張 娜，符海鑫，曹 慧，王偉華

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

乳腺是哺乳動物特有哺育后代的功能器官，奶牛乳腺發(fā)育及泌乳需充足能量供應，能量供應不足導致乳品質(zhì)降低，因此能量代謝對乳腺組織發(fā)育和泌乳至關重要[1]。

AMPK是哺乳動物細胞中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞代謝和能量調(diào)節(jié)。葡萄糖供應減少等應激條件可激活AMPK[2]。AICAR等激活劑可激活AMPK，天然小分子化合物CompoundC可抑制AMPK[3]。AMPK是所有真核生 物 細胞能量狀態(tài)傳感器，也在維持上皮細胞連接中發(fā)揮重要作用[4]。AMPK參與乳腺上皮細胞能量代謝調(diào)節(jié)。AMPK調(diào)控主要下游信號通路是mTOR信號通路。mTOR是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，在進化中高度保守，mTOR在各種生物細胞中廣泛存在，且分布于胞漿中。當AMPK被激活時，mTOR活性被抑制。mTOR信號通路在細胞中發(fā)揮重要作用，主要有控制蛋白質(zhì)合成、細胞增殖和代謝[5]。

FLCN有兩種相互作用蛋白，相互作用蛋白1（FNIP1）和FLCN同源蛋白2（FNIP2/FNIPL）[6]。Takagi等證實AMPK與FNIP1相互作用，AMPK導致FNIP1和FLCN磷 酸 化[7]。研 究 表 明，F(xiàn)LCN可 與FNIP1/FNIP2和AMPK形成復合物[8]。Yan等在對秀麗隱桿線蟲研究中發(fā)現(xiàn)FLCN敲除可增加AMPK活性[9]。Possik等在小鼠腎臟和肌肉研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCN敲除導致AMPK表達增加[10]。此外，Collodet等在對小鼠胚胎成纖維細胞和腫瘤細胞系研究中發(fā)現(xiàn)FLCN敲除可激活AMPK[11]。以上結(jié)果提示FLCN是AMPK通路負調(diào)控因子。Wada等最新研究證實FLCN可調(diào)控mTOR信號通路[12]。Hartman等在人類膠質(zhì)瘤細胞中證實，F(xiàn)LCN敲除導致S6K磷酸化水平降低[13]，此結(jié)果提示FLCN是mTOR通路正調(diào)控因子。FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中如何調(diào)控AMPK信號通路和mTOR信號通路尚未闡明。FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中研究較少，其作用分子機制尚不清楚。本研究通過干擾和過表達FLCN，檢測下游蛋白表達情況，探討FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中功能，豐富乳腺上皮細胞代謝及泌乳調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，為進一步提高乳品質(zhì)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用細胞均為乳品科學教育部重點實驗室前期保存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞[14]。AMPKα抗體、Phospho-AMPKα抗體（購自美國Cell Signaling Technology公司），F(xiàn)NIP1抗體（購自Abcam公司），β-actin、mTOR抗體、p-mTOR抗體、兔IgG/FITC、caspase3抗體（購自北京博奧森生物技術有限公司），胎牛血清（FBS)、DMEM/F12（購自美國GIBCO公司），Lip 2000試劑、Trizol（購自美國Invitrogen公司），HRP辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光檢測試劑（購自北京蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）分離自荷斯坦奶牛乳腺組織。奶牛乳腺上皮細胞在DMEM/F12中添加10%胎牛血清和兩種抗生素（青霉素10 mg·L-1，鏈霉素10 mg·L-1）中培養(yǎng)。細胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，然后處理。以AMPK激活劑AICAR（0.5 mmol·L-1）和抑制劑Compound C（20μm·L-1）作用BMECs 60 min，D-Hanks鹽溶液作為對照。葡萄糖饑餓時，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，然后在不含葡萄糖和丙酮酸的DMEM培養(yǎng)液中孵育。以DMEM/F12全培養(yǎng)基作為對照。

1.3 免疫熒光試驗

冷凍切片機打開至-20℃，將冷凍的各時期組織取出，修剪為1 cm3塊狀，包埋，冷凍切片，厚度約為8μm。將組織切片用4%多聚甲醛溶液固定，去除4%多聚甲醛并用含有0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗，封片劑在室溫封片1 h。FLCN一抗在4℃條件下封閉組織12 h，磷酸鹽緩沖液清洗3次后用FITC標記的山羊抗兔二抗37℃避光孵育1 h，棄二抗后清洗3次，用含有DAPI抗熒光淬滅劑滴加至組織切片上，激光共聚焦觀察組織切片。

1.4 免疫共沉淀

棄掉細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗3次，細胞刮刀將含有RIPA裂解液的細胞刮下。細胞裂解液在4℃搖晃60 min，14 000 g離心5 min，以清除細胞碎片等。含等量蛋白（200μg）裂解液分別用FLCN和IgG抗體在4℃下孵育過夜，用protein A+G瓊脂糖凝珠在4℃下孵育3 h。用裂解緩沖液洗滌3次。回收在SDS樣品緩沖液中相關蛋白復合物并進行后續(xù)Western blot試驗。

1.5 Western blot

將細胞用細胞裂解液刮下，14 000 g離心5 min，加入5×上樣緩沖液，95℃下煮15 min備用。取200μg蛋白電泳，電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂牛奶封閉2.5 h后，一抗過夜孵育，用TBST洗膜3次后，37℃孵育二抗1 h，清洗后在NC膜上滴加發(fā)光液，在化學發(fā)光成像儀中顯影。

1.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)值均表示為平均值±標準誤差。定量數(shù)據(jù)通過對數(shù)變換歸一化，并使用SPSS 16.0軟件進行One Way ANOVA對組間均值作統(tǒng)計學比較。其中“*”表示P＜0.05，差異顯著；P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FLCN在牛乳腺中免疫組織學定位

為探究FLCN在奶牛乳腺組織青春期、泌乳期、干奶期的表達情況，本試驗采用免疫熒光檢測方法，分析青春期、泌乳期、干奶期奶牛乳腺組織中FLCN表達情況。DAPI標記細胞核，異硫氰酸熒光素（FITC）標記FLCN。激光共聚焦結(jié)果顯示，F(xiàn)LCN蛋白在乳腺導管上皮細胞表達，由圖1可知，青春期（圖1B）和泌乳期（圖1D）綠色熒光信號多于干奶期（圖1F）。由此得出結(jié)論，F(xiàn)LCN在青春期和泌乳期表達量高于干奶期。說明FLCN可能參與乳腺發(fā)育和泌乳。

圖1 FLCN在奶牛乳腺發(fā)育各時期定位Fig.1 Location of FLCN in mammary gland development of dairy cows

2.2 FLCN通過FNIP1與AMPK結(jié)合

為證實AMPK與FLCN、FNIP1作用，采用AMPK、FNIP1特異性抗體及同源IgG抗體進行免疫共沉淀，Western blot檢測沉淀中AMPK、FLCN、FNIP1蛋白表達情況。制備AMPK抗體（AMPK組）和兔IgG抗體（IgG組）樣品，采用SDSPAGE電泳分離，質(zhì)譜檢測。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，不同分子質(zhì)量蛋白均較好分離。與對照組相比，免疫共沉淀組在63和135 ku處出現(xiàn)不同靶條帶（見圖2），根據(jù)蛋白量推測蛋白可能是FLCN和FNIP1。用AMPK抗體進行Co-IP試驗，細胞全蛋白Input組和IP組檢測到FLCN和FNIP1；以FNIP1抗體進行Co-IP實驗，細胞全蛋白Input組和IP組檢測到AMPK和FLCN。Co-IP結(jié)果顯示AMPK與FLCN和FNIP1之間有特異性結(jié)合，證明AMPK與FLCN和FNIP1有相互作用。

圖2 SDS電泳結(jié)果Fig.2 Result of SDS electrophoresis

圖3 IP組為AMPK和FNIP1時檢測AMPK、FLCN、FNIP1蛋白Fig.3 AMPK,FLCN and FNIP1 proteins were detected when THE IP group was AMPK and FNIP1

2.3 FLCN干擾對AMPK/mTOR信號通路的影響

為進一步驗證FLCN對AMPK的調(diào)節(jié)作用，將試驗分為陰性對照組（NC）、FLCN干擾組（KD）、添加AMPK激活劑組（AICAR）、FLCN干擾同時添加AMPK激活劑組（AICAR-siFLCN）、添加AMPK抑制劑組（Compound C）、FLCN干擾同時添加AMPK抑制劑組（Compound C-siFLCN）。常規(guī)轉(zhuǎn)染48 h后，更換培養(yǎng)基，分別加入AMPK激活劑阿卡地新（Acadesine，AICAR）和抑制劑化合物C（Compound C），培養(yǎng)后收集蛋白樣品。Western blot檢測FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和β-酪蛋白（CSN2）的表達。如圖4所示，當沉默F(xiàn)LCN，AMPK、p-AMPK表達升高，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達降低。說明FLCN負調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，促進細胞增值殖和乳蛋白合成。在沉默F(xiàn)LCN的同時，添加AMPK激活劑結(jié)果顯示，AMPK、p-AMPK表達升高，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達降低。在沉默F(xiàn)LCN的同時，添加AMPK抑制劑結(jié)果顯示，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達升高，p-mTOR表達降低。綜上，F(xiàn)LCN負調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，AMPK正調(diào)控FLCN。

圖4 FLCN干擾分別與AICAR和Compound C共同處理時相關蛋白表達及灰度掃描分析Fig.4 Related protein expression and gray scan analysis when FLCN interference was co-processed with AICAR and Compound C

2.4 FLCN過表達對AMPK/mTOR信號通路的影響

試驗分為空載體組（EV）、FLCN過表達組（FLCN OE）、添加AMPK激活劑組（AICAR-EV）、FLCN過表達同時添加AMPK激活劑組（AICAROE）、添加AMPK抑制劑組（Compound C-EV）、FLCN過表達同時添加AMPK抑制劑組（Compound C-OE）。常規(guī)轉(zhuǎn)染48h后，更換培養(yǎng)基，加入AMPK激活劑（AICAR）和抑制劑（Compound C），收集蛋白樣品。Western blot檢測FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2變化情況。如圖所示，當FLCN過表達時，與對照組相比，AMPK、p-AMPK表達降低，F(xiàn)LCN、mTOR、p-mTOR、CyclinD1和CSN2表達升高。當加入AMPK激活劑時，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達升高，p-mTOR表達降低。當加入AMPK抑制劑時，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK表達降低，p-mTOR表達升高。根據(jù)FLCN過表達及FLCN過表達與AMPK激活抑制劑聯(lián)合處理結(jié)果，可得出FLCN負調(diào)控AMPK，正調(diào)控mTOR，AMPK正調(diào)控FLCN，負調(diào)控mTOR。AMPK與FLCN形成負反饋關系。

2.5 FLCN-AMPK信號通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的能量代謝

無糖處理培養(yǎng)后收集細胞，提取細胞總蛋白。Western blot檢測AMPK和FLCN蛋白表達。與對照組相比，無糖組培養(yǎng)后AMPK和FLCN蛋白表達量顯著增加。試驗分為空白對照組（Blank）和無糖處理組（Glucose free）。當細胞達到瓶底70%～80%時，更換無糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集細胞樣本。Western blot檢測FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、CyclinD1、p-ACC和CSN2。與對照組相比，經(jīng)過無糖處理后，F(xiàn)LCN、AMPK、p-AMPK蛋白表達顯著升高，mTOR、pmTOR、CyclinD1、CSN2和p-ACC表達降低。

圖5 FLCN過表達分別與AICAR和Compound C共同處理時相關蛋白表達及灰度掃描分析Fig.5 Expression of related proteins and gray scan analysis when FLCN overexpression was co-processed with AICAR and Compound C

圖6 無糖處理后乳蛋白合成和細胞增殖相關蛋白表達及灰度分析Fig.6 Milk protein synthesis and expression of cell proliferation-related proteins and gray scale analysis after glucose-free treatment

3 討論

FLCN分子質(zhì)量為64 ku，編碼579個氨基酸，具有腫瘤抑制功能。FLCN在不同物種中均為高度保守蛋白。目前已知FLCN參與多種代謝途徑和細胞過程的調(diào)控，并在腎臟、乳腺等組織中表達[15]。但目前FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中研究較少。

免疫熒光結(jié)果顯示FLCN在乳腺上皮細胞的細胞質(zhì)中表達。Laviolette等研究表明FLCN在溶酶體表達[16]與本試驗結(jié)果一致。本試驗結(jié)果還表明，F(xiàn)LCN在青春期和泌乳期高表達，干奶期低表達。哺乳動物乳腺呈動態(tài)性變化，主要過程包括青春期、妊娠期、泌乳期和干奶期。青春期，乳腺組織發(fā)育和代謝緩慢，主要由不規(guī)則脂肪和結(jié)締組織構成。泌乳期時，上皮細胞開始增殖和分化，合成乳糖和乳脂所需酶開始出現(xiàn)；泌乳開始后，光鏡下可見小葉內(nèi)充滿含乳汁的腺泡，小葉內(nèi)導管較明顯。FLCN在青春期和泌乳期高表達說明其功能可能與乳腺組織發(fā)育及泌乳相關。

為進一步探討FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中作用，本研究通過免疫共沉淀試驗檢測與FLCN相互作用的蛋白，結(jié)果顯示AMPK抗體沉淀產(chǎn)物中檢測到FNIP1和FLCN，F(xiàn)NIP1抗體沉淀產(chǎn)物中檢測到AMPK和FLCN。這與Baba等研究發(fā)現(xiàn)FLCN及其結(jié)合蛋白FNIP1與AMPK相互作用[6]，Reyes等研究發(fā)現(xiàn)FNIP1與AMPK存在相互作用[17]結(jié)果相同，表明FLCN、FNIP1和AMPK存在相互作用。FLCN可能是通過AMPK信號通路在奶牛乳腺上皮細胞中發(fā)揮作用。

為明確FLCN在奶牛乳腺上皮細胞中作用，采用沉默和過表達FLCN，同時添加AMPK激活劑和抑制劑，結(jié)果表明AMPK激活時，F(xiàn)LCN蛋白表達升高，mTOR、p-mTOR、Cyclin D1和CSN2表達降低。AMPK活性抑制時結(jié)果則相反。研究結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN表達，負調(diào)節(jié)mTOR表達及活性，抑制細胞增殖和乳蛋白合成。結(jié)合前人研究結(jié)果FLCN過表達抑制AMPK表達及磷酸化，AMPK激活反而促進FLCN表達，表明AMPK與FLCN形成負反饋作用。Gingras等研究表明AMPK信號是FLCN的正調(diào)控因子[18]，與本研究結(jié)果一致?；蚋蓴_和過表達試驗表明FLCN是mTOR、cyclin D1、caspase3、CSN2信號通路的正調(diào)控因子，同時也受AMPK正調(diào)控，與之前報道一致[19]。AMPK激活劑和抑制劑在FLCN干擾和過表達時刺激AMPK的表達水平，本試驗結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN表達，F(xiàn)LCN抑制AMPK表達。說明FLCN參與AMPK和mTOR信號通路，在細胞能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，促進乳蛋白表達。mTOR是調(diào)節(jié)細胞生長和增殖途徑關鍵信號通路，在奶牛乳腺上皮細胞中，營養(yǎng)物質(zhì)可通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳蛋白合成。Li等研究表明，沉默F(xiàn)LCN降低mTOR水平表達[20]，Hartman等研究表明，沉默F(xiàn)LCN導致mTORC1的活性標志蛋白核糖體蛋白S6K磷酸化水平降低[21]，這些結(jié)果表明FLCN正調(diào)控mTOR信號通路，與本試驗研究結(jié)果一致。但Wada等研究表明，沉默F(xiàn)LCN導致小鼠胚胎mTORC1活性升高[22]，與本試驗結(jié)果相反。推測原因為細胞類型和實驗條件等因素，或是沉默F(xiàn)LCN初期，mTOR被抑制，隨之被其他因素影響而激活mTOR，后續(xù)仍需試驗證實。

為進一步闡明FLCN在乳腺上皮細胞中能量代謝調(diào)節(jié)作用，分別將奶牛乳腺上皮細胞在正常和無糖條件下培養(yǎng)。無糖處理后FLCN、AMPK和p-AMPK表達升高，mTOR、p-mTOR CyclinD1、CSN2和p-ACC表達降低。AMPK是哺乳動物細胞重要的能量感受器，當細胞能量供應不足時，AMPK信號通路被激活。結(jié)果表明，無糖處理后激活AMPK信號通路，抑制mTOR信號通路，細胞周期蛋白和乳蛋白合成被抑制。結(jié)果表明，當細胞經(jīng)無糖處理能量缺乏時，細胞能量感受器AMPK被激活，同時FLCN表達升高調(diào)節(jié)AMPK活性，用于維持細胞存活。Baba等研究結(jié)果表明，F(xiàn)LCN參與mTOR信號通路和細胞能量代謝調(diào)控[6]。本試驗結(jié)果表明，F(xiàn)LCN參與奶牛乳腺上皮細胞的能量代謝調(diào)節(jié)，F(xiàn)LCN充當mTOR功能的正調(diào)節(jié)子和AMPK功能的負調(diào)節(jié)子參與細胞內(nèi)能量代謝。FLCN和AMPK之間存在負反饋調(diào)節(jié)，保證細胞內(nèi)能量代謝穩(wěn)定調(diào)節(jié)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，本試驗表明AMPK是FLCN正調(diào)控因子，F(xiàn)LCN被鑒定為AMPK負調(diào)控因子。Schmidt等在線蟲研究中，F(xiàn)LCN缺失導致AMPK結(jié)構性激活，增加自噬以及增加能量和代謝應激的激活[23]。FLCN與AMPK之間存在負反饋調(diào)節(jié)，這對于維持細胞代謝穩(wěn)定以及內(nèi)環(huán)境至關重要。本研究首次證明FLCN通過AMPK-mTOR信號軸參與乳腺上皮細胞能量代謝調(diào)控，明確FLCN在乳腺發(fā)育中作用，為人工改善乳品質(zhì)、提高乳產(chǎn)量提供理論基礎。