郭星潔，劉惠青，馬兆成*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，康養(yǎng)園藝研究院，湖北武漢 430070；2.化州市化橘紅研究所，廣東化州 525100）

化橘紅為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚（Citrus grandis(L.)Osbeck）未成熟或近成熟的干燥外層果皮，因其藥效獨(dú)特而被譽(yù)為“十大廣藥”之一，分布于我國(guó)廣東、廣西等地?！侗静菥V目拾遺》記載，“橘紅治痰涎、消油膩、消食、醒酒、寬中、解蟹毒”，具有理氣化痰、潤(rùn)肺止咳的顯著藥用功效[1-2]?；偌t還具有獨(dú)特的香氣，可作為一種香氣濃郁的天然香料?；偌t精油中含量較高的揮發(fā)性萜類物質(zhì)檸檬烯、月桂烯等成分，具有抗菌、助消化的藥理活性[3]，在醫(yī)藥、食品加工和日用化工等行業(yè)領(lǐng)域中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，化橘紅精油的提取通常采用水蒸氣蒸餾法[4]、無(wú)水乙醇超聲輔助提取法[5]和飽和水溶液提取法[6]，均需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的脫水處理，且提取物中雜質(zhì)較多，耗時(shí)長(zhǎng)，提取效率低。研究表明，超臨界CO2萃取是一種快速、簡(jiǎn)單且環(huán)境友好的方法，可以有效解決蒸餾法的香氣成分受熱變質(zhì)問(wèn)題以及有機(jī)溶劑提取法的溶劑殘留問(wèn)題，在精油提取方面具有廣闊的應(yīng)用前景[7-8]。超臨界CO2萃取（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）工藝是利用超臨界狀態(tài)的CO2作為溶劑直接將天然香料溶解抽取的提取方法[9]。CO2作為萃取劑具有無(wú)毒、無(wú)菌、無(wú)污染的特點(diǎn)，在高壓、密閉環(huán)境下選擇性萃取，使精油得率和資源利用率大大提高[10]。因此，本文通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2萃取化橘紅精油的工藝條件，選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間3 個(gè)因素，將精油得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)[11]，得到三元二次方程來(lái)擬合響應(yīng)面分析，發(fā)現(xiàn)并優(yōu)選精油提取工藝條件，為進(jìn)一步地發(fā)展和有效利用化橘紅提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化橘紅鮮果，采自廣東省化州市平定積田大嶺村。

無(wú)水乙醇，分析純，上海滬試有限公司；CO2氣體，純度＞99.9%，武漢深冷有限公司；正己烷，色譜純，上海滬試有限公司；脫脂棉，南昌朝陽(yáng)醫(yī)療保健有限公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 超純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

超臨界CO2提取裝置，ASI SFE-2，美國(guó)Applied Separations（ASI）公司；電子天平，JY1002，上海精平有限公司；高速多功能粉碎機(jī)，800Y-7，永康市鉑歐五金制品有限公司；冷凍干燥機(jī)，SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 化橘紅鮮果精油萃取工藝流程

化橘紅果皮→冷凍干燥→粉碎過(guò)篩→超臨界CO2萃取→化橘紅精油

1.3.2 操作要點(diǎn)

將化橘紅鮮果果皮削下，冷凍干燥48 h，粉碎過(guò)30目篩，稱取質(zhì)量記為m1，放入萃取釜，并將萃取釜兩端塞入脫脂棉準(zhǔn)備萃取。檢查所有閥門為關(guān)閉狀態(tài)后，開啟恒溫槽降溫，當(dāng)溫度低于室溫10 ℃左右時(shí)，開啟CO2鋼瓶閥門和空壓機(jī)，待穩(wěn)定后開啟萃取釜閥門，設(shè)置一定的溫度及壓力，待其恒定后調(diào)整流速并進(jìn)行計(jì)時(shí)，保證萃取時(shí)間大于0.5 h，停機(jī)，開萃取器的出口閥，獲得化橘紅精油（m2）。

1.3.3 精油提取的單因素試驗(yàn)

在固定萃取流量5 L/h、萃取壓力25 MPa、萃取時(shí)間60 min、萃取溫度45 ℃的基礎(chǔ)上，以化橘紅精油得率為指標(biāo)，設(shè)置單因素試驗(yàn)，分別考察萃取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、萃取壓力（10、15、20、25、30 MPa）和萃取溫度（30、35、40、45、50 ℃）對(duì)化橘紅精油得率的影響[12]。

1.3.4 超臨界CO2萃取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)，按照Box-Behnken 試驗(yàn)的要求使用Design-Expert 11，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案[13]。分別用A、B、C 來(lái)表示萃取壓力、萃取溫度及靜態(tài)萃取時(shí)間，并以-1、0、l 分別表示對(duì)應(yīng)變量，以化橘紅精油提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素與水平見(jiàn)表1。

（1）教師對(duì)教學(xué)內(nèi)容劃分出一級(jí)知識(shí)點(diǎn)和相對(duì)獨(dú)立的二級(jí)知識(shí)點(diǎn)，對(duì)每個(gè)二級(jí)知識(shí)點(diǎn)錄制10 分鐘左右的教學(xué)視頻。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 指標(biāo)測(cè)定

精油得率是影響生產(chǎn)成本的重要衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此調(diào)整化橘紅超臨界CO2萃取工藝可以有效提高精油得率，為化橘紅精油質(zhì)量與鮮皮質(zhì)量之比[14]，見(jiàn)式（1）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，使用Design-Expert 8.0.6 對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并利用SPSS 18.0 對(duì)其進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取溫度對(duì)精油得率的影響

由圖1 可知，隨著萃取溫度的升高，化橘紅精油得率先增加后減少，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃時(shí)，精油得率達(dá)到峰值，可達(dá)4.5%，40 ℃時(shí)萃取得率較35 ℃時(shí)的萃取得率有所下降，但仍然大于30 ℃時(shí)的萃取得率。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，香氣成分不斷溢出，得率隨之升高，在40 ℃時(shí)萃取得率有所下降，可能是萃取釜中CO2物理形態(tài)的變化所造成的[15]。因此，萃取溫度選擇35 ℃。

2.1.2 萃取壓力對(duì)精油得率的影響

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)精油得率的影響

由圖3 可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，化橘紅精油得率呈現(xiàn)先上升后略微下降的趨勢(shì)；當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，精油得率最大，達(dá)4.3%；萃取2 h 時(shí)，精油得率變化不大，說(shuō)明萃取時(shí)間的延長(zhǎng)已經(jīng)無(wú)法增加精油得率，而且萃取時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)將化橘紅中的黃酮類物質(zhì)如柚皮苷提取出來(lái)，影響化橘紅精油的萃取[17]。因此萃取時(shí)間選擇1.5、2.0、2.5 h 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)萃取參數(shù)設(shè)定

在單因素試驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上，選取對(duì)化橘紅精油萃取得率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，得到Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平編碼表。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2（見(jiàn)下頁(yè)）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

2.2.2 建立數(shù)學(xué)模型及方差分析

根據(jù)表2 的試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 11 軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，可以通過(guò)以下二階多項(xiàng)式方程的多元回歸得到預(yù)測(cè)的精油產(chǎn)率，所得回歸方程為Y=-63.704+2.355A+1.279B+8.983C+0.004AB-0.067AC+0.019BC-0.032A2-0.027B2-1.829C2。其中，A、B、C 分別為測(cè)試變量的編碼因子。由表3 可知，模型P＜0.000 1，小于0.05，差異極顯著，表明模型具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]；模型F=99.18，表明該模型具有顯著性，且由于噪聲只有0.01%的可能性會(huì)出現(xiàn)如此大的F值。失擬項(xiàng)P=0.053，表明不顯著，說(shuō)明該模型失擬因素不存在；R2=0.992 2，表明該因素中有99.22%影響了響應(yīng)值變化；預(yù)測(cè)的R2為0.895，與調(diào)整后的R2為0.982 2 相對(duì)差異不大，且均大于0.80，表明該模型擬合程度符合標(biāo)準(zhǔn)，因此回歸方程可用于對(duì)超臨界CO2萃取化橘紅精油條件進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]。

根據(jù)表3 中F值可知，化橘紅精油收率的影響因子從大到小為B 萃取壓力、A 萃取溫度、C 萃取時(shí)間。由P值可知，A、B、BC、A2、B2、C2極顯著影響化橘紅精油得率（P＜0.01），AC、AB、C 顯著影響化橘紅精油得率（P＜0.05）。

表3 二元多項(xiàng)式模型的預(yù)估回歸系數(shù)和方差數(shù)據(jù)分析（ANOVA）Table 3 Predicted regression coefficients for binary polynomial models and variance data analysis (ANOVA)

2.2.3 多因素間交互作用分析

根據(jù)回歸方程利用Design-Expert 11 軟件做不同因素的響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖4 所示，圖（a）～（f）表示萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間其中兩個(gè)變量交互作用對(duì)超臨界CO2萃取化橘紅精油提取效果的研究。響應(yīng)曲面越曲折，交互作用越強(qiáng)。因此，圖4（a）為近圓形等高線，說(shuō)明萃取壓力和萃取時(shí)間交互作用較弱；圖4（c）（e）等高線較陡，說(shuō)明萃取時(shí)間和萃取溫度之間、萃取時(shí)間和萃取壓力之間交互作用明顯；圖4（b）為響應(yīng)面弧度明顯，而圖4（d）（f）響應(yīng)面較為平緩，說(shuō)明萃取溫度和萃取壓力對(duì)化橘紅精油得率影響較大，而萃取時(shí)間對(duì)精油得率影響較小。綜上，交互作用顯著的是A 萃取溫度與B 萃取壓力，此結(jié)果與表3結(jié)果相同。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)超臨界CO2萃取的方法提取化橘紅精油，分析萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)化橘紅萃取率的影響，建立回歸方程模擬實(shí)驗(yàn)并根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在各因素的方差分析中表明：萃取壓力與萃取溫度對(duì)化橘紅精油得率影響達(dá)極顯著水平；在多因素交互分析中，萃取溫度與萃取時(shí)間的交互作用顯著，其他兩個(gè)變量?jī)蓛山换プ饔枚疾伙@著；使用Design-Expert 11 研究不同條件下化橘紅精油提取效果的最佳工藝為萃取溫度36.22 ℃，萃取壓力26.75 MPa，萃取時(shí)間1.92 h，化橘紅精油收率預(yù)測(cè)值為4.68‰。根據(jù)操作試驗(yàn)的可行性，將實(shí)施條件修改為萃取溫度36 ℃，萃取壓力27 MPa，萃取時(shí)間1.9 h，并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到化橘紅精油的平均收率為4.53‰，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果一致[20]。

目前，超臨界CO2萃取得到的有效成分通常具有較高的藥理活性,但部分研究對(duì)象藥理活性與其較高的得率不成正比，因此需進(jìn)一步純化解析化橘紅藥材香氣成分。在此基礎(chǔ)上，還需結(jié)合功效做相應(yīng)的提取工藝研究和設(shè)備設(shè)計(jì)優(yōu)化應(yīng)用于生產(chǎn)，為今后綜合利用開發(fā)化橘紅超臨界萃取物提供科學(xué)依據(jù)。