jì)算遺傳距離，人為規(guī)定遺傳距離，然后依此距離區(qū)別微生物類群的分類單位，為了形象直觀并有說服力，往往會(huì)和已知菌一起做聚類，從而完成微生物的種屬歸屬鑒定。

本試驗(yàn)中16個(gè)樣品共獲得了1 012 305條有效序列。其中，CONT組平均每個(gè)樣品的有效序列為62 847條，而YUCCA組平均每個(gè)樣品的有效序列為63 691條。稀釋曲線描述了組內(nèi)樣品的多樣性，直接反映了測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并能夠間接反映樣品中物種的多樣性和豐富程度。兩個(gè)組各樣品的稀釋曲線趨向平坦（見圖1），說明測(cè)序數(shù)據(jù)量趨于合理，若有更多的數(shù)據(jù)量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）。

圖1 飼糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響（稀釋曲線，n=8）

比較不同組之間OTUs的數(shù)量，韋恩圖見圖2。圖2中一個(gè)圈代表了一個(gè)組的樣本，圈與圈的重疊部分的數(shù)字代表兩個(gè)組樣本之間共有的OTUs數(shù)量，沒有重疊的部分，其數(shù)字代表該樣本特有的OTUs個(gè)數(shù)。CONT組 與YUCCA組 共享848個(gè)OTUs，而CONT組 獨(dú) 有155個(gè)OTUs，YUCCA組 獨(dú) 有214個(gè)OTUs，YUCCA組的OTUs更多。

圖2 飼糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響（韋恩圖，n=8）

2.3.2 樣品多樣性分析

樣品α多樣性分析（Alpha diversity）是通過分析單個(gè)樣本的多樣性來反映樣品內(nèi)微生物群落的多樣性和豐富度。Observed species指數(shù)表示所觀察到的OTU個(gè)數(shù)；Shannon指數(shù)所分析的也是多樣性。與Alpha diversity不同，Shannon指數(shù)分析的是物種多樣性，該指數(shù)數(shù)值越大表示群落的多樣性越高，也就是下一個(gè)被采集到的物種的不確定性就越大；Simpson指數(shù)其本質(zhì)表征是樣本物種的豐富度和均勻度，當(dāng)物種的種類無限多、豐富度最高，同時(shí)各物種的數(shù)目都一致、均勻度最高時(shí)，Simpson值最大，為1；Chao1指數(shù)用于判斷群落物種種類的豐富度，并且是對(duì)單個(gè)物種更為敏感，Chao1指數(shù)數(shù)值越大，表示物種的種類越多；ACE指數(shù)所估算的是沒被發(fā)現(xiàn)的物種有多少，ACE數(shù)值越大，表示樣本所屬物種真實(shí)的物種的種類越多。由表4可以看出，日糧中添加絲蘭提取物的斷奶仔豬，其腸道中微生物菌群種類更多更均勻，但飼糧中添加絲蘭提取物有降低Shannon指數(shù)（P=0.08）和Simpson指數(shù)（P=0.08）的趨勢(shì)。

表4 飼糧中添加絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬腸道微生物菌群α多樣性的影響

2.3.3 樣品間的微生物區(qū)系關(guān)系

主 坐 標(biāo) 分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）是一種數(shù)據(jù)降維分析方法，通過對(duì)特征值和特征向量進(jìn)行排序，從一系列的多維數(shù)據(jù)中把最主要的元素和結(jié)構(gòu)提取出來，基于Unweighted unifrac距離進(jìn)行PCoA分析，同時(shí)把貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合選取出來進(jìn)行作圖展示，樣本之間的距離越近，表示物種間的組成結(jié)構(gòu)越相似，所以當(dāng)所分析的樣本群落結(jié)構(gòu)相似度高時(shí)，PCoA分析傾向于聚集在一起，樣本群落結(jié)構(gòu)差異很大時(shí)則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)地分開。CONT組與YUCCA組樣品聚類較分散，表示兩組群落具有一定差異，見圖3。

圖3 基于Unweighted unifrac距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）

2.3.4 樣品間微生物差異

線性判別分析效應(yīng)值LEfSe（LDA effect size）可用來發(fā)現(xiàn)并解釋高維度的生物標(biāo)識(shí)（如通路、基因、分類單元），在組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)（Biomarker）。采用LEfSe分析比較兩組間微生物差異，并以LDA值＞3為判斷標(biāo)準(zhǔn)。如圖4和圖5所示，與CONT組相比，YUCCA組仔豬腸道中Clostridia，Oscillospirales，Ruminococcaceae與Subdoligranulum顯著富集。

圖4 基于LEfSe分析顯示兩組間微生物差異（LDA值分布柱狀圖）

圖5 基于LEfSe分析顯示兩組間微生物差異（進(jìn)化分枝圖）

3 討論

3.1 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

動(dòng)物試驗(yàn)中，用于評(píng)定豬生長性能的常用指標(biāo)有3個(gè)，即ADG、ADFI和F/G。何貝貝等[5]的研究表明，仔豬日糧中添加120 mg·kg-1絲蘭提取物極顯著地提高了仔豬的ADG和ADFI，其中，絲蘭組比對(duì)照組ADG提高了19.43%，ADFI提高了14.24%，同時(shí)，絲蘭組仔豬的F/G和腹瀉率顯著降低，F(xiàn)/G降低了0.06，腹瀉率降低了42.85%。蒲施樺等[7]研究了日糧中添加蚯蚓粉、絲蘭提取物對(duì)生長豬生長性能的影響，結(jié)果表明單獨(dú)添加絲蘭提取物（120 mg·kg-1）顯著降低了生長豬的F/G，與對(duì)照組相比，絲蘭組的F/G下降了17%。本試驗(yàn)研究結(jié)果與以上研究有著相同的影響趨勢(shì)，斷奶仔豬日糧中添加絲蘭提取物顯著改善了仔豬的生長性能。

3.2 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分消化率的影響

動(dòng)物對(duì)日糧中營養(yǎng)成分的吸收利用程度不僅決定著動(dòng)物的生長性能，還決定著糞便中惡臭物質(zhì)的產(chǎn)生量。諸多研究表明，絲蘭提取物中的皂苷可以與腸上皮細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合，形成利于營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)目讖?，提高?xì)胞膜的通透性，使大分子營養(yǎng)物質(zhì)更易被吸收；皂苷是天然的表面活性劑，可改善腸道細(xì)胞表面張力，提高營養(yǎng)的吸收率；另外，絲蘭多糖可與氨氣結(jié)合成無害的氮化物，被有益菌利用轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，提高蛋白質(zhì)利用率[8-10]。也有研究表明，絲蘭提取物能夠顯著提高動(dòng)物十二指腸的絨毛長度和隱窩深度，穩(wěn)定胃腸道的酸堿度平衡，提高包括蛋白酶、脂肪酶在內(nèi)的消化酶的活性[11]。T.S.Min等[12]研究顯示，在生長豬日糧中添加絲蘭提取物120 mg·kg-1，日糧中干物質(zhì)、粗蛋白以及必需氨基酸的表觀消化率顯著提高；蒲施樺等[7]的研究則發(fā)現(xiàn)，生長豬日糧中添加絲蘭提取物后，日糧中干物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率以及粗蛋白的表觀代謝率都有不同程度的提高，其中對(duì)粗蛋白的表觀消化率及表觀代謝率的提升效果顯著；以上這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相一致。

3.3 絲蘭提取物對(duì)斷奶仔豬糞便微生物的影響

仔豬的消化道和糞便中都存在著大量的微生物，既有有益的微生物也有有害的微生物，而仔豬對(duì)日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與腸道中的有益微生物有著密不可分的關(guān)系，其中最關(guān)鍵的兩種有益菌就是乳酸菌和大腸桿菌[13]。K.S.Muralidhara等[14]和M.Castillo等[15]的研究表明，通過檢測(cè)腸道中乳酸菌和大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量，可以反映出動(dòng)物腸道內(nèi)微生物和腸道的健康狀況。正因如此，這兩種菌也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)動(dòng)物腸道健康的主要菌群。絲蘭主要的功效成分皂苷能夠選擇性地對(duì)胃腸道中的細(xì)菌發(fā)揮作用，一方面可促進(jìn)有益菌的生長增殖，另一方面可以使有益菌細(xì)胞膜的通透性得到提高，從而促進(jìn)動(dòng)物更好地吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)[4]。何貝貝等[5]的研究結(jié)果顯示，仔豬日糧中添加絲蘭提取物，可以使糞便中大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量降低，同時(shí)提高了糞便中有益菌乳酸桿菌的數(shù)量，可以調(diào)節(jié)仔豬腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。在本試驗(yàn)中，斷奶仔豬日糧中添加絲蘭提取物，提高了仔豬糞便中微生物多樣性和均勻度[3]，間接反映了絲蘭提取物對(duì)腸道微生物的促進(jìn)作用。絲蘭提取物之所以能夠改善微生態(tài)菌群，是因?yàn)槠渲兴脑碥粘煞质且环N具有廣譜抗菌作用的活性物質(zhì)，而另外一種成分絲蘭多糖則可作為碳架供微生物利用，同時(shí)能夠平衡腸道pH，從而改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)腸道有益菌增殖[3]。

4 結(jié)論

斷奶仔豬日糧中添加絲蘭提取物，顯著提高了飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（總能、粗蛋白、粗脂肪、干物質(zhì)），提高了斷奶仔豬的ADG，并降低了F/G，提高生長性能和提高養(yǎng)殖效益；通過本試驗(yàn)中對(duì)腸道菌群的分析，飼糧中添加絲蘭提取物，仔豬的腸道菌群豐度和均勻度相對(duì)提高，有利于維護(hù)仔豬腸道健康，間接提高仔豬機(jī)體免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，通過在仔豬日糧中添加絲蘭提取物，可以對(duì)仔豬的生長性能和腸道健康起到促進(jìn)和改善效果。建議斷奶仔豬飼糧中絲蘭提取物的添加量為150 g·t-1。