張露婷, 劉櫸元, 趙雯, 3, 楊曄銘, 馮荻, 蔡冬燕, 楊銘, 張健

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100048；2.北京工商大學(xué), 北京 100048；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司, 呼和浩特 010110）

0 引言

人體口腔內(nèi)定植有約700種微生物, 它們“把守”著人體消化道的入口, 是人體的第二大共生菌群[1]。這些微生物與食物、口腔分泌物和免疫系統(tǒng)共同影響和調(diào)節(jié)口腔微環(huán)境, 與人體的口腔健康和多種疾病相關(guān)[2]?？谇痪菏Ш馐驱x齒和牙周疾病的直接誘因[3]與口腔癌發(fā)病相關(guān)[4]。一定條件下, 口腔菌群進(jìn)入下游消化道, 會(huì)改變腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)[5], 引起和加速Ⅰ型糖尿病[6]、食道癌[7]、腸炎[8]、便秘[9]、結(jié)腸癌[10]、胰腺癌[11]和肝病[12]的發(fā)生和發(fā)展?？谇痪哼M(jìn)入血液, 還會(huì)誘發(fā)局部或周身免疫反應(yīng)[13]；另外, 口腔菌群代謝產(chǎn)生的亞硝酸鹽和氮氧化物能夠維持血壓穩(wěn)定, 是高血壓治療的潛在新靶點(diǎn)[14]。因此, 明確口腔菌群及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律, 調(diào)控口腔菌群組成和代謝成為改善宿主健康和相關(guān)疾病治療的新策略[15]。

高糖食物是影響口腔菌群的主要因素之一[16]。2019年, 國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《健康口腔行動(dòng)方案（2019-2025年）》指出“口腔健康是全身健康的重要組成部分”, 強(qiáng)調(diào)減少高糖食品攝入[17]。其中“糖”指的是食品加工中常用的蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖等高熱量甜味劑。研究發(fā)現(xiàn), 含有這些糖類的食物在進(jìn)入口腔后, 會(huì)被變異鏈球菌和血鏈球菌等微生物利用, 合成包覆于牙齒和口腔黏膜表面的生物膜[18], 隔絕氧氣, 促使定植于生物膜下的產(chǎn)酸厭氧菌迅速繁殖, 最終形成口腔病原菌群落, 誘發(fā)齲齒和牙周炎等疾病[19]。這一過程中, “高糖食物促進(jìn)生物膜形成、打破產(chǎn)酸微生物和產(chǎn)堿微生物（如唾液鏈球菌和內(nèi)氏放線菌）數(shù)量與組成的平衡”是誘發(fā)宿主多種口腔疾病的原因[20]。研究人員還發(fā)現(xiàn)蔗糖的口腔菌群破壞性強(qiáng)于單糖, 二者混合對(duì)口腔菌群的破壞更強(qiáng), 更易誘發(fā)牙齒和口腔疾病[21]。

益生菌同樣喜歡“吃”糖, 具有競(jìng)爭(zhēng)性消耗碳源、分泌抗菌肽、抑制口腔病原菌繁殖和破壞生物膜形成的功能[22], 因此在高糖食物中加入益生菌, 通過其對(duì)口腔菌群的調(diào)節(jié)功能, 減少和防治高糖食物誘發(fā)的口腔疾病成為領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[23]。近期研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌通過在口腔長(zhǎng)期定植（4周）, 能夠降低口腔菌群的整體豐度和變異鏈球菌的數(shù)量[24]。含有雙歧桿菌的口含片可以緩解牙齦炎, 減少牙垢的形成[25]。干酪乳桿菌發(fā)酵飲料能夠抑制口腔變異鏈球菌生長(zhǎng)及其生物膜形成[26]。另外基于12組益生菌與口腔健康的研究結(jié)果顯示, 乳桿菌對(duì)口腔菌群的調(diào)節(jié)和牙周疾病的治療效果最好[27]。

冰淇淋是一種典型的高糖食品, 加工中為了降低漿料冰點(diǎn)和提升甜味, 會(huì)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過15%的蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖或乳糖等高熱量甜味劑, 這導(dǎo)致口腔變異鏈球菌的多種糖基轉(zhuǎn)移酶同時(shí)被激活、高效合成生物膜, 極易形成口腔病原菌群落。本研究利用篩選出的具有較強(qiáng)變異鏈球菌及生物膜抑制活性的植物乳桿菌K25[28]和鼠李糖乳桿菌GG, 分別發(fā)酵制作酸奶冰淇淋?？疾旄缓欠值囊嫔苛軐?duì)口腔菌群組成和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌GG菌株實(shí)驗(yàn)室保藏, 分離自市售伊利低溫酸乳；植物乳桿菌K25實(shí)驗(yàn)室保藏, 分離自西藏靈菇；口腔致病菌變異鏈球菌1.3771購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

生牛乳, 北京大興黎明奶牛場(chǎng)；脫脂乳粉, 恒天然有限公司；稀奶油, 雀巢(中國(guó))有限公司；白砂糖、瓜爾豆膠、卡拉膠、羥甲基纖維素鈉, 河北百味生物科技有限公司(食品級(jí))；單雙硬脂酸甘油酯、雙乙酰酒石酸酯, 丹尼斯克(中國(guó))有限公司；BHI液體培養(yǎng)基, 海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21GⅢ立式高速冷凍離心機(jī), 日本HITACHI公司；MLS－3750高壓蒸汽滅菌器, 日本三洋公司；U3900紫外分光光度計(jì), 日本HITACHI公司；S20數(shù)顯pH計(jì), 梅特利－托利多儀器有限公司；DV－III Ultra黏度計(jì), 美國(guó)Brookfield公司；THZ－D電熱恒溫培養(yǎng)箱, 上海一恒儀器科技有限公司；DNA提取試劑盒, 德國(guó)Qiagen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 益生菌冰淇淋制作

冰淇淋分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 基礎(chǔ)配料相同, 見表1, 區(qū)別為普通冰淇淋組未添加益生菌、K25冰淇淋添加植物乳桿菌K25（活菌數(shù)8.48 log cfu/mL）、LGG冰淇淋添加鼠李糖乳桿菌GG（活菌數(shù)8.65 log cfu/mL）, 流程如下：

表1 冰淇淋基礎(chǔ)配料表

漿料→均質(zhì)（壓力15 MPa）→巴氏殺菌（72℃, 5 min）→降溫（37～40℃）→添加益生菌（接種量1%）→發(fā)酵（37℃, 6 h）→老化（4℃, 4 h）→凝凍（-5～8℃, 15～20 min）→硬化（-25℃, 5 h）。

1.3.2 冰淇淋理化指標(biāo)的測(cè)定

冰淇淋理化指標(biāo)檢測(cè)方法參考之前實(shí)驗(yàn)方法[28], 略有修改如下。

pH值的測(cè)定, 取10 g冰淇淋漿料樣品, 加入20 mL去離子水, 充分混勻, 加入兩滴酚酞指示劑, 用標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.1 mol/L NaOH滴定。滴定酸度（°T）為1 g冰淇淋漿料消耗濃度為0.1 mol/L NaOH的毫升數(shù), 消耗1 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH相當(dāng)于1 °T。pH采用pH計(jì)測(cè)定。

冰淇淋中還原糖、脂肪和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB5413-2010中的乳制品檢測(cè)方法, 方法如下：

還原糖含量測(cè)定方法：冰淇淋中的還原糖（乳糖等）經(jīng)提取后, 利用高效液相色譜柱分離, 用示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè), 外標(biāo)法進(jìn)行定量。乳糖的含量按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

乳糖含量/%=（乳糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度×樣品定容體積×100×乳糖標(biāo)準(zhǔn)液稀釋倍數(shù)）/（冰淇淋質(zhì)量×1000）

脂肪含量測(cè)定方法：用乙醚和石油醚抽提冰淇淋的堿水解液, 通過蒸餾或蒸發(fā)去除溶劑, 測(cè)定溶于溶劑中的抽提物的質(zhì)量, 根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

脂肪含量/%=（冰淇淋中抽提物質(zhì)量-水中抽提物質(zhì)量）/冰淇淋質(zhì)量×100

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法：先分別測(cè)定出冰淇淋總的總固體含量、脂肪含量, 再用總固體減去脂肪和蔗糖等非乳成分含量, 根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

蛋白質(zhì)含量/%=冰淇淋中總固體含量-冰淇淋中脂肪和蔗糖含量

膨脹率的測(cè)定, 分別稱取100 mL體積的冰淇淋漿料和等體積的成品, 根據(jù)下列公式對(duì)軟冰淇淋的膨脹率進(jìn)行計(jì)算：

膨脹率/%=（冰淇淋漿料質(zhì)量-相同體積冰淇淋質(zhì)量）/相同體積冰淇淋質(zhì)量×100

1.3.3 冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)和生物膜形成的影響

本部分參考之前的研究方法[29], 略作修改。簡(jiǎn)述如下, 將發(fā)酵后的冰淇淋漿料離心獲得上清液, 0.22μm濾膜過濾, 取5 mL過濾后上清與等體積的BHI液體培養(yǎng)基混合, 將變異鏈球菌以2%比例接種于混合培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h, 每4 h取樣檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。每組3平行, 繪制變異鏈球菌生長(zhǎng)曲線, 確定冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)特性的影響。

利用BHI液體培養(yǎng)基將活化好的變異鏈球菌的菌液濃度調(diào)整到1.0×108CFU/mL, 取100μL過濾后的冰淇淋上清液與等體積BHI菌液混合, 加入到96孔微量板中。37℃培養(yǎng)24 h后, 棄掉孔中培養(yǎng)液, 加入等體積0.1 mol/L PBS清洗3次, 棄掉PBS, 加入200μL 95%甲醇, 固定15 min, 棄掉, 室溫下自然晾干。每孔加入150μL 2%的結(jié)晶紫溶液, 染色10 min, 用去離子水清洗3次, 室溫下自然晾干。加入200μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)33%的冰醋酸將結(jié)晶紫洗脫下來, 取150μL轉(zhuǎn)入新的96孔板中, 630 nm測(cè)OD值, 生物膜抑制率計(jì)算公式如下（以BHI液體培養(yǎng)基為對(duì)照）。

生物膜抑制率（%）=（1-OD樣品/OD對(duì)照）×100

1.3.4 冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響

參照文獻(xiàn)[28]中的方法進(jìn)行細(xì)菌的黏附性實(shí)驗(yàn)。取2 mL冰淇淋漿料上清液和2 mL變異鏈球菌菌懸液混勻后, 加入到傾斜30 °的玻璃試管中, 靜置, 37℃厭氧培養(yǎng)24 h。分別收集試管中緊密黏附、松散黏附和未黏附于試管壁的細(xì)菌, 收集方法參考周智等[30]的方法。將收集好的菌懸液分別加入96孔微量板中, 每孔加200μL, 用PBS調(diào)零, 用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔630 nm波長(zhǎng)處的吸光度, 空白BHI培養(yǎng)基和冰淇淋漿料上清混合液為對(duì)照, 按下式計(jì)算細(xì)菌黏附率。

式中：A緊密黏附菌懸液的吸光度, A非+松非黏附和松散黏附菌懸液的吸光度。

1.3.5 益生菌冰淇淋對(duì)人體口腔菌群的影響

研究選取12位22～24周歲健康的受試者, 無口腔和常見代謝性疾?。ǜ哐獕骸⑻悄虿?、胃腸炎等）, 受試前30 d用相同的漱口水和牙膏每日早晚清潔口腔, 受試期間禁止食用其它冷飲類及高糖（折合蔗糖含量＞7%）食品或補(bǔ)充劑。一周內(nèi)不進(jìn)食乳制品與發(fā)酵食品, 受試者在樣品收集當(dāng)天清晨不清潔口腔、不進(jìn)食, 樣品收集時(shí)間為早8點(diǎn), 分別在未食用冰淇淋、連續(xù)食用普通冰淇淋7 d后、連續(xù)食用K25冰淇淋7 d后、連續(xù)食用LGG冰淇淋7 d后收集唾液樣品2 mL凍藏, 用于提取基因組。實(shí)驗(yàn)過程中, 受試者每人每天一次性進(jìn)食150～200 mL冰淇淋, 在連續(xù)食用一種冰淇淋7 d后, 要求受試者停止進(jìn)食冰淇淋、恢復(fù)正常飲食至少10 d, 進(jìn)入下一組冰淇淋實(shí)驗(yàn)。樣品編號(hào)見表2。

表2 受試者信息及樣品編號(hào)

唾液微生物DNA樣本的提取：唾液樣品的DNA的方法參照DNA提取試劑盒的指示說明進(jìn)行。具體操作流程為：取1～100μL唾液樣品于1.5 mL離心管中, 加入10μL細(xì)胞裂解液與100μL緩沖液, 充分混勻。56℃孵育10 min, 離心除水滴。加入50μL乙醇, 渦旋15 s, 室溫孵育3 min后離心除水滴。將所有溶解物轉(zhuǎn)移至QIAump MinElute Column中, 離心。加入500μL緩沖液洗滌兩次后, 14 000 rpm離心3 min, 使膜充分干燥。加入50μL洗脫液, 室溫下孵育5 min, 14 000 rpm離心1 min, 確保DNA完全洗脫。

16S rDNA V3～V4區(qū)片段擴(kuò)增及Illumina雙末端檢測(cè)：以稀釋后的基因DNA為模板, 使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit進(jìn)行PCR, 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。回收后, 利用Thermo NanoDrop 2 000紫外微量分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢, Qubit進(jìn)行文庫(kù)定量。對(duì)樣品進(jìn)行混合后, Illumina HiSeq PE250進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。測(cè)序及序列比對(duì)分析工作委托銳羿生物科技有限公司完成。微生物多樣性數(shù)據(jù)分析采用在線分析工具M(jìn)icrobiome－Analyst（https://www.microbiomeanalyst.ca/）完成。

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理, P＜0.05表示差異顯著。應(yīng)用CANOCO 4.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)口腔菌群進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis, RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 K25益生菌冰淇淋的基本理化特性

冰淇淋產(chǎn)品的基本組成、酸度、膨脹率等指標(biāo)是評(píng)價(jià)益生菌冰淇淋產(chǎn)品的主要指標(biāo)[31]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)冰淇淋產(chǎn)品理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表3所示。K25和LGG冰淇淋與普通冰淇淋的蛋白質(zhì)和脂肪組成無顯著差異（P＞0.05）, 還原糖含量分別下降了2.85%和3.68%, 表明益生菌發(fā)酵會(huì)消耗漿料中的糖分, 相應(yīng)的增加冰淇淋漿料中的酸含量, K25和LGG冰淇淋比普通冰淇淋的滴定酸度分別高12 °T和17 °T。K25與LGG冰淇淋的膨脹率比普通冰淇淋高8.07%和13.54%, 這主要是因?yàn)?株乳桿菌高產(chǎn)黏性胞外多糖[32], 多糖會(huì)與乳蛋白弱交聯(lián)[33], 增加漿料的黏度, 提高膨脹率[34]。目前, 益生菌冰淇淋的菌株添加方式有兩種, 一為接種發(fā)酵, 另一種為添加含活菌的菌粉, 前者對(duì)冰淇淋品質(zhì)有一定影響如本實(shí)驗(yàn), 后者大批量生產(chǎn)成本較高[35]。K25和LGG冰淇淋中的活菌數(shù)分別為8.48 log cfu/mL和8.65 log cfu/mL（P＜0.05）, 符合益生菌食品要求。

表3 冰淇淋理化指標(biāo)

2.2 冰淇淋對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)特性的影響

變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是人體口腔的主要病原微生物, 通過分泌胞外多糖和黏蛋白與Bifidobacterium spp., Scardovia spp.和Actinomyces spp.等共同在口腔內(nèi)形成病原生物膜, 黏附于牙齒、舌頭和口腔表面, 是導(dǎo)致齲齒和牙周炎的主要病原微生物[36]。研究將冰淇淋漿料上清與變異鏈球菌培養(yǎng)液混合, 考察了3種冰淇淋漿料上清對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)特性的影響。結(jié)果如圖1所示, K25和LGG冰淇淋均能不同程度地延緩變異鏈球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 減慢變異鏈球菌的增殖速率, 降低變異鏈球菌活菌數(shù)量。相比普通冰淇淋, K25冰淇淋和LGG冰淇淋組在變異鏈球菌培養(yǎng)終點(diǎn)（32 h）的OD值分別為下降了22%和38%（P＜0.05）, K25冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌抑制率低于其已報(bào)道MRS培養(yǎng)上清的抑制活性（～70%）[28]。這可能與培養(yǎng)基質(zhì)的組成和發(fā)酵程度有關(guān), 冰淇淋中糖含量較高, 變異鏈球菌喜糖, 且冰淇淋漿料發(fā)酵時(shí)間6 h, 短于之前的16～18 h（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)證明K25和LGG發(fā)酵的冰淇淋漿料具有較強(qiáng)的變異鏈球菌生長(zhǎng)抑制活性。

圖1 冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

2.3 冰淇淋對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響

口腔菌群主要存在于口腔表面的生物膜中[37], 變異鏈球菌借助生物膜黏附于口腔和牙齒表面形成病原微生物群落[38]。研究考察了冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響, 結(jié)果如圖2所示。3種冰淇淋對(duì)變異鏈球菌的生物膜抑制率均為負(fù)值, K25冰淇淋組和LGG冰淇淋組生物膜量比普通冰淇淋組分別降低了22.3%和17.15%（P＜0.05）, 表明食用3種冰淇淋都會(huì)導(dǎo)致口腔變異鏈球菌生物膜的形成, 但K25冰淇淋和LGG冰淇淋生物膜形成量比普通冰淇淋少。這與已報(bào)道的培養(yǎng)基中K25菌株生物膜正向抑制率約40%～60%存在較大差異[28]。變異鏈球菌生物膜的形成與培養(yǎng)基質(zhì)中糖的含量和組成有關(guān)。研究顯示, 雖然過高的糖濃度（40%）對(duì)變異鏈球菌生物膜的合成有抑制作用, 但在0～20%糖濃度下, 變異鏈球菌能夠高效合成生物膜[39], 且隨著糖含量的增加, 變異鏈球菌的抗逆性逐漸增強(qiáng)[40]。Nagasawa研究還發(fā)現(xiàn), 果糖和蔗糖在誘導(dǎo)變異鏈球菌生物膜合成上具有協(xié)同效應(yīng)[41], 通過同時(shí)刺激變異鏈球菌葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá), 加速生物膜的合成[42]。本實(shí)驗(yàn)冰淇淋漿料上清中果糖、蔗糖和乳糖總質(zhì)量百分比達(dá)17%, 遠(yuǎn)高于報(bào)道的培養(yǎng)基生物膜抑制實(shí)驗(yàn)中2%的糖濃度, 這可能是導(dǎo)致差異的主要原因, 該結(jié)果也反映出針對(duì)冰淇淋基質(zhì)研究生物膜形成的必要性。

圖2 冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響

2.4 冰淇淋對(duì)變異鏈球菌表面黏附能力的影響

黏附是變異鏈球菌口腔定植的基礎(chǔ)。3種冰淇淋對(duì)變異鏈球菌光滑表面的黏附影響如圖3所示, 普通冰淇淋漿料中的變異鏈球菌黏附率為61.29%, 高于K25冰淇淋的43.21%和LGG冰淇淋的35.19%。這表明K25和LGG發(fā)酵的冰淇淋漿料能有效降低變異鏈球菌的黏附。黏附于牙齒表面是病原微生物破壞口腔健康的第一步, 口腔醫(yī)學(xué)常采用改變牙齒表面特性的方法降低變異鏈球菌的黏附[43]。益生菌主要通過抑制變異鏈球菌活性和生物膜的形成來降低其黏附能力[44]。K25冰淇淋和LGG冰淇淋降低變異鏈球菌的黏附的結(jié)果與前述二者對(duì)變異鏈球菌及其生物膜抑制活性研究結(jié)果一致。

圖3 冰淇淋漿料對(duì)變異鏈球菌黏附能力的影響

2.5 益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群的影響

為進(jìn)一步明確益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群的影響, 研究采集、分析了12名受試者（A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L）未食用冰淇淋、食用普通冰淇淋、食用K25冰淇淋和食用LGG冰淇淋后人體唾液中細(xì)菌組成和豐度的變化, 研究實(shí)驗(yàn)分組及樣品詳細(xì)信息見表2。

2.5.1 冰淇淋對(duì)受試者口腔菌群整體影響分析

個(gè)體唾液微生物組具有較好的時(shí)間穩(wěn)定性被證明能有效表征口腔菌群的多樣性[45]。研究對(duì)48個(gè)唾液樣本中的細(xì)菌組16S rDNA的V3-V4區(qū)測(cè)序, 共獲得1752416條reads, 平均36508 reads/樣, OTU數(shù)量801個(gè)。將總量低于4, 流行度（prevalence）低于10%的OTU去除后, 獲得OTU312個(gè), 以下分析皆以處理后的OUT數(shù)據(jù)開展。Chao1、observed_species和稀釋曲線如圖1, 顯示樣品中的絕大部分微生物已經(jīng)被捕獲, 結(jié)果具有代表性。

冰淇淋對(duì)口腔菌群alpha多樣性的影響如圖4(a)所示, 普通冰淇淋組＞未食用冰淇淋組＞K25冰淇淋組＞LGG冰淇淋組, 表明食用普通冰淇淋后口腔菌群的多樣性會(huì)增加, 而食用含有含有益生菌K25或LGG的冰淇淋后口腔菌群的多樣性均降低?？谇痪旱腂eta多樣性（PCoA）分析顯示如圖4(b), Axis1和Axis2在水平和垂直方向分別能夠解釋39%和27.6%的樣品間的菌群差異（P＜0.001）, 正常人口腔菌群（Normal）樣品所示主要沿Axis2分布, 在Axis1水平方向變化較小, 食用普通冰淇淋（IceCream）和K25冰淇淋（K25-IceCream）后樣品主要沿Axis1分布, 表明口腔菌群發(fā)生了顯著改變, LGG冰淇淋組（LGGIceCream）口腔菌群的變化介于二者之間, 略偏向于未食用冰淇淋組人群。益生菌影響口腔多樣性的能力主要與其抑菌譜有關(guān), 抑菌譜廣的益生菌一般會(huì)降低菌群的多樣性。本實(shí)驗(yàn)中的LGG菌株抑菌譜較廣, 對(duì)變異鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌、Candida albicans[46-47]等均具有較好的抑制活性, 因此可以顯著減少口腔細(xì)菌總數(shù), Rungsri等人有關(guān)LGG發(fā)酵乳對(duì)口腔菌群的營(yíng)養(yǎng)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[48]。K25菌株抑菌譜相對(duì)較窄, 目前僅發(fā)現(xiàn)對(duì)變異鏈球菌具有較好的抑制活性, 這可能是造成LGG冰淇淋組口腔菌群多樣性降低的幅度大于K25冰淇淋組的原因。

基于樣品的Bray-Curtis距離的Ward聚類法分析結(jié)果也表明, 冰淇淋和益生菌對(duì)受試者口腔菌群具有顯著影響, 不同受試者在食用相同的冰淇淋后口腔菌群表現(xiàn)出了較高的相似性, 如圖4(c)。聚類后將受試樣本分為3層分支4大組, 各組中的樣本吃幾乎都是同一種冰淇淋, 第一層級(jí)分支可將受試樣本分為食用冰淇淋和未食用冰淇淋兩大類, 第二層級(jí)將受試樣本進(jìn)一步分為食用普通冰淇淋和含有K25或LGG益生菌的冰淇淋。一些受試個(gè)體口腔菌群表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性如C1、C2、C3和D3、D4分類后樣本間離較近, 表明不管使用哪種冰淇淋其口腔菌群變化不大, 但總的來看, 冰淇淋和益生菌對(duì)口腔菌群變化起到了關(guān)鍵作用。Belstrm等研究也顯示個(gè)體口腔菌群具有較大的特異性和穩(wěn)定性[45]。

圖4 口腔菌群的整體變化

2.5.2 RDA分析益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群的影響

為了明確菌株和冰淇淋等環(huán)境因素各自對(duì)口腔菌群的影響, 研究采用RDA限制性分析方法研究了植物乳桿菌K25、鼠李糖乳桿菌GG和冰淇淋等各因素對(duì)口腔菌群屬水平的影響, 結(jié)果如圖5所示。Axis1解釋了變量間差異的60.67%, Axis2解釋了20.14%, 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P＜0.05。通過限定在Axis1上的解釋度＞20%, 我們確定了112個(gè)關(guān)鍵的屬。分析它們與食用冰淇淋和益生菌的關(guān)系可發(fā)現(xiàn), 冰淇淋和菌株K25與口腔中絕大多數(shù)的菌群豐度正相關(guān), 表現(xiàn)為大部分菌群分布于二者所在的第一象限, 同理LGG菌株和不食用冰淇淋因素會(huì)降低口腔菌群的豐度, 這與前述alpha多樣性的分析相符。進(jìn)一步比較菌株K25和LGG對(duì)其它菌屬的影響的顯著性（見表4）發(fā)現(xiàn), K25對(duì)低豐度菌屬的影響較大, LGG對(duì)高豐度菌屬的影響較大, LGG對(duì)口腔的核心菌群（見表1）中的Veillonella, Streptococcus, Anoxybacillus, Tepidimonas, Porphyromonas和Comamonas有顯著影響（P＜0.05）。另外LGG與Streptococcus豐度負(fù)相關(guān), 顯示LGG益生菌冰淇淋可能對(duì)由Streptococcus mutans引起的口腔菌群失調(diào)和疾病具有一定的干預(yù)效果[49]。

表4 菌株K25和LGG與口腔菌群（屬）豐度相關(guān)性分析

圖5 益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群影響的冗余分析

2.5.3 益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群的影響模式（門、屬水平）

在明確益生菌和冰淇淋因素對(duì)口腔菌群組成和多樣性的影響后, 我們嘗試通過比較受試者個(gè)體口腔高豐度菌在門和屬水平上的變化, 研究益生菌冰淇淋對(duì)口腔菌群的影響模式。由圖6所示, 12名受試者不同時(shí)間點(diǎn)口腔菌群由15個(gè)菌門構(gòu)成, 其中豐度較高的菌門有7個(gè), 占口腔菌群總豐度的98.76%, 依次為Firmicutes（34.03%）, Proteobacteria（26.23%）, Bacteroidetes（19.18%）, Actinobacteri(7.08%), Deinococcus（5.89%）, Fusobacteria(3.99%)和Candidatus（2.36%）。Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteri, Deinococcus_Thermus, Fusobacteria, Candidatus_Saccharibacteria。觀察12名受試者各菌門豐度變化發(fā)現(xiàn), 食用普通冰淇淋和K25冰淇淋后口腔中的Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria和Deinococcus菌門的豐度增加, Bacteroidetes和Candidatus菌門的豐度降低；而食用LGG冰淇淋后口腔中的Proteobacteria菌門豐度增加, 而Firmicutes, Bacteroidetes和Candidatus菌門豐度降低, 即LGG冰淇淋具有獨(dú)特的菌群調(diào)節(jié)模式。另外, LGG菌株自身為Firmicutes菌門, 攝入富含該菌株的冰淇淋后, Firmicutes豐度反而降低, 表明LGG冰淇淋一定對(duì)同為Firmicutes菌門的其它菌株產(chǎn)生了強(qiáng)抑制作用。

圖6 口腔菌群組成和相對(duì)豐度的柱狀堆積圖（門）

研究證明Firmicutes在口腔組織表面和唾液微生物群落中占主導(dǎo)地位, 其次是Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteri和Fusobacteria[50]。門水平的變化是由專性厭氧菌屬Fusobacterium, Prevotella,和Treponema等相對(duì)豐度的增加所驅(qū)動(dòng)。牙菌斑分類群分布更為均勻, 主 要 為Firmicutes, Bacteriodetes,, Actinobacteria, Proteobacteria和Fusobacteria等菌門。本研究受試者食用益生菌冰淇淋后口腔高豐度菌門與之保持一致。

口腔菌群在屬和種水平上與健康和多種疾病相關(guān)[51]。因此, 我們分析了益生菌冰淇淋對(duì)12位受試者口腔高豐度菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%）的影響, 如圖7所示, 高豐度菌屬有15個(gè), 占口腔菌群總豐度的87.03%, 依次為Streptococcus（12.06%）, Veillonella（11.62%）, Prevotella（11.41%）, Haemophilus（10.30%）, V29（8.58%）, Thermus（5.77%）, Neisseria（5.26%）, Rothia（4.39%）, Anoxybacillus（4.30%）, Tepidimonas（2.69%）, Porphyromonas（2.63%）, Saccharibacteria（2.23%）, Fusobacterium（2.23%）, Actinomyces（1.79%）和Leptotrichia（1.77%）。結(jié)合表4可知, K25冰淇淋在屬水平上對(duì)高豐度菌屬的影響不顯著；而LGG冰淇淋能顯著降低Veillonella和Streptococcus的豐度, 增加Anoxybacillus和Tepidimonas豐度（P＜0.05）, 顯示出在屬水平上也具有較強(qiáng)的口腔菌群調(diào)節(jié)能力, 這與前述RDA分析的結(jié)果一致。研究表明, Streptococcus是與口腔健康相關(guān)的主要菌屬, 這與先前對(duì)口腔健康個(gè)體唾液樣本進(jìn)行的研究一致[52]。對(duì)Streptococcus和Veillonella兩個(gè)高豐度菌屬的抑制作用解釋了為什么攝入LGG冰淇淋后, Firmicutes菌門豐度反而降低, 因?yàn)?者同屬于Firmicutes菌門, LGG對(duì)Veillonella和Streptococcus的強(qiáng)抑制作用抵消了自身對(duì)Firmicutes菌門豐度的貢獻(xiàn)。本研究采集食用冰淇淋后不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行菌群分析, 表明食用不同冰淇淋后不同時(shí)間對(duì)于口腔菌群的組成變化沒有顯著差別。Belstrom在研究中也表明, 唾液微生物群的組成基本上沒有變化[53], 即口腔健康與不同的唾液細(xì)菌的特征相關(guān), 與采樣時(shí)間無關(guān)[52,54]。

圖7 口腔菌群組成和相對(duì)豐度的柱狀堆積圖（屬）

盡管口腔菌群構(gòu)成個(gè)體差異較大, 但Veillonella是絕大多數(shù)人口腔中豐度最高的菌群, 這也被眾多研究所證明[55], 它的核心功能是合成眾多口腔菌群生長(zhǎng)必須的血紅素, 對(duì)口腔菌群的穩(wěn)定具有重要作用[56]。LGG冰淇淋對(duì)該菌屬具有顯著抑制作用, 解釋了其較強(qiáng)的降低口腔菌群多樣性的作用。Porphyromonas和Tepidimonas是與牙周炎發(fā)病相關(guān)的菌屬, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia和Treponema denticola被合稱為“Red complex”[57], 可在慢性牙周炎患者口腔同時(shí)分離到3者[58], 其中Porphyromonas gingivalis是3者中的核心病原菌, 它能夠刺激巨噬細(xì)胞, 過度激活固有免疫系統(tǒng), 使其攻擊口腔菌群, 導(dǎo)致口腔菌群紊亂和炎癥[59]。Anoxybacillus是口腔的常見菌屬, 在母體的口腔、羊水和腸道中具有較高豐度, 是嬰幼兒早期獲得的口腔菌群之一[60], 但其與人體健康和疾病的關(guān)系還不明確, Jiang等在健康豬口腔中發(fā)現(xiàn)了大量該菌屬[61]。LGG冰淇淋在多個(gè)受試者中, 變現(xiàn)出對(duì)上述高豐度核心菌群的相似影響規(guī)律, 顯示其能夠定向的調(diào)節(jié)口腔菌群, 尤其對(duì)齲齒和牙周炎相關(guān)菌群可能具有較好的干預(yù)能力。

3 結(jié)論

體外研究顯示, K25冰淇淋和LGG冰淇淋均能顯著降低變異鏈球菌活性、抑制其生物膜形成和表面黏附。冰淇淋能夠在短時(shí)間內(nèi)顯著改變食用者口腔的菌群結(jié)構(gòu)導(dǎo)致多樣性增加, 僅LGG能有效降低冰淇淋對(duì)口腔菌群多樣性的影響, 食用K25冰淇淋和普通冰淇淋會(huì)增加口腔菌群多樣性。Beta多樣性結(jié)果也顯示LGG冰淇淋組的口腔菌群結(jié)構(gòu)與未食用冰淇淋組相近。RDA分析顯示, K25冰淇淋對(duì)低豐度菌屬影響更大, 而LGG冰淇淋對(duì)高豐度菌屬影響更大（P＜0.05）, LGG主要通過降低核心菌Veillonella的豐度來調(diào)節(jié)口腔菌群?？偟膩砜? 含有益生菌K25和LGG的冰淇淋表現(xiàn)出了定向調(diào)節(jié)口腔菌群能力, 對(duì)齲齒和牙周炎相關(guān)菌群（Streptococcus等）表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用, 其中LGG的作用更強(qiáng)。