賈也純，吳廣文，袁紅梅，卜明琪，賀澤霖，倪洪濤

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086）

轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptiong factor，TF）是可特異性結(jié)合順式作用元件，通過激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控生物脅迫響應(yīng)及生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)等多種生命活動(dòng)的特異蛋白。其中NAC（NAM，ATAF1/2和CUC2）是植物轉(zhuǎn)錄因子中規(guī)模最大一類，按蛋白結(jié)構(gòu)分為6組：ANAC034、TIP、ONAC4、SNAC、SND和NAM/CUC3，主要參與植物生長發(fā)育、防御反應(yīng)和激素調(diào)節(jié)等，尤其在植物細(xì)胞次生壁合成中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[1-3]。目前，根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb.gao-lab.org/）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，已從166個(gè)物種中鑒定得到19 997個(gè)植物NAC基因，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花（Gossypium hirsutum）和毛果楊（Populus trichocarpa）中分別鑒定得到138、306、289個(gè)NAC家族成員，在亞麻（Linum usitatissimumL.）中鑒定得到191個(gè)NAC家族成員。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)NAC基因在植物細(xì)胞次生壁形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在擬南芥中，NAC轉(zhuǎn)錄因子VND1-7（VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN）和NST1-3（NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR）以及SND1-5（SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN）同次生壁合成相關(guān)。在擬南芥中，SND1/NST3及其同源蛋白NST1、NST2、VND6、VND7是調(diào)控纖維細(xì)胞次生壁合成的一級主開關(guān)，直接調(diào)控參與次生壁加厚的下游轉(zhuǎn)錄因子，如SND2、SND3、MYB103、MYB85、MYB52、MYB54、MYB69、MYB42、MYB43、MYB20和KNAT7等[4]。AtSND2、AtSND3在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中位于第二層次，調(diào)控次生細(xì)胞壁纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等不同組分生物合成[4-6]。Steven等以SND2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料與野生型進(jìn)行差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，CesA8、Myb103及啟動(dòng)次生壁形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)[7]。過表達(dá)SND2、SND3基因?qū)Υ紊谠龊裼绊戯@著；SND2、SND3基因抑制表達(dá)則顯著減少纖維細(xì)胞次生壁增厚[8]。

纖維亞麻為一年生草本韌皮纖維作物。纖維細(xì)胞發(fā)育經(jīng)分化起始、伸長、次生細(xì)胞壁增厚和脫水成熟等4個(gè)階段[9-10]。次生細(xì)胞壁是植物細(xì)胞停止生長后，在初生細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)繼續(xù)積累的細(xì)胞壁層。次生細(xì)胞壁增厚期是纖維強(qiáng)度形成關(guān)鍵時(shí)期，次生細(xì)胞壁厚度決定亞麻纖維強(qiáng)度，因此，深入開展次生壁合成調(diào)控機(jī)制研究對纖維作物品質(zhì)改良具有科學(xué)意義[11]。目前，針對次生壁合成調(diào)控機(jī)制研究主要集中在擬南芥、毛果楊、棉花等模式植物中，在亞麻中研究較少，分子機(jī)理尚不清楚。前期通過亞麻轉(zhuǎn)錄組分析篩選到1個(gè)NAC10基因（Lus10013967），該基因是擬南芥SND3同源基因，在快速生長期該基因表達(dá)量為苗期8.05倍，其表達(dá)模式與次生壁纖維素合酶LuCesA8A基因相似，推測該基因可能在亞麻纖維發(fā)育及次生壁合成調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

本研究進(jìn)一步以高纖亞麻品種“Diana”為材料，從亞麻基因組中克隆得到LuNAC10基因，并作生物信息學(xué)分析。利用熒光定量PCR分析該基因在亞麻不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織部位表達(dá)模式，研究結(jié)果將為亞麻纖維細(xì)胞次生壁合成調(diào)控機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用高纖亞麻品種“Diana”，種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)，常規(guī)田間管理。分別在快速生長后期（最終株高的80%）分別取莖上部、中部、下部各三分之一、根、葉等5個(gè)部位并在苗期（4對真葉展開）、樅型期（最終株高的10%）、快速生長早期（最終株高的30%）、快速生長期（最終株高的50%）、現(xiàn)蕾期（50%植株可見花蕾）、花期（50%植株花開放）、綠熟期（蒴果未成熟、莖稈呈綠色）以及工藝成熟期（1/3蒴果成熟呈黃褐色，莖桿變成黃色）取莖中部三分之一。采樣后迅速于液氮冷凍，保存于-80℃，提取RNA用于基因熒光定量表達(dá)分析及纖維素含量分析。

RNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自天根生化科技有限公司）；PCR聚合酶（購自翌圣生物科技股份有限公司）；pMD18-T載體（購自康為世紀(jì)生物科技有限公司）；植物纖維素含量ELISA檢測試劑盒（購自齊一生物科技上海有限公司）；引物合成和基因測序交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1LuNAC10基因擴(kuò)增

提取樣品總RNA，提取過程參照試劑盒說明書。提取1μg RNA，在20μL試劑反應(yīng)體系下，作cDNA反轉(zhuǎn)錄合成。并根據(jù)亞麻LuNAC10基因（Lus10013967）CDS全長序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物，引物序列為LuNAC10F：5′ATGACGACGTGGTGCAATA ATG 3′，LuNAC10R：5′TCACTTCAGTTCCTTTGAT GATCCT 3′。以cDNA為 模 板，作RT-PCR基 因擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為cDNA模板1μL、KOD FX Neo（1 U·μL-1）1μL，2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25μL、dNTP（2 mmol·L-1）10μL、2μL 5′及2μL 3′primer（10μmol·L-1），最終補(bǔ)水至50μL。擴(kuò)增程序：于98℃高溫5 min預(yù)變性；之后98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min 30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后68℃延伸5 min。切膠回收將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，連接至pMD18-T載體作測序分析。

1.2.2 序列分析方法

利用ProtParam在線分析工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；采用NetPhos 3.1在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測蛋白磷酸化位點(diǎn)；通過PSORT在線軟件（http://psort.hgc.jp/form.html）分析蛋白亞細(xì)胞定位；采用TMHMM Server v.2.0分析工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；通過ProtScale在線軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列疏水性/親水性；利用GOR4（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；通過Smart在線軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。利用ClustalW（1.83）及Genedoc軟件，比對同源相似基因序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 熒光定量表達(dá)分析

選取亞麻LuEF1A和LuGAPDH作為內(nèi)參基因，作基因熒光定量表達(dá)分析，LuNAC10、LuCESA3A、LuCESA4、LuCESA8A及內(nèi)參基因熒光定量引物序列如表1所示，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至同一濃度，利用SYBR PremixEx TaqTM（TaKaRa）試劑盒作PCR擴(kuò)增。12μL反應(yīng)體系，其中包含：上、下游引物（10μmol·L-1）各0.25μL，2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 6μL，cDNA 1μL，ddH2O 4.5μL。各基因分別重復(fù)3次，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃30 s，變性94℃12 s，退火56℃45 s，延伸72℃45 s，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，使用2-ΔΔCt法比較和確定各基因相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.4 纖維素含量測定

將不同組織部位及不同發(fā)育時(shí)期試驗(yàn)材料置于烘箱中于80℃高溫烘干，研磨呈粉末經(jīng)40目篩過濾。利用植物纖維素含量檢測ELISA試劑盒（齊一，上海），采用蒽酮法測定纖維素含量，具體操作步驟參照說明書。

1.2.5 相關(guān)性分析

利用SPSS 16.0軟件計(jì)算不同變量間Pearson相關(guān)系數(shù)，分析相關(guān)性。P＜0.05為顯著相關(guān)，P＜0.01為極顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻LuNAC10基因擴(kuò)增

以高纖亞麻品種“Diana”的cDNA為模板擴(kuò)增Lu-NAC10基因，擴(kuò)增后利用1%瓊脂糖凝膠作電泳檢測，結(jié)果見圖1，可見一條特異性條帶。之后切膠回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將提取物克隆至pMD18-T載體，測序分析，經(jīng)測序該基因長度為978 bp，編碼325個(gè)氨基酸，核苷酸及氨基酸序列見圖2。

圖1 LuNAC10基因克隆電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of LuNAC10 gene clone

圖2 LuNAC10基因全長核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.2 Full length nucleotide sequence and coding amino acid sequence of LuNAC10 gene

2.2 亞麻LuNAC10基因序列分析

LuNAC10蛋白編碼325個(gè)氨基酸，其中甘氨酸（Gly）含量最高，為12.3%，其次為絲氨酸（Ser），占比9.2%。蛋白分子質(zhì)量為35.53 ku，蛋白理論等電點(diǎn)為6.85，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為38個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為36個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為38.10，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)為56.31，蛋白親水性為-0.787，為親水蛋白。該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。通過NetPhos 2.0預(yù)測LuNAC10氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，該蛋白有19個(gè)Ser、12個(gè)Thr和4個(gè)Tyr可能為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（見圖3）。

圖3 LuNAC10蛋白氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.3 Prediction of phosphorylation sites of LuNAC10 amino acid sequence

在線軟件PSORT分析該蛋白亞細(xì)胞定位情況，預(yù)測該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。SOPMA分析軟件預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)，該蛋白由α-螺旋（7.69%）、不規(guī)則盤繞（30.15%）、延伸鏈（62.15%）組成（見圖4）。SMART分析LuNAC10蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)DNA保守結(jié)合域NAM及2個(gè)低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域（見圖5）。

圖4 LuNAC10蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of LuNAC10 protein

圖5 LuNAC10蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Analysis of the conserved domain of LuNAC10 protein

2.3 LuNAC10基因多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

亞麻LuNAC10與克萊門柚（Citrus clementina）、棉花（Gossypium raimondii）、葡萄（Vitis vinifera）、木薯（Manihot esculentaCrantz）、毛果楊（Populus trichocarpa）、桃（Prunus persica）、可可樹（Theobroma cacao）及擬南芥（Arabidopsis thaliana）NAC10作蛋白多重序列比對（見圖6），不同物種蛋白序列在氨基酸60～258之間高度保守，N端、C端差異較大，說明NAC10基因在進(jìn)化過程中具有一定保守性。將亞麻LuNAC10與101個(gè)擬南芥NAC蛋白作進(jìn)化分析（見圖7），該蛋白與擬南芥SND2、3、4、5聚到一個(gè)分支，與SND3蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，蛋白相似性為83.4%。

圖6 NAC10蛋白氨基酸序列多序列分析Fig.6 Multi-sequence analysis of amino acid sequence of NAC10 protein

圖7 亞麻LuNAC10與擬南芥NAC蛋白分子進(jìn)化關(guān)系Fig.7 Molecular evolution relationship of LuNAC10 and NAC protein in Arabidopsis thaliana

2.4 LuNAC10基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析亞麻不同組織部位和發(fā)育階段LuNAC10基因表達(dá)量，以苗期（S1）為對照樣本計(jì)算基因表達(dá)量，根據(jù)Log2Foldchange值作圖（見圖8）。結(jié)果表明，在快速生長后期不同組織部位，該基因表達(dá)量由高到低依次為莖下部＞根＞莖中部＞莖上部＞葉，在莖下部表達(dá)量最高，葉片中表達(dá)量最低。不同發(fā)育階段，LuNAC10基因在苗期表達(dá)量較低，隨發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，基因表達(dá)量逐漸升高，至快速生長期表達(dá)量達(dá)到最高，其表達(dá)量為苗期8.85倍。進(jìn)入現(xiàn)蕾期、花期、綠熟期基因表達(dá)量逐漸下降，至工藝成熟期基因表達(dá)量降至最低。同時(shí)，對參與初生壁纖維素合成的LuCesA3A及參與次生壁纖維素合成的LuCesA4、LuCesA8A基因分析基因表達(dá)量（見圖8），結(jié)果表明，LuCesA4、Lu-CesA8A基因表達(dá)趨勢與LuNAC10基因相近。

圖8 亞麻不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位中基因相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of genes in different developmental stages and different tissues of flax

進(jìn)一步利用SPSS 16.0軟件分析LuNAC10與LuCesA3A、LuCesA4、LuCesA8A基因表達(dá)量相關(guān)性（見表2）。LuNAC10與LuCesA3A基因表達(dá)量相關(guān)系數(shù)為0.401，未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；LuNAC10與LuCesA4、LuCesA8A基因表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.989和0.987。

表2 基因表達(dá)量相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the genes expression level

2.5 基因表達(dá)量與纖維素含量相關(guān)性分析

不同組織部位及不同發(fā)育時(shí)期莖中部亞麻纖維素含量見圖9。

由圖9可知，在快速生長后期不同組織部位，莖下部纖維素含量最高，為490.81 mg·g-1，葉部纖維素含量最低，為96.99 mg·g-1。在莖部不同部位，纖維素含量莖下部＞莖中部＞莖上部。不同發(fā)育時(shí)期莖中部，苗期纖維素含量最低為305.09 mg·g-1，隨發(fā)育時(shí)期推進(jìn)，纖維素含量逐漸升高，至花期、綠熟期纖維素含量達(dá)到最高，為555.04～556.98 mg·g-1，進(jìn)入工藝成熟期纖維含量下降至481.91 mg·g-1。利用SPSS 16.0軟件分析LuNAC10基因表達(dá)量與纖維素含量相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.759，相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

圖9 亞麻不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位纖維素含量Fig.9 Fiber contents in different developmental stages and different tissues of flax

3 討論

次生細(xì)胞壁合成是一個(gè)復(fù)雜生物學(xué)過程，NAC類轉(zhuǎn)錄因子在合成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。李媛等發(fā)現(xiàn)毛白楊PtrNAC128過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中，植株木質(zhì)部細(xì)胞層層數(shù)增加，次生木質(zhì)部增厚，同時(shí)PtrNAC128基因過表達(dá)顯著提高木質(zhì)素和纖維素合成途徑關(guān)鍵酶基因及部分次生壁相關(guān)NAC、MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[12]。在白樺中，BpNAC012對白樺次生壁形成至關(guān)重要，BpNAC012表達(dá)抑制后，莖纖維中次生壁沉積顯著降低，而過表達(dá)Bp-NAC012誘導(dǎo)莖表皮中次生壁異位沉積[13]。在桉樹中過量表達(dá)擬南芥AtSND2增加桉樹纖維細(xì)胞次生壁厚度[7]。在玉米中，Zm NAC87是擬南芥SND3同源基因，該基因在堅(jiān)稈自交系和非堅(jiān)稈自交系間差異表達(dá)，推測該基因與玉米莖稈強(qiáng)度有關(guān)，調(diào)控玉米莖節(jié)間次生細(xì)胞壁發(fā)育[14]。本研究從亞麻中克隆得到LuNAC10基因，LuNAC10蛋白與擬南芥SND2、3、4、5聚到一個(gè)分支，與SND3蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，蛋白相似性為83.4%，根據(jù)同源性分析推測，LuNAC10基因可能在亞麻纖維細(xì)胞次生壁合成中發(fā)揮調(diào)控作用。

在擬南芥中，SND3基因在纖維和木質(zhì)部中優(yōu)勢表達(dá)[4,15]。苜蓿MTR_8g102240基因是擬南芥SND3基因同源基因，該基因在不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)，在現(xiàn)蕾期表達(dá)量較高，在盛花期表達(dá)量較低[16]。杉木ClNAC1、ClNAC6基因與擬南芥SND2/3基因具有較高同源性，在木質(zhì)化莖中相對表達(dá)量較高，且主要在木質(zhì)化莖木質(zhì)部中優(yōu)勢表達(dá)[17]。本研究中LuNAC10基因在亞麻木質(zhì)化程度較高的莖下部表達(dá)量最高，根部次之，葉部表達(dá)量最低。莖中部LuNAC10基因隨發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)表達(dá)量逐漸升高，至快速生長期表達(dá)量達(dá)到最高，進(jìn)入生殖生長期表達(dá)量逐漸下降，與以上結(jié)果一致。亞麻LuNAC10基因表達(dá)量與纖維素含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.759，推測該基因可能同時(shí)參與調(diào)控纖維素合成過程。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中，AtCesA1蛋白與AtCesA3、AtCesA6蛋白共同組成纖維素合酶復(fù)合體，同初生細(xì)胞壁合成相關(guān)，AtCesA4蛋白與AtCesA7、AtCesA8蛋白則參與次生細(xì)胞壁合成[18]。于瑩等發(fā)現(xiàn)亞麻中LuCesA8基因與次生壁細(xì)胞生長、次生壁加厚沉積密切相關(guān)[19]。本研究對前期亞麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作LuCesA8A基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)與LuCesA8A基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子NAC10、NAC12、NST1、SND2、MYB46、MYB103在擬南芥中均曾被報(bào)道與次生壁合成調(diào)控相關(guān)[20]。在擬南芥中，At-MYB46直接結(jié)合纖維素合酶AtCesA4、AtCesA7、At-CesA8基因啟動(dòng)子并激活其表達(dá)[21]。過表達(dá)棉花Gh-SND2基因擬南芥植株與野生型相比，AtCesA4基因在轉(zhuǎn)基因株系花序莖和主根中均顯著上調(diào)表達(dá)[22]。棉花GhFSN2基因與擬南芥NST1-3基因在進(jìn)化上處于同一分支，雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明，GhFSN2激活GhCesA4-3和GhCesA7-1基因啟動(dòng)子活性[22]。本研究中，亞麻LuNAC10基因與次生壁纖維素合酶LuCesA4、LuCesA8A基因共表達(dá)，相關(guān)性達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。LuNAC10蛋白是否直接調(diào)控LuCesA4、LuCesA8A基因表達(dá)，LuNAC10與共表達(dá)基因MYB46、SND2、NST1等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)系，有待進(jìn)一步深入研究。