高 鵬，徐 楠，張曼琳，劉 泰，丁 卓，崔浩楠，張?zhí)┓?/p>

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 昌黎 066600）

甜瓜（Cucumis meloL.）為葫蘆科甜瓜屬一年生草本作物，種植規(guī)模較大[1]。白粉病為植物生長階段普遍發(fā)生的真菌病害，在露地以及溫室條件下廣泛發(fā)生，造成產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量降低。甜瓜白粉病發(fā)病時葉片表面產(chǎn)生大量白色斑粉，嚴(yán)重時全株遍布白粉，影響葉片光合能力，產(chǎn)生生產(chǎn)抑制，造成植株減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)[2]。目前，世界范圍內(nèi)致使白粉病發(fā)生的主要是二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearumL.，Gc）和單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii，Px）[3]，分別分化出2個和11個生理小種，我國以單囊殼白粉菌1號和2F生理小種為主[4]。白粉菌侵染植物時，先由植物表皮侵入植物體內(nèi)，然后分生孢子萌發(fā)芽管和吸器在表皮細(xì)胞定植進而在細(xì)胞間隙產(chǎn)生大量菌絲。因此，植物組織形態(tài)結(jié)構(gòu)在與病原菌對抗過程中具有關(guān)鍵作用[5]。張詠梅等研究證實，在白粉菌侵染苜蓿后，不同抗性苜蓿材料柵欄細(xì)胞及葉肉細(xì)胞均發(fā)生一定程度形態(tài)改變，抗病苜蓿材料在被白粉菌侵染后，柵欄細(xì)胞排列逐漸松散且形狀由原來的長圓形變?yōu)閳A形[6]。王方等研究證實，在炭疽病侵染棗樹葉片后，抗病性強品種上表皮和柵欄組織厚度大，對炭疽病抗性也越強[7]。不同抗性苦瓜材料葉片結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，野生抗病苦瓜材料在茸毛數(shù)量及氣孔密度上均低于感病栽培材料，但在結(jié)構(gòu)緊密度上卻高于高感栽培材料[8]。李敏等研究證實，柑桔在潰瘍病菌脅迫下，抗性與葉片下表皮氣孔存在顯著差異，4份柑桔材料氣孔密度與抗性呈正相關(guān)，此結(jié)構(gòu)可在早期有效篩選柑桔是否抗?jié)儾9]。植物被病原菌侵染后，超氧化物歧化酶（Superoxide dimutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）等酶類可高效去除活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species，ROS）[10]?？菸【{迫下南瓜材料中CAT、POD、SOD活性均出現(xiàn)上升或下降情況，南瓜抗性與早期SOD和POD活性呈正相關(guān)[11]。郭艷紅等研究證實，月季被黑斑病侵染后，抗病月季材料與感病月季材料中SOD和POD活性均出現(xiàn)上升情況，接菌后抗病月季中SOD和POD活性一直處于較高水平，說明高水平SOD和POD活性更有利于抵抗病原菌[12]。

本研究分析抗感甜瓜材料葉片組織結(jié)構(gòu)、表皮細(xì)胞、氣孔等方面差異；利用考馬斯亮藍(lán)和DAB染色方法觀察葉片上白粉病菌形成和H2O2累積；測定甜瓜白粉菌侵染后葉片中與ROS產(chǎn)生相關(guān)的CAT、SOD和POD基因表達量，闡明不同白粉病抗性甜瓜葉片組織結(jié)構(gòu)、ROS積累差異。

1 材料與方法

1.1 甜瓜材料與病原菌準(zhǔn)備

供試甜瓜材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種研究室提供。根據(jù)實驗室前期抗感性試驗結(jié)果，選擇抗病材料M4-125和M4-118與感病材料M4-116和M1-101。供試材料均為純合自交系，且M1-101為薄皮甜瓜，其余均為厚皮甜瓜。供試材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心，每份材料種植5株，3次重復(fù)；本研究試驗病菌P.xanthii的1號生理小種的采集純化也在此處完成。試驗過程中溫度22～27℃，濕度60%～70%，采取雙蔓整枝方式對甜瓜材料作田間管理。

1.2 甜瓜材料病菌接種與抗性分級

在供試甜瓜未感病葉片上均勻噴灑濃度為1×106孢子懸浮液，14 d調(diào)查發(fā)病情況，每份材料重復(fù)5次。發(fā)病情況參考馬鴻艷等[13]標(biāo)準(zhǔn)并統(tǒng)計病情指數(shù)（DI），每株取3片真葉用于統(tǒng)計分析，生物學(xué)重復(fù)3次。抗性（Resistance，R）程度分為高抗、中抗、中感、高感四類，相對抗病指數(shù)為0～30、30～60、60～90和90以上。

1.3 甜瓜葉片組織結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1 甜瓜葉片細(xì)胞特征觀察

取長勢良好甜瓜未感病且葉面積一致葉片用于石蠟切片觀察，具體操作參考楊捷頻方法[14]。通過操作物鏡微尺（ZX-CX40M）測定葉片上表皮細(xì)胞厚度（Upper epidermal cell thickness，UCT）、下表皮細(xì)胞厚度（Lower epidermal cells thickness，LCT）、柵欄組織厚度（Palisade tissue thickness，PT）、海綿組織厚度（Spongy tissue thickness，ST）和葉片厚度（Leaf thickness，LT），15次重復(fù)。計算結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）=（PT/LT）×100%、疏松度（SR）=（ST/LT）×100%。

1.3.2 甜瓜葉片表皮結(jié)構(gòu)觀察

利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)教學(xué)實驗中心一樓試驗室掃描電鏡觀察并拍攝未感病甜瓜葉片表皮細(xì)胞及氣孔形態(tài)；具體操作參考Graham等方法[15]。表皮細(xì)胞緊密度（EC）=視野總表皮細(xì)胞個數(shù)/視野總面積（mm2）×100%。

1.4 甜瓜葉片接菌后考馬斯亮藍(lán)染色和DAB染色觀察

利用光學(xué)顯微鏡（ZX-CX40M）（10×40倍）觀察白粉菌侵染后從0 h開始截止72 h，間隔24 h，共4個時間點，記錄甜瓜葉片染色情況。具體操作參考饒維橋等[16]和Daudi等[17]方法。

1.5 甜瓜葉片接菌后指標(biāo)測定

根據(jù)試劑盒（ELISA，武漢）說明書測定H2O2含量、CAT、SOD和POD活性。從0 h開始截止72 h，間隔24 h，共4個時間點，生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均3次。

1.6 ROS代謝相關(guān)酶（CAT、SOD、POD）基因表達量測定

利用試劑盒（Toyobo，東京）作熒光定量PCR，確定接種白粉菌后4個時間點活性氧（ROS）代謝相關(guān)酶基因表達情況，生物學(xué)與技術(shù)重復(fù)均3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0作數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甜瓜抗性分級及白粉菌侵染過程觀察

通過在溫室中對2份抗病材料與2份感病材料開展白粉病接種鑒定，其DI如表1所示，其中M4-116、M1-101、M4-118、M4-125對應(yīng)DI分別為90.75、73.58、42.56、25.33，對應(yīng)白粉病抗性分別為HS、MS、MR、HR?？共『透胁〔牧吓c前期抗感性試驗選育情況一致。

表1 不同甜瓜品系白粉菌侵染后抗感鑒定分析Table 1 Identification and analysis of resistance to powdery mildew infection in different melon strains

如圖1所示，感病材料M4-116和M4-101在白粉菌侵染后0 h，分生孢子未萌發(fā)吸器和菌絲；24 h后可觀察到吸器與菌絲出現(xiàn)；48 h觀察到萌發(fā)管出現(xiàn)分支，菌絲不斷增加并向周圍擴散；當(dāng)受白粉菌侵染后72 h大量分生孢子梗出現(xiàn)?？共〔牧螹4-118和M4-125受白粉菌侵染0 h后與感病材料情況相同，白粉菌侵染24 h后出現(xiàn)分生孢子萌發(fā)但未發(fā)展產(chǎn)生初級菌絲。相比感病材料存在差異，M4-118在白粉菌侵染后48～72 h分生孢子菌絲發(fā)育被限制，未觀察到萌發(fā)管分支產(chǎn)生，也未見菌絲大規(guī)模擴散（見圖1K-L），抗病材料M4-125遭受白粉菌侵染后48 h，菌絲逐漸向周圍擴散，白粉菌侵染72 h后菌絲生長情況較為緩慢，未觀察到分生孢子梗出現(xiàn)（見圖1O-P）。

圖1 不同抗性甜瓜品系白粉菌絲發(fā)育特征Fig.1 Characteristics of mycelia development of melon strains with different resistance

2.2 甜瓜品系葉片縱切面結(jié)構(gòu)特征

石蠟切片觀察結(jié)果如圖2所示，可觀察到在抗病與感病材料中，葉片上表皮和下表皮細(xì)胞均呈現(xiàn)單層結(jié)構(gòu)，且在每份甜瓜材料中細(xì)胞排列情況不同。與2份感病材料相比，可看出抗病材料M4-125與M4-118上下表皮細(xì)胞整齊程度較感病材料M4-116和M1-101差，但柵欄組織整齊度和清晰度優(yōu)于感病材料M4-116和M1-101，且在海綿組織中也觀察到同樣現(xiàn)象。

圖2 甜瓜品系葉片縱切面結(jié)構(gòu)特征Fig.2 Characteristics of longitudinal section structure of melon strains leaf

如表2所示，對4份材料分析可知感病材料M1-101上表皮、海綿組織、葉片厚度高于其他3份材料，且與抗病材料M4-125和M4-118上表皮、海綿組織、葉片厚度相比差異顯著。感病材料M1-101葉片柵欄組織厚度最高，且與抗病材料M4-118存在顯著差異。2份抗病甜瓜材料與2份感病甜瓜材料CTR及SR統(tǒng)計分析表明，抗病材料M4-125和M4-118葉片結(jié)構(gòu)致密，緊密度高；而感病材料M4-116和M1-101葉片結(jié)構(gòu)較為松散，其SR也顯著高于抗病材料M4-125和M4-118。

表2 甜瓜品系葉片結(jié)構(gòu)之間顯著性差異Table 2 Significant differences in leaf structure among melon strains

2.3 甜瓜品系表皮細(xì)胞緊密度與氣孔分析

分析2份抗病材料和2份感病材料葉片EC可知（見表3），葉片EC最大的是抗病材料M4-118，其緊密程度為19.20±1.74；其次是抗病材料M4-125，緊密程度為16.73±1.62。且2份抗病材料葉片EC顯著高于感病材料M4-116和M1-101。根據(jù)掃描電鏡觀察（見圖3），可發(fā)現(xiàn)抗感材料氣孔形態(tài)均為長橢圓形。由表3可知，在氣孔數(shù)量方面感病材料M4-116與抗病材料差異顯著；同時感病材料在氣孔長度上與抗病材料相比也存在顯著差異。

圖3 甜瓜品系表皮細(xì)胞與氣孔形態(tài)Fig.3 Morphology of epidermal cells and stoma in melonstrains

表3 不同甜瓜品系氣孔數(shù)量與氣孔長度分析Table 3 Analysis of stoma number and stoma length in different melon strains

2.4 甜瓜品系對白粉病抗性與葉片結(jié)構(gòu)之間相關(guān)關(guān)系

選擇2份抗病材料與2份感病材料作白粉病抗性與葉片結(jié)構(gòu)之間相關(guān)關(guān)系分析，根據(jù)表4可知，與甜瓜白粉病抗性之間存在極顯著相關(guān)，分別為CTR、SR及EC，相關(guān)性分別是正相關(guān)、負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.844、-0.927和0.973。

表4 甜瓜品系對白粉病抗性與葉片結(jié)構(gòu)之間相關(guān)關(guān)系Table 4 Correlation between leaf structure and powdery mildew resistance of melon strians

2.5 不同白粉病抗性甜瓜品系葉片H2O2含量及酶活性測定

利用DAB染色觀察白粉菌侵染抗感甜瓜后葉片活性氧迸發(fā)情況，記錄葉片中H2O2變化過程。根據(jù)圖4可知，高感材料M4-116、中感材料M4-101和中抗材料M4-118在接菌后48和72 h可檢測到細(xì)胞中少量H2O2存在。而高抗材料M4-125葉片細(xì)胞在白粉菌侵染后0～24 h并未檢測到H2O2，侵染后48～72 h，在細(xì)胞中檢測到較多H2O2。

圖4 白粉病菌侵染后甜瓜品系葉片中H2O2變化過程Fig.4 Changes of H2O2 in melon strains leaves after powdery mildew infection

采集白粉菌脅迫后4個時期甜瓜葉片，根據(jù)圖5A可知H2O2變化情況，高感材料M4-116、中感材料M4-101以及中抗材料M4-118遭受白粉菌脅迫后H2O2變化情況無顯著差異；而高抗材料M4-125遭受白粉菌脅迫后，H2O2含量在48 h有明顯上升趨勢且72 h時下降；H2O2測定和DAB染色結(jié)果表明白粉菌脅迫后48 h存在大量H2O2。根據(jù)圖5B可知，白粉菌侵染后24 h中抗材料M4-118的CAT活性上升，其他3份材料均顯著下降，且高抗材料M4-125降低程度小于感病材料；接種后72 h，高抗材料M4-125的CAT活性在4份甜瓜材料中最低。根據(jù)圖5C可知，2份抗病甜瓜材料被白粉菌侵染后SOD活性呈逐漸上升趨勢，但在接菌后4個時間點上升和下降情況并不一致。白粉菌脅迫下高感材料M4-116和中感材料M1-101的SOD活性變化較為復(fù)雜且無規(guī)律可循，但侵染后48～72 h活性均出現(xiàn)降低。根據(jù)圖5D可知，白粉菌侵染后4份甜瓜材料POD活性持續(xù)上升，且感病材料在白粉菌侵染后0～48 h，POD活性水平始終大于2份抗病材料，但不同抗病材料之間抗性與POD活性在4個時間點變化不同。

圖5 4份甜瓜品系白粉菌侵染后H2O2、CAT、SOD和POD活性變化Fig.5 Changes of H2O2,CAT,SOD and POD activities in four melon strains infected with powdery mildew

2.6 白粉菌侵染后甜瓜活性氧代謝相關(guān)基因表達

本試驗利用熒光定量PCR技術(shù)測定高抗材料M4-125和高感材料M4-116在白粉菌侵染后4個時間點CAT、SOD、POD基因表達量。從本實驗室甜瓜抗白粉病轉(zhuǎn)錄組研究成果中（NCBI登錄號：SRX2442184和SRX2442273），篩選出對白粉病有明顯響應(yīng)活性氧代謝相關(guān)基因。分別為CAT基因MELO3C026532、MELO3C017024、MELO3C014643，SOD基 因MELO3C014007、MELO3C020487和POD基 因MELO3C014655、MELO3C018672。由 圖6可知，白粉菌侵染后3個CAT基因在高抗材料M4-125中表達量均出現(xiàn)明顯升高趨勢；而在高感材料M4-116中MELO3C017024基因在接菌24 h后表現(xiàn)明顯下降趨勢，其他兩個基因表達量并未明顯下降。由圖6可知，白粉菌侵染后48 h在高抗材料M4-125中MELO3C014007和MELO3C020487基因表達量均出現(xiàn)明顯增加趨勢，但MELO3C020487在72 h表達量略下降；而MELO3C014007和MELO3C020487基因在高感材料M4-116接菌后0～48 h，表達量未表現(xiàn)升高或降低，但在48～72 h基因MELO3C020487表達量顯著上調(diào)。由圖6可知，2個POD基因在白粉菌侵染后表達量變化在高抗材料M4-125中也有所區(qū)別，其中MELO3C014-655基因表達量出現(xiàn)明顯升高趨勢，而MELO3C018672基因在白粉菌侵染48 h后表達量才開始逐漸上升，且在72 h時表達量又出現(xiàn)下降趨勢，在高感材料M4-116中ME-LO3C014655基因表達量呈先升高后降低，而MELO3C018672基因表達量并未出現(xiàn)明顯上升或下降。

圖6 白粉菌侵染后甜瓜活性氧代謝相關(guān)基因表達Fig.6 Expression of genes related to ROS metabolism in melon after powdery mildew infection

3 討論

陳夕軍等研究證實，在黃瓜抵御白粉菌侵染過程中，黃瓜葉細(xì)胞是否整齊以及細(xì)胞壁薄厚程度均在此過程中發(fā)揮重要作用[18]。張詠梅研究發(fā)現(xiàn)，慶陽苜蓿整齊緊實的柵欄組織，細(xì)胞致密的海綿組織在抵御病原菌侵入時發(fā)揮積極作用[6]。田麗波等研究證實，抗白粉病苦瓜品系葉結(jié)構(gòu)緊密度較高，柵欄及海綿組織相比于感病苦瓜品系更密實，且苦瓜對白粉病抗性與葉片厚度及上下表皮厚度存在相關(guān)性[8]，上述研究成果均證實葉片結(jié)構(gòu)緊密性、結(jié)構(gòu)松散程度與植株抗病性密切相關(guān)，在植株抵御病原菌入侵過程中發(fā)揮重要功能。本研究掃描電鏡結(jié)果表明，2份抗病材料柵欄組織與海綿組織清晰度高于2份感病材料；2份感病材料葉片緊密程度顯著低于2份抗病材料，疏松程度則反之，與前人研究成果相同[6,8,18]。4份甜瓜材料葉片、上下表皮差異不顯著，推測是與本試驗所用材料葉片結(jié)構(gòu)有關(guān)。

本研究中不同甜瓜品系葉片表面氣孔數(shù)量和長度存在差異，與不同獼猴桃品系葉片研究結(jié)果一致[19]。通過石蠟切片可知，2份抗病材料葉片表皮細(xì)胞排列不規(guī)則且單位面積表皮細(xì)胞數(shù)高于2份感病材料。本研究分析表皮細(xì)胞緊密度相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)與抗性之間呈正相關(guān)。因此，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密程度在抑制白粉菌對甜瓜侵染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

ROS作為一種信號分子，含量過高致使植株細(xì)胞出現(xiàn)膜脂過氧化，影響膜結(jié)構(gòu)和功能[20]。本試驗表明，不同甜瓜材料對白粉病菌脅迫響應(yīng)存在區(qū)別。研究表明，CAT、POD和SOD在植物抵御病害侵染過程中發(fā)揮重要作用[21-22]。陳亮等研究發(fā)現(xiàn)西瓜在被枯萎病菌侵染后，CAT活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢[23]，與本研究中抗材料M4-118 CAT活性變化一致。

一般情況下，生物脅迫導(dǎo)致植物POD活性升高，如瓠瓜[24]、小麥[25]、豌豆[26]等，且POD活性隨抗病能力增強而升高，本研究4份材料POD活性在白粉菌入侵過程中均顯著升高，但POD活性變化與抗性并無相關(guān)性。本研究4份材料在白粉菌脅迫72 h后，SOD活性均上升，這與趙衛(wèi)星等在病毒病侵染西瓜葉片的研究中結(jié)論相符[27]。但高抗材料M4-125的H2O2活性在白粉菌侵染后0～48 h逐步遞增，結(jié)合染色觀察及SOD酶活性變化，推測H2O2過量加速被感染葉細(xì)胞死亡從而抵御白粉病菌脅迫。綜上所述，CAT、POD和SOD不同酶在抵御白粉菌入侵過程中發(fā)生反應(yīng)，且該反應(yīng)協(xié)同發(fā)生導(dǎo)致。

高抗材料M4-125的CAT與SOD基因表達量0～48 h呈升高趨勢，推測是因病菌脅迫導(dǎo)致植物葉片活性氧快速產(chǎn)生，引起表達量上升，這與郭靜在蔓枯病侵染甜瓜研究中結(jié)論一致[28]。祁靜靜等研究證實，CsKat01在感病柑橘中表達量與CAT活性呈正相關(guān)，H2O2含量呈負(fù)相關(guān)；推測CsKat01影響CAT活性及H2O2含量，從而決定柑橘是否抗病[29]。本研究高抗材料M4-125在接種白粉菌后48 h，POD基因表達量上升，推測高抗材料在白粉菌侵染后，固有防御系統(tǒng)被激活。曹璐璐研究證實，荔枝在霜疫霉脅迫下部分POD基因在抗病性強材料中表達量低，且在中抗和中感材料中均為部分被誘導(dǎo)表達[30]。

本研究表明，抗感材料由于自身調(diào)控抗性基因不同，導(dǎo)致有關(guān)酶活性存在差異，造成ROS相關(guān)基因表達不一致。

4 結(jié)論

a.分析CTR、SR以及EC與白粉病抗性相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，這3個方面均與白粉病抗性呈顯著相關(guān)。

b.通過測定2份抗病材料與2份感病材料在白粉菌侵染后4個時間點CAT、SOD、POD活性變化，表明甜瓜抗病材料葉片受白粉病侵染時SOD、POD活性均呈顯著升高變化，但CAT活性卻降低，說明POD、SOD活性升高與CAT活性降低有利于甜瓜抵御白粉菌入侵。

c.高抗材料M4-125中ROS代謝相關(guān)酶基因?qū)Π追劬哂幸恢碌捻憫?yīng)，即在白粉菌侵染后表達量顯著上調(diào)。