趙夢(mèng)迪,趙文革
褪黑素為哺乳動(dòng)物分泌的一種吲哚類激素,在位于間腦腦前丘和丘腦之間的松果體中由色氨酸經(jīng)羥化、脫羧、乙?;凹谆襟E合成[1]。褪黑素的合成與分泌活動(dòng)與光暗環(huán)境有關(guān),光照環(huán)境會(huì)抑制褪黑素的合成及分泌,而黑暗環(huán)境則相反,通常凌晨2-3點(diǎn)時(shí)褪黑素的分泌量達(dá)到頂峰[2]。褪黑素具有多種對(duì)人體有益的生理功能,如清除與人體衰老直接相關(guān)的自由基以延緩衰老;發(fā)揮抗氧化作用以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;激活免疫細(xì)胞的增殖以調(diào)節(jié)免疫;調(diào)節(jié)生物節(jié)律以改善睡眠等[3]。因此,維持正常作息、避免夜晚時(shí)處于光照的環(huán)境對(duì)于維持正常的生物節(jié)律十分關(guān)鍵。褪黑素與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系十分密切,對(duì)于有睡眠障礙及運(yùn)動(dòng)損傷的運(yùn)動(dòng)員,褪黑素都有很好的調(diào)節(jié)及促進(jìn)恢復(fù)作用。
運(yùn)動(dòng)疲勞是指由于機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或強(qiáng)度過(guò)大而引起的機(jī)體無(wú)法維持原運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從而致使身體機(jī)能下降的一種生理現(xiàn)象,這種運(yùn)動(dòng)疲勞也稱為中樞運(yùn)動(dòng)疲勞[4]。運(yùn)動(dòng)疲勞是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和康復(fù)領(lǐng)域的研究重點(diǎn),通常將運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)制總結(jié)為四大理論體系,包括中樞疲勞理論、外周疲勞理論、神經(jīng)-肌肉接點(diǎn)疲勞理論與綜合性運(yùn)動(dòng)疲勞理論[5],其中研究較為深入的為中樞疲勞理論和外周疲勞理論,中樞疲勞理論是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出抑制信號(hào)使身體運(yùn)動(dòng)能力下降從而保護(hù)機(jī)體免受損傷;外周疲勞理論是指因肌肉組織代謝產(chǎn)物堆積而引起肌肉疲勞,無(wú)論是中樞疲勞還是外周疲勞均會(huì)引起機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的下降。提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力、緩解疲勞的發(fā)生是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與康復(fù)領(lǐng)域研究的核心問(wèn)題,為提出行之有效的方法,專家學(xué)者們從多個(gè)方面深入探究造成運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的因素[6],主要包括神經(jīng)遞質(zhì)失衡、自由基堆積、乳酸代謝堆積、支鏈氨基酸濃度降低等[7]。其中,神經(jīng)遞質(zhì)失衡與自由基堆積被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生中較為重要的因素,因此,緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的研究多基于此。
當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)保護(hù)性抑制時(shí),神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)降低神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性,主要表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)失衡,從而加快運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。研究表明褪黑素可能會(huì)對(duì)機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)的含量存在的影響,即通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[8-9],但其對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的具體影響研究不足。此外,褪黑素還會(huì)作為細(xì)胞內(nèi)的自由基清除劑以防止或延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生,主要包括清除超氧化物陰離子、游離氧分子、過(guò)氧化氫陰離子等[10]。本文就褪黑素如何影響運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生及其機(jī)制進(jìn)行探究。
成年雄性SD大鼠30只,體重170g~200g之間(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)。大鼠正常分組(3只/籠),成年雄性SD大鼠飼養(yǎng)于首都師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大鼠飼養(yǎng)房,自由飲水,飲食,溫度為18~24℃,空氣相對(duì)濕度40%~60%,正常晝夜節(jié)律。
1.2.1 褪黑素處理
動(dòng)物分組及給藥:將30只SD大鼠隨機(jī)平均分配為2組(N=15):實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組:將20mg褪黑素先溶于0.5mL的無(wú)水乙醇中,取0.5mL上述溶液加入100mL的去離子水溶解飼喂大鼠,即飲用水中含有200μg/mL褪黑素;對(duì)照組:采用含有0.5mL無(wú)水乙醇的去離子水飼喂,其余條件均相同。
1.2.2 一次性力竭疲勞模型的建立
實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠在飼喂21天后,將兩組大鼠應(yīng)用平板跑臺(tái)一次性力竭跑步模型處理,即大鼠每天測(cè)試前需進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練(1次/天,共3天),該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度低于力竭運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,待大鼠恢復(fù)2天后進(jìn)行一次性力竭跑步實(shí)驗(yàn),即treadmill平板跑臺(tái)法,基本流程為:跑步時(shí)速:15cm/s,時(shí)間:15min;隨后,跑步時(shí)速:25cm/s,時(shí)間:15min;最后跑步時(shí)速保持在35cm/s直至力竭并記錄最終運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間。
1.2.3 腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)
兩組大鼠力竭跑步實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用斷頭法獲取腦組織,置于冰上并迅速分離皮質(zhì)、下丘腦、海馬、紋狀體。取部分樣品采用高氯酸提取法充分勻漿后,4000g/min離心5min,離心取上清液,-80℃凍存,采用高效液相色譜法分析各部分腦組織內(nèi)NE、DA、5-HT和DOPAC的含量。
所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用t檢驗(yàn)分析,P<0.05為顯著性差異,P<0.01為極顯著性差異。
兩組大鼠經(jīng)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后,測(cè)定最終運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間,結(jié)果顯示褪黑素處理組較對(duì)照組跑步持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng),力竭出現(xiàn)時(shí)間明顯延后。褪黑素處理組大鼠跑步力竭時(shí)間為232.39±34.38min,對(duì)照組跑步力竭時(shí)間為187.17±21.08min(P<0.01)。
2.2.1 褪黑素處理對(duì)NE的影響
在對(duì)照組中NE的相對(duì)含量為4058.99±955.15,褪黑素處理組為8401.52±2581.32,褪黑素處理后,NE含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。
圖1 運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間
2.2.2 褪黑素處理對(duì)DA的影響
在對(duì)照組中DA的相對(duì)含量為3.95±1.84,褪黑素處理組為7.56±2.80,褪黑素處理后,DA含量顯著提于對(duì)照組(P<0.05)。
圖3 DA相對(duì)含量
2.2.3 褪黑素處理對(duì)5-HT的影響
在對(duì)照組中5-HT的相對(duì)含量為366.22±95.33,褪黑素處理組為131.75±66.51,褪黑素處理后,5-HT含量顯著降低(P<0.05)。
圖4 5-HT相對(duì)含量
2.2.4 褪黑素處理對(duì)DOPAC的影響
在對(duì)照組中DOPAC相對(duì)含量為37.56±27.39,褪黑素處理組為59.49±16.49,兩組DOPAC含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
圖5 DOPAC相對(duì)含量
實(shí)驗(yàn)表明,褪黑素處理會(huì)顯著延長(zhǎng)SD大鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。這與其他文獻(xiàn)中的報(bào)道一致,如大鼠的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中,褪黑素的應(yīng)用明顯延長(zhǎng)了大鼠的游泳時(shí)間[11],研究表明這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性相關(guān)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)遞質(zhì)和受體之間存在動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)機(jī)體經(jīng)過(guò)一段時(shí)間特定強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后,神經(jīng)遞質(zhì)的失衡會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生,相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)包括多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、5-羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿(Ach)、谷氨酸(GA)等。因此,本實(shí)驗(yàn)將NE、DA、5-HT、DOPAC作為檢測(cè)目標(biāo),分析褪黑素處理延緩運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的機(jī)制。
3.2.1 多巴胺結(jié)果分析
多巴胺是神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)機(jī)體運(yùn)動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì),由酪氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)化而來(lái),重要的代謝產(chǎn)物包括去甲腎上腺素和二羥苯乙酸[13]。因此多巴胺代謝水平的高低直接影響到其他被檢測(cè)的神經(jīng)遞質(zhì)的含量,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng),去甲腎上腺素的含量與多巴胺的含量變化趨勢(shì)一致。多巴胺與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系一直是運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明,當(dāng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí),DA及其代謝產(chǎn)物NE濃度均升高[14-15]。這與其作用相關(guān),即DA與NE會(huì)提高神經(jīng)系統(tǒng)興奮、增強(qiáng)肌肉協(xié)調(diào)、升高血糖供給能量等,這在機(jī)體運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中褪黑素處理導(dǎo)致的多巴胺的含量顯著升高,這說(shuō)明褪黑素可能通過(guò)提高多巴胺的含量提高運(yùn)動(dòng)能力,延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。
3.2.2 去甲腎上腺素結(jié)果分析
去甲腎上腺素作為機(jī)體中一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和升血糖激素,在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中會(huì)提高神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性以提高運(yùn)動(dòng)能力,延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間,除此之外,去甲腎上腺素會(huì)提高血糖的含量以提供機(jī)體運(yùn)動(dòng)所需能量[16]。
去甲腎上腺素由多巴胺轉(zhuǎn)化而來(lái),其含量的高低受到多巴胺代謝的影響。同時(shí),去甲腎上腺素又是褪黑素合成的原料,代謝水平的高低直接影響褪黑素的合成。在本實(shí)驗(yàn)中,褪黑素對(duì)大鼠的處理使其去甲腎上腺素含量顯著升高,可能是由于機(jī)體內(nèi)褪黑素含量升高導(dǎo)致的后續(xù)代謝產(chǎn)物對(duì)去甲腎上腺素的合成存在影響,這刺激了去甲腎上腺素的合成。褪黑素通過(guò)影響多巴胺、去甲腎上腺素發(fā)揮作用,促使中樞神經(jīng)持續(xù)興奮從而延緩了神經(jīng)系統(tǒng)的疲勞。
3.2.3 5-羥色胺結(jié)果分析
5-羥色胺是衡量運(yùn)動(dòng)疲勞的標(biāo)志性神經(jīng)遞質(zhì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示褪黑素處理組中5-羥色胺的含量顯著低于對(duì)照組。5-羥色胺作為運(yùn)動(dòng)研究領(lǐng)域的“明星分子”,關(guān)于其在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中的作用及機(jī)制的研究較為廣泛且深入。研究顯示,由于血腦屏障的存在,5-羥色胺只能在腦內(nèi)合成,當(dāng)運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間后,隨著運(yùn)動(dòng)疲勞的出現(xiàn),血液中游離氨基酸含量上升并與色氨酸競(jìng)爭(zhēng)受體位點(diǎn),這使得游離色氨酸含量增加進(jìn)而進(jìn)入腦內(nèi),導(dǎo)致腦內(nèi)5-羥色胺合成含量的升高[17]。腦內(nèi)5-羥色胺含量的增加會(huì)使得大腦皮層抑制性加強(qiáng),降低多種酶的活性,減少ATP的合成量,致使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力降低[18]。采用褪黑素處理大鼠可能通過(guò)抑制腦內(nèi)5-羥色胺的含量從而導(dǎo)致大腦皮層的興奮性增強(qiáng),進(jìn)而延緩了運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。
3.2.4 3,4-二羥苯乙酸結(jié)果分析
3,4-二羥苯乙酸作為多巴胺的代謝產(chǎn)物在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域中的研究較少。我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)褪黑素處理并沒(méi)有改變3,4-二羥苯乙酸的含量,推測(cè)3,4-二羥苯乙酸并不參與運(yùn)動(dòng)疲勞的延緩,因此褪黑素處理延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與神經(jīng)遞質(zhì)3,4-二羥苯乙酸無(wú)關(guān)。
前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大鼠在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中,褪黑素處理組中血清乳酸脫氫酶的活性顯著高于對(duì)照組[11],同時(shí),褪黑素處理會(huì)降低熱應(yīng)激小鼠的氧化損傷[12],這表明褪黑素具有清除自由基及抗氧化的作用。褪黑素極易穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞,并在其中發(fā)揮強(qiáng)大的自由基清除作用,同時(shí)可以減輕自由基導(dǎo)致的線粒體損傷和腫脹,這就讓褪黑素成為了神經(jīng)的保護(hù)劑,產(chǎn)生了抗興奮作用[19]。在機(jī)體運(yùn)動(dòng)初期,興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE濃度升高,隨著特定強(qiáng)度下運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng),中樞神經(jīng)系統(tǒng)為了保護(hù)機(jī)體免受損傷而產(chǎn)生抑制信號(hào),出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞,DA、NE濃度下降,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT濃度升高。本次實(shí)驗(yàn)采用褪黑素處理時(shí),褪黑素可能穿過(guò)血腦屏障對(duì)中樞神經(jīng)起到保護(hù)作用進(jìn)而促進(jìn)了DA、NE含量的增加,抑制了5-HT的濃度,延緩了運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。
神經(jīng)細(xì)胞中天冬氨酸為興奮性神經(jīng)遞質(zhì),γ氨基丁酸為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。小鼠經(jīng)褪黑素灌胃后測(cè)定天冬氨酸、γ-氨基丁酸呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化,γ氨基丁酸含量升高[20]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí),褪黑素處理導(dǎo)致的γ氨基丁酸升高會(huì)導(dǎo)致中樞抑制作用進(jìn)而對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞也有很好的調(diào)節(jié)作用[21-22]。這也可能是褪黑素發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。
1.通過(guò)力竭運(yùn)動(dòng)模型發(fā)現(xiàn),褪黑素處理組SD大鼠的最終力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組,表明褪黑素處理可以顯著延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。
2.在SD大鼠的力竭運(yùn)動(dòng)模型中,褪黑素處理顯著提高了興奮性神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、多巴胺的含量,降低了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的含量,因此推測(cè)褪黑素延緩SD大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的機(jī)制為:提高興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的含量,降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量來(lái)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性,改善因長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)失衡,這可能通過(guò)褪黑素本身具有的自由基清除及抗氧化作用提高了大鼠的運(yùn)動(dòng)能力以此延緩了運(yùn)動(dòng)力竭出現(xiàn)的時(shí)間。