文俊萍，羅達龍

(梧州市食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002)

沙丁胺醇、萊克多巴胺及克倫特羅(俗稱瘦肉精)，是能夠抑制動物脂肪生成，促進瘦肉生產(chǎn)的藥物。瘦肉精對人體的危害極大，如長期食用有瘦肉精殘留的肉，會有很嚴(yán)重的毒副作用[1-4]。近年來，不少非法商家為了降低飼養(yǎng)成本，提高利潤，將瘦肉精添加到喂養(yǎng)豬的飼料中，從而殘留在肉內(nèi)，這將危害廣大人民群眾的身體健康，如2017年央視“315”晚會曝光江蘇某企業(yè)非法添加瘦肉精以及2021年央視“315”晚會報道河南省某縣養(yǎng)殖戶在飼料中非法添加瘦肉精事件，瘦肉精相關(guān)事件屢禁不止，因此，檢測動物性食品中瘦肉精殘留具有重要意義。

有關(guān)瘦肉精的檢測方法[5]主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-10]、氣相色譜質(zhì)譜法[11]、膠體金免疫層析法、液相芯片技術(shù)[12]。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)(GB/T 22147—2008)檢測飼料中瘦肉精殘留量，樣品目標(biāo)物用磷酸甲醇溶液多次提取，經(jīng)過濾后離心，水浴氮吹近干，上清液用固相萃取柱凈化后測定，實驗過程繁瑣，耗時長，且容易造成回收率低。因此，有必要開發(fā)一種簡單、快速的方法用于測定豬飼料中瘦肉精殘留量。在線固相萃取技術(shù)是近年全新發(fā)展的全自動樣品前處理技術(shù)，現(xiàn)已被成功用于飲用水和生物檢測、以及食品中藥物殘留的高通量檢測方法構(gòu)建，本實驗研究就是利用在線固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[13]建立豬飼料中瘦肉精的分析方法，為豬飼料中非法添加瘦肉精的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

YP6002電子天平(d=0.01 g)，常州市衡正電子儀器有限公司；XA205DU電子分析天平(d=0.01 mg)，梅特勒-托利多；LC-1290/QQQ-6470三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent technology。

沙丁胺醇、萊克多巴胺及克倫特羅(純度均大于95%)，來源于Dr.Ehrenstorfer GmbH。

超純水(電阻率18.2MΩ.cm，Millipore純水機制備)，甲酸(色譜純)，美國Fisher公司；乙腈(色譜純)，美國OMIN公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制

精密稱取上述3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成1 mg/ml的儲備液，備用。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

分別量取上述3種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用超純水稀釋定容，配制成濃度為1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，備用。

1.4 色譜條件

1.4.1液相部分

在線SPE：富集柱(TurboFlow Cyclone P 0.5 mmid×50 mm)在線萃取泵為安捷倫 1260四元泵，流動相A為水，B為乙腈。分析色譜柱：ACE Ecelx C18150 mm×2.1 mm 2.6 μm，分析泵：安捷倫1290二元泵，流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈。柱溫：40℃，進樣量：10 μl，六通閥切換，在線SPE上樣以及洗脫梯度程序見表1，SPE流路圖見圖1。

圖1 SPE流路圖

表1 SPE上樣以及洗脫梯度、六通閥切換程序

1.4.2質(zhì)譜條件

3種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測條件見表2。

表2 3種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測條件

離子源(AJS ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，干燥氣溫度：200℃，干燥氣流速：15 L/min，霧化器壓力：25 psi，毛細(xì)管電壓：3 500 V，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流速：12 L/min。

1.5 供試品溶液制備

稱取試樣2.0 g(精確至0.01 g)至50 ml具塞離心管中，加入15 ml稀釋劑，超聲提取15 min，冷卻至室溫，用稀釋劑定容至20 ml，轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待分析(稀釋劑：0.1%甲酸水∶乙腈=1∶9)。

1.6 空白基質(zhì)樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取不含沙丁胺醇、萊克多巴胺以及克倫特羅成分的樣品4.0 g(精確至0.01 g)，按上述1.5制備，上清液待用，定容體積為40 ml。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE柱的選擇

在各優(yōu)化條件下，分別使用3根柱子對對照溶液(50 ng/ml)中瘦肉精3個目標(biāo)物進行測定，考察其對目標(biāo)物的保留效果。色譜柱1：CAPCELL PAK MF C8 2.00 mmid×50 mm 5 μm(以下簡稱 資生堂C8)、色譜柱2：Turbolflow Cyclone P 0.5 mmid×50 mm(以下簡稱 Cyclone P)、色譜柱3：Turbolflow Cyclone 0.5 mmid×50 mm(以下簡稱 Cyclone)。從峰型和響應(yīng)值來看，Cyclone P最優(yōu)，其次是資生堂C8，Cyclone柱對沙丁胺醇近乎毫無保留，因此綜合以上因素，最終選擇Cyclone P柱子作為瘦肉精SPE柱。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響考察

兩位實驗人員分別用超純水和空白基質(zhì)提取液(見上述1.6)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性濃度范圍均為0.5～50 ng/ml，通過比較兩位實驗人員配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)，無論是高濃度50 ng/ml，還是低濃度0.5 ng/ml，本實驗中均不存在基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

本研究分別用0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈和1.0%甲酸-乙腈3種溶液對樣品進行提取。稱取2.0 g樣品，加標(biāo)量為100 μg/kg，每種提取溶劑做3個平行樣品，按1.5所述進行處理，上機測定，分別考察平均回收率。通過比較，發(fā)現(xiàn)使用0.1%甲酸-乙腈溶液的3個平行樣品實驗回收率高于其他兩種溶液，同時比較其峰形，最終決定選擇0.1%甲酸-乙腈作為樣品提取液。

2.4 提取溶劑有機相比例的選擇

確定提取液甲酸水的濃度后，為篩選出相對好的提取液并且提高樣品回收率，我們通過改變0.1%甲酸水與乙腈的比例，分別是0.1%甲酸-乙腈9∶1、0.1%甲酸-乙腈5∶5、0.1%甲酸-乙腈1∶9，3種比例提取溶劑來觀察其回收率，確定樣品提取溶液有機相比例為0.1%甲酸-乙腈1∶9。

2.5 SPE柱色譜條件的優(yōu)化

2.5.1渦流流速的選擇

基于Cyclone P 最佳渦流速度為0.5～4 ml/min，為選取SPE柱在沖洗階段適宜的渦流流速，將基質(zhì)排阻最大化。我們分別比較了流速為 0.5、1、2、3 ml/min，以對照溶液(50 ng/ml)的響應(yīng)值作為評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值最高為1 ml/min，次之是2 ml/min和3 ml/min，最低響應(yīng)值為0.5 ml/min。因此，為保證盡可能去雜、且不影響目標(biāo)物的截留，選用1 ml/min作為SPE柱渦流流速。

2.5.2沖洗有機相的優(yōu)化

為了提高目標(biāo)物的響應(yīng)，檢測限可以做到更低，通過改變SPE柱沖洗流動相比例來觀察其目標(biāo)物響應(yīng)值變化，考察流動相為水-乙腈，比例分別為97∶3、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40，由于乙腈比例大于10時，沙丁胺醇基本無保留，所以最終選擇水-乙腈比例為97∶3和90∶10來比較，根據(jù)兩者對3種目標(biāo)的響應(yīng)值來看，SPE柱沖洗流動相比例水-乙腈90∶10的響應(yīng)值比水乙腈97∶3高出1倍多，因此，最終確定選擇其流動相為水-乙腈90∶10。

2.6 六通閥切換時間的優(yōu)化

為確保樣品雜質(zhì)的沖洗測定以及目標(biāo)物質(zhì)富集在SPE柱更完全，稱取2.0 g樣品，加標(biāo)量在100 μg/kg，分別考察0.3、0.5、1、1.5、2 min 5個閥切換時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 min切換閥能讓目標(biāo)物富集在柱子上更多，同時能將大分子雜質(zhì)沖洗更完全(見圖2)。

圖2 3種目標(biāo)物的TIC圖

2.7 SPE柱沖洗后的物質(zhì)殘留考察

在SPE柱采集了溶劑空白、樣品空白、回收樣品后，分別對其進行全掃描，沖洗時間設(shè)置為3 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在進行了樣品空白以及回收樣品后在m/z 400～500范圍存在干擾，但對3種目標(biāo)物不存在影響，無基質(zhì)效應(yīng)，該方法保證了色譜柱內(nèi)雜質(zhì)沖洗干凈，保護色譜柱與質(zhì)譜，且對目標(biāo)物的回收不造成殘留影響。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

吸取1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水稀釋得到0.5、1、5、10、20、50 ng/ml系列濃度的加標(biāo)樣品溶液，以定量離子峰面積對目標(biāo)物濃度進行線性回歸，建立工作曲線。實驗表明該方法相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，檢出限按3倍信噪比確定，定量限按10倍信噪比確定，結(jié)果如表3所示。

表3 3種目標(biāo)物的線性回歸方程及檢出限、定量限

2.9 方法重復(fù)性及回收率

在空白飼料中添加5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行回收率試驗，采用本研究方法與國標(biāo)GB/T 22147—2008 進行比較，測得回收率和重復(fù)性RSD如表4所示。

表4 3種目標(biāo)物回收率以及重復(fù)性(n=6)

由表4可見，本研究方法中飼料瘦肉精在5.0～500.0 μg/kg加標(biāo)水平，回收率在85%～100%，重復(fù)性均小于5%(n=6)，與國標(biāo)GB/T 22147—2008高級別加標(biāo)濃度回收率接近，且低濃度加標(biāo)回收率以及重復(fù)性優(yōu)于國標(biāo)方法，可能是本研究方法減少了萃取液吹干，過固相萃取凈化柱等過程，減少了目標(biāo)化合物的損失，提高了準(zhǔn)確度以及方法重復(fù)性。

3 結(jié)論

本研究采用On-line SPE-LC-MS/MS技術(shù)相結(jié)合，通過優(yōu)化提取溶劑，在線SPE色譜柱條件的優(yōu)化，建立了豬飼料中瘦肉精的檢測方法，該方法能夠自動完成樣品的在線凈化富集，回收率、靈敏度高，適用于豬飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺以及克倫特羅的確證和定量分析，為相關(guān)物質(zhì)的檢測提供了有效便捷的技術(shù)手段。