唐雨楠，史陳晨，楊 明，盛奎川，張璽銘

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

細胞培育肉是指利用陸地動物（雞、豬、牛、羊等）和海洋動物（魚、蝦、蟹、龍蝦等）的細胞經體外增殖、分化用以替代傳統(tǒng)食用肉類的組織（肌肉、脂肪、結締組織），又被稱為培養(yǎng)肉、培植肉、細胞肉、體外肉等。由于細胞培育肉潔凈、安全、營養(yǎng)成分可調控且符合動物福利理念，因此又稱清潔肉、定制肉、非動物肉、新蛋白肉等。

如今，世界人口持續(xù)增長、部分國家人均經濟收入提升刺激肉品消費需求上漲。因此，越來越多的研究機構、業(yè)內企業(yè)開始關注細胞培育肉研究，以期填補傳統(tǒng)屠宰肉品的供應缺口。除供需問題外，基于傳統(tǒng)畜牧和漁業(yè)養(yǎng)殖生產肉品存在其他諸多問題與限制，如環(huán)境問題（土地和水體資源占用大、溫室氣體和污水排放多、養(yǎng)殖企業(yè)臭氣排放衍生的鄰避效應等問題）、食品安全問題（存在人畜共患病傳染風險，過量使用激素、抗生素等）、生產效率問題（生產周期長、從飼料到肉品的能量轉化率低、肉品占養(yǎng)殖所得個體體積比例低、生產過程易受動物瘟疫影響造成產量不穩(wěn)定等）、食品營養(yǎng)風味問題（脂肪、膽固醇等比例難以調控等）、動物福利問題（屠宰等過程對動物造成諸多痛苦）。因此，亟需對細胞培育肉展開研究，獲得環(huán)境友好、低碳高效、成分營養(yǎng)可調控的新一代蛋白，以實現對傳統(tǒng)肉品的替代升級。

全球和我國第一塊細胞培育肉分別在2013年由荷蘭馬斯特里赫特大學和2019年由南京農業(yè)大學制得。近年來，細胞培育肉領域發(fā)展迅猛，初創(chuàng)公司大量涌現，且商業(yè)化生產取得較大突破。世界范圍內，美國Eat Just公司推出的細胞培養(yǎng)雞塊于2020年12月成為全球首款獲批售賣的細胞培育肉商品；以色列Future Meat Technologies公司已實現高密度雞肌肉細胞懸浮培養(yǎng)。2013年8月Mark Post教授研制出第一塊細胞培養(yǎng)牛肉，這種牛肉制作的漢堡成本高達33萬 美元/85 g，而2021年12月以色列Future Meat Technologies公司的細胞培養(yǎng)雞胸肉造價僅為15.45 美元/kg（約為同期中國白條雞售價的4～5 倍），細胞培育肉的成本顯著降低，但距離替代傳統(tǒng)畜牧養(yǎng)殖肉的最終目標仍有差距。為進一步降低細胞培育肉成本，需從細胞支架、非動物源培養(yǎng)基、生物反應器三方面進一步攻關。

細胞培育肉支架是具有特定結構、模擬細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的生物材料，可為肌肉、脂肪等細胞體外培養(yǎng)提供3D生長空間，同時促進細胞貼附、生長、增殖、分化甚至形成具有相應紋理和微觀結構的整塊組織。

細胞培育肉支架的研究至關重要，其原因在于：1）細胞培育肉的目標細胞是貼附細胞，其在體內對ECM、相鄰細胞構成的環(huán)境敏感，在體外對接觸的基質材料、培養(yǎng)基內的各種生長因子等環(huán)境同樣敏感。比如，基質材料的部分性質（如過高的硬度、疏水性）可能造成細胞貼附困難、凋亡等。再如，支架的定向結構可誘導肌源細胞定向分化并獲得肌管組織。因此，需要研究并優(yōu)化支架的物理性質和結構，以使細胞良好、高效生長，并分化成目標組織。2）雖然支架已在組織工程等領域中得到較為成熟的研究與應用，但是細胞培育肉領域需要在支架的可食用性、成本、規(guī)?；a潛力等方面進行更多考量，因此研究者需要針對細胞培育肉應用場景進行支架設計的優(yōu)化與調控。

理想的細胞培育肉支架應滿足如下需求：1）可支持細胞良好貼附、生長，這是最根本的需求。2）確?？煞蛛x、可降解或者可食用。值得注意的是，可食用支架是最理想選擇，因為可食用支架可簡化細胞培育肉的生產工藝，并且可輔助調控細胞培育肉產品的質構與口感。3）可提供一定的營養(yǎng)價值或膳食功能。4）具有良好的熱穩(wěn)定性，避免細胞培育肉在烹飪后結構和力學性能因支架分解而發(fā)生明顯變化。5）可實現商業(yè)化、大規(guī)模生產，成本可接受。

已有細胞培育肉支架主要包括以下形式：1）多孔支架，即具有開放式孔隙的海綿結構支架；2）纖維支架，是由納米纖維或微纖維構成的支架；3）微載體，即內部呈多孔狀、纖維狀或實心的球珠或不規(guī)則薄片，直徑在幾十到幾百微米不等；4）水凝膠，是具有高持水率的、呈凝膠狀的3D生物材料；5）生物墨水，是具有適宜流變特性的、容許細胞在其中生長并保護細胞免受機械傷害的、用于3D打印的生物材料。

從原料而言，已有細胞培育肉支架的材料主要集中在膠原或明膠、大豆蛋白、海藻酸鹽、甲殼素或殼聚糖、瓊脂糖、纖維素、透明質酸、去細胞化植物組織等。其中，膠原或明膠等動物蛋白對細胞的親和力最佳，但是它們屬于動物來源制品，而非動物源明膠的制備成本高，不是細胞培育肉支架原料的最優(yōu)選擇；大豆蛋白等植物蛋白具備優(yōu)良細胞相容性且屬非動物源材料，但是植物蛋白支架往往存在力學性能缺陷，常需要與其他材料復合使用；非動物源的甲殼素或殼聚糖、瓊脂糖、纖維素、透明質酸等多糖類材料力學強度較大，但是生物相容性不及膠原或明膠等蛋白，通常需要進行化學改性或表面圖案修飾；去細胞化植物組織從化學成分角度而言幾乎相當于纖維素，但是其保留有植物的復雜結構，有助于細胞貼附、增殖或者可誘導細胞規(guī)則排列、分化。

纖維素作為細胞培育肉支架原料具有以下關鍵優(yōu)勢：1）纖維素豐富易得，是世界上含量最多的天然高分子多糖物質，廣泛存在于植物細胞壁中，亦可通過微生物甚至動物獲得；2）纖維素健康可食用，雖然纖維素無法被人體消化吸收，但是纖維素可以有效促進胃腸道蠕動，有益身體健康，同時纖維素屬于美國食品藥品監(jiān)督管理局認證的“公認安全”（generally recognized as safe，GRAS）物質，在歐盟、中國、日本等地區(qū)同樣被允許添加到食品中；3）纖維素可實現規(guī)?；苽洌参锢w維素生產工藝早已在制漿造紙等行業(yè)中形成成熟體系，提供植物纖維素商品的知名公司包括挪威Borregard公司、日本Nippon Paper公司、加拿大Celluforce公司、加拿大Kruger公司、芬蘭Stora Enso公司、美國American Process公司、芬蘭UPM公司等。細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）在菌株、培養(yǎng)條件、生物反應器等影響產量的主要因素上已有眾多篩選與優(yōu)化，并且已成功實現工業(yè)化生產，如中國海南椰國食品有限公司、美國CP Kelco公司，以及日本San-Ei Gen公司、Kusano Sakko公司；4）纖維素顏色為白色或近白色，無味，便于調色調味，從而模仿肉類的感官品質。

纖維素支架在非細胞培育肉領域已有研究和應用基礎。首先，纖維素在組織工程中已被廣泛研究并作為支架材料。比如，纖維素支架可培養(yǎng)心肌細胞，生成類心臟結構組織；可培養(yǎng)MG-63骨肉瘤細胞用于骨組織工程；經絲膠蛋白修飾的BC可支持腸神經系統(tǒng)和腸道平滑肌細胞生長，用于腸道修復等。其次，已有纖維素支架實現商業(yè)化生產并應用于細胞體外培養(yǎng)、藥物遞送等。代表性纖維素支架商品包括Cytopore、Cellufine、MT、CelluForce NCC、BioCradle微載體、GrowDex水凝膠和GrowInk生物墨水。同時，已有初創(chuàng)公司推出專用于細胞培育肉的纖維素基支架，相關產品如澳大利亞Cass Materials公司的BC薄板、絮片和抓絨狀微載體。

本文介紹纖維素的結構和基本理化特性，綜述纖維素基生物材料的制備方法，并對纖維素在細胞培育肉支架中的應用挑戰(zhàn)與應對策略進行總結和展望，旨在為纖維素基生物材料在細胞培育肉領域的開發(fā)與應用提供參考。

1 纖維素基細胞培育肉支架的原料

纖維素是由--吡喃型葡萄糖在1,4位以-糖苷鍵連結形成的無支鏈線性高分子物質，分子式為(CHO)，優(yōu)勢構象式如圖1所示。纖維素具有結晶區(qū)和無定形區(qū)，前者占比大、生物可及性低，因此需要破壞結晶結構使纖維素易于改性。從化學結構看，纖維素富含羥基。具體而言，纖維素鏈其中一個末端葡萄糖基的C1位具有苷羥基，這一羥基作為隱性醛基而在一定條件下具有高反應活性；中間的每個葡萄糖基在C2、C3位具有仲醇羥基，C6位具有更易于反應的伯醇羥基。纖維素獨特的化學結構為其降解、酯化、醚化、接枝共聚等反應提供了構象基礎。同時，纖維素表面羥基基團帶負電，并且有條件與其他物質形成氫鍵結合。因此，纖維素有望通過眾多改性方式設計成具有多種功能的生物材料。

圖1 纖維素鏈的優(yōu)勢構象Fig. 1 Dominant conformation of cellulose chain

1.1 植物纖維素

纖維素是植物細胞壁的主要成分，與半纖維素、木質素等伴生，共同起到支撐、保護細胞等作用。植物纖維素的常見分離方式為酸水解和機械處理。根據尺寸形態(tài)，提取的纖維素包括代表性的兩類：纖維素納米晶（cellulose nanocrystals（CNC）或cellulose nanowiskers（CNW）或nanocrystalline cellulose（NCC））和纖維素納米纖維（cellulose nanofibers（CNF），亦稱nanofibrillated cellulose（NFC））。CNC是長徑比在10～100的棒狀纖維素，主要由酸水解制得，其長度在50～500 nm，直徑3～20 nm。CNF是長徑比大于100的絲狀纖維素，主要由機械處理制得，可輔以化學或酶預處理，其長度為500～10 000 nm，直徑小于100 nm。

受來源植物、分離方式、測量方法等影響，纖維素的聚合度（degree of polymerization，DP）呈現很大差異，其中農業(yè)廢棄物（如蔗渣、麥秸）纖維素的DP約為1 000，木材纖維素的DP約為4 000～5 000，棉花纖維素的DP則在10 000左右。此外，植物纖維素的結晶度約為40%～60%。

1.2 細菌纖維素

除植物外，纖維素也可來源于微生物發(fā)酵，即BC。椰果的主要成分即為BC，近年來風靡世界多國，被添加到飲料、糕點中或直接食用。BC具有天然高純度、高結晶度（70%～80%）、高DP（可達8 000）、高含水率（99%）、良好的生物相容性和可規(guī)模化生產的特性，因而在食品、組織工程等領域受到越來越多的關注。BC是由特定類型的細菌發(fā)酵產生的纖維素?？缮aBC的典型菌種是醋酸菌科的木醋桿菌（，曾先后歸于Acetobacter、Gluconacetobacter），木醋桿菌也是研究BC合成的模式菌種。可生產BC的大部分微生物具有致病性或未應用于食品領域，因此在BC商業(yè)化生產中往往選擇醋酸菌科細菌作為發(fā)酵培養(yǎng)對象。

靜置培養(yǎng)的BC在培養(yǎng)體系氣-液界面形成片層狀凝膠膜，清洗后呈半透明乳白色。攪拌、振蕩等非靜態(tài)培養(yǎng)條件下，BC可呈現為球狀、橢球狀、星狀、絮狀或不規(guī)則團塊狀。電子顯微鏡下，BC具有3D網狀纖維結構，纖維間隙在納米級（直徑約100～300 nm）。這一間隙對細胞而言過小，細胞無法進入材料內部并生長，因此用于細胞培育肉生物材料的BC必須經歷結構調整。由于BC是微生物在運動狀態(tài)下分泌的產物，其結構直接與微生物運動方式相關，因此可通過限制微生物的運動空間或運動方向而得到不同結構的BC，這可通過控制微生物發(fā)酵條件、生物反應器構造來實現。比如，用中心或/和外部透氧的管式生物反應器可得到形狀類似血管的管狀BC。

2 纖維素基細胞培育肉支架的制備方法

已有文獻綜述了細胞肉支架的制備方法，其中用于制備多孔支架的方法有顆粒浸出、熔融成型、冷凍干燥、發(fā)泡等；用于制備纖維支架的方法有濕法紡絲、靜電紡絲、旋轉噴射紡絲等；用于制備水凝膠的方法有酶促凝膠化、熱凝膠化、光聚合和離子交聯(lián)凝膠化等；3D打印、去細胞化、擠出成型等方法也可用于細胞肉支架制備；用于制備球形結構的方法有乳化、微流控等。上述制備方法中，可適用于纖維素（可能需要其他可食用材料輔助）的方法有冷凍干燥、發(fā)泡、酶促凝膠化、熱凝膠化、光聚合和離子交聯(lián)凝膠化、3D打印、植物去細胞化，其他方法因可能引入大量不可食用溶劑而不宜使用。以往文獻主要從支架類型的角度進行介紹，而支架結構直接影響支架在細胞培育肉中的應用場景。因此，本文以支架的各關鍵結構為類別，按照多孔結構、球形結構、定向結構、天然精密結構、可定制結構，依次介紹以纖維素為原料的細胞培育肉支架制備方法。

2.1 多孔結構制備方法

為滿足細胞3D培養(yǎng)，生物材料應當具有尺寸適宜的連通多孔結構。如果孔隙過小，細胞將無法遷移至材料內部，一些大分子營養(yǎng)物質運輸也將存在問題；然而，如果孔隙過大，則細胞生產效率降低。因此，接近但略大于細胞尺寸的孔隙的制備方法在該領域得到廣泛應用，常見方法包括冷凍干燥、發(fā)泡、犧牲材料、鹽析等。

2.1.1 冷凍干燥法

冷凍干燥是材料造孔的常見手段之一，多用于制備多孔支架。其原理是：首先，在水凝固點以下，材料中的水分子凍結成冰晶，將周圍的分子鏈排斥。然后，在高真空度下，冰晶直接升華為水蒸氣離開體系，此前冰晶膨脹形成的孔洞得以保留。需要注意的是，整個材料基質中孔的尺寸均一性受降溫速率制約，較慢的降溫速率有助于形成均一的等軸晶粒，這將對無定向排列要求的細胞（如脂肪細胞）生長而言更有利。

Abraham等以水為溶劑，對乙?；疌NC進行冷凍干燥制備多孔支架，支架內孔徑為0.1～10.0 μm，纖維素在冰模板的空間擠壓下形成厚度為40～80 nm的相互連通的薄片層。遺憾的是，該研究并未驗證生物相容性。

Xing Qi等用凍干法制備了纖維素微纖維-明膠多孔支架，冷凍溫度為-20 ℃。所得支架內部孔徑約為70 μm，孔隙率約為70%，楊氏模量在1～3 MPa（對應樣品中纖維素含量50%～75%）。經過28 d培養(yǎng)，人間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）在支架中增殖活躍，大量表達F-肌動蛋白和細胞外分子網絡，并且呈現出沿纖維素纖維排列的趨勢。隨后進行誘導培養(yǎng)發(fā)現，支架允許hMSCs細胞成功分化為成骨細胞或脂肪細胞。然而，明膠源自動物，且研究中為使明膠交聯(lián)而加入了不可食用的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide，EDC）和-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS）。

冷凍干燥法簡便易行，然而冷凍干燥法能耗大、成本高，如果應用到細胞培育肉生物材料制備中，將為培養(yǎng)肉終產品的造價額外增加一筆負擔。同時，對于大體積樣品，冷凍干燥法的效率低，且難以保證材料內部造孔均勻度。

2.1.2 發(fā)泡法

發(fā)泡法是向材料中加入在物理或化學作用下可產生氣泡或釋放氣體的物質，從而在材料中造孔的方法。現有發(fā)泡劑包括物理發(fā)泡劑、化學發(fā)泡劑、表面活性劑。發(fā)泡法主要優(yōu)點在于能夠制備出清晰的多孔結構。然而其缺點包括：1）孔隙尺寸范圍大，不易調控；2）易產生閉孔，孔隙連通性有限；3）孔隙分布不均勻。

物理發(fā)泡劑以超臨界CO為代表。Ju Jiajun等利用超臨界CO進行兩步減壓制備出具有雙峰開放式孔隙結構的聚丁二酸丁二醇酯-CNC支架，其中含5% CNC的支架由直徑分別為約68.9 μm和約11.0 μm的孔組成，具有較高的開放孔隙率（95.2%）。雖然該研究中的聚丁二酸丁二醇酯不在可食用范疇，但是物理發(fā)泡法本身不影響支架食用性，成本和能耗低，可實現工業(yè)化生產。對于化學發(fā)泡劑，其分解溫度應低于纖維素及可食用衍生物（如羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）、微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）、甲基纖維素（methyl cellulose，MC）、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC））的初始分解溫度（約為230～360 ℃），以保證纖維素生物材料主體的結構和力學性能完好。此外，考慮到細胞培育肉生物材料的可食用性，引入的發(fā)泡劑不應殘留有毒有害物質或令人不快的味道和氣味，本身應當允許添加到食品中。因此，僅有碳酸氫鈉等少數發(fā)泡劑可供選擇。同時，為獲得開放式多孔生物材料，應注意發(fā)泡劑的種類選擇、添加量與發(fā)泡工藝。

2.1.3 犧牲材料法

犧牲材料法是將非纖維素材料制成微球，并在纖維素生物材料制備過程中加入，以起到占位作用。待纖維素生物材料成型后，再將犧牲材料去除，從而留下與微球尺寸接近的孔洞。犧牲材料法與前述發(fā)泡法均可劃歸于使用致孔劑，但二者原理存在差異。發(fā)泡法是由致孔劑以物理或化學方式生成氣體從而造孔，而犧牲材料法是致孔劑固體本身以物理方式占據空間，隨后被除去從而造孔。犧牲材料法操作較為簡單，但是通常需要高比例添加犧牲材料方可實現較高的孔隙率和孔的開放程度，因此如果犧牲材料無法回收并重復利用則損耗較高，并且犧牲材料成本將直接影響纖維素生物材料的造價。此外，對于細胞相容性欠佳的犧牲材料，應進行更為徹底的純化操作以避免殘留物影響纖維素生物材料培養(yǎng)細胞時的活性。

B?ckdahl等使用石蠟顆粒（直徑90～500 μm）和土豆淀粉顆粒（直徑5～100 μm）作為犧牲材料，將其加入的發(fā)酵體系中，待生成BC后去除犧牲材料顆粒得到多孔BC支架，用于培養(yǎng)平滑肌細胞。然而該支架純化時需添加表面活性劑和酶，這將對支架的可食用性和成本造成不利影響。Yin Na等將瓊脂糖微球作為犧牲材料嵌入逐層生長的菌膜中，得到多孔BC支架。

2.1.4 鹽析法

鹽析法，即以鹽結晶（常用氯化鈉）作為犧牲材料進行占位造孔的方法。相比于前述的犧牲材料法，鹽析法成本更低，且易于純化（用水即可浸出NaCl），不引入有毒有害的化學物質。Kanimozhi等將殼聚糖-聚乙烯醇-CMC用水復配，加入200～500 μm的NaCl顆粒后風干，再用水去除NaCl并風干，得到13.6～15.5 μm的多孔支架，該支架的孔徑、孔隙率、孔開放程度均高于冷凍干燥法的對照組別。

2.2 球形結構制備方法

纖維素制備微球的常用方式包括乳化、微流控，這些方法在前人綜述中已有充分介紹。Zhang Chunmei等采用油包水乳化結合冷凍干燥的方法制得聚乙烯醇/CNF多孔微球。該微載體的直徑約為500 μm，孔徑為25 μm，堆積密度為4.7 mg/cm，BET（Brunauer-Emmett-Teller）理論比表面積為44 m/g，孔隙率為99.6%。經NIH 3T3細胞測試，培養(yǎng)10 d后細胞在微球表面生長良好，部分細胞可遷移至微球內部孔隙中。該微載體的主要優(yōu)勢在于乳化工藝有利于實現大規(guī)模生產。然而，該微載體制備時使用的戊二醛交聯(lián)劑不可食用，且甲苯油相存在殘留隱患造成不可食用問題。

針對用于細胞培育肉的纖維素基球狀生物材料制備，上述方法的主要問題在于需消耗大量溶劑，這些溶劑大多數無法食用或者去除工藝繁瑣。如有殘留不僅可能危害人體健康，還可能對材料的親水性、粗糙度、表面電荷和官能團的暴露程度等表面性能產生負面影響，陰礙細胞在材料上的貼附與生長。此外，上述方法需結合其他方法使微球形態(tài)固定化，對于對酸、堿、溫度、pH值相對不敏感的天然纖維素而言，輔助方法多為冷凍干燥。為此，可將上述方法與微生物發(fā)酵原位生成纖維素的方式相結合，從而避免溶劑問題。如首先通過微流控法或乳化法制得含有產BC細菌的明膠微球，再以此構建出空心微球空間供細菌生長，從而形成纖維素微球（圖2）。此外，為規(guī)避有毒及難除溶劑問題，少數研究制備的纖維素微球可食用，但是顆粒直徑往往偏大，如通過滴液法以NaOH水溶液為溶劑制得的纖維素微球，平均直徑約在0.5～4.0 mm。微球直徑過大將導致實心微球的比表面積降低，多孔微球的物質交換難度提升，不利于細胞的高效貼附與生長。

圖2 原位生成纖維素微球[48-49]Fig. 2 In situ formation of cellulose microcarriers[48-49]

2.3 定向結構制備方法

定向冷凍、機械拉伸等方式均可形成各向異性生物材料。

2.3.1 定向冷凍

定向冷凍又名冷凍鑄造，是在梯度溫度場下水或鹽溶液在固體材料內結成冰晶從而創(chuàng)造平行于溫度梯度方向的定向通道的方法。其所創(chuàng)造的通道直徑主要受冷凍溫度因素影響。

Liaw等將羥基磷灰石與殼聚糖復合后進行定向冷凍，分別在2、5 ℃/min的降溫速率下制備出直徑為10～100、1～50 μm的支架內通道。另有研究將膠原蛋白溶液進行定向冷凍，降溫速率為5 ℃/min，得到25～270 μm的支架內通道。

Dai Rengang等用液氮進行定向冷凍，制得各向異性絲素蛋白-CNC支架。隨著CNC質量分數上升到0.8%，支架的平均孔徑增大至17 μm?？紤]到絲素蛋白同樣可食用，絲素蛋白-CNC復合材料可作為細胞肉支架的原料。

Courtenay等以液氮為冷源，對陽離子化CNF進行定向冷凍，得到具有定向、平滑微通道的支架，通道孔徑約為35 μm，纖維素壁厚約26 nm，楊氏模量可在不交聯(lián)狀態(tài)（0.1 MPa）到10%乙二醛交聯(lián)（50 MPa）范圍調整。在此基礎上將Pickering乳液與定向冷凍相結合，可以向支架的纖維素壁層中引入相互連通的孔隙。MG-63細胞測試表明，培養(yǎng)7 d后細胞可在支架上存活。需要注意，雖然陽離子化試劑縮水甘油基三甲基氯化銨有利于細胞附著、交聯(lián)劑乙二醛可增強支架力學性能，但是二者均不可食用。此外，該支架還使用其他不可食用有機物為溶劑，上述成分不應添加于細胞肉支架中。

與冷凍干燥法相類似，定向冷凍法以冰為犧牲模板，在支架內部創(chuàng)建定向通道，該方法簡單、高效。但是隨著樣品體積增大（尤其是沿溫度梯度方向的長度增加），確保樣品內溫度梯度的一致性將更加困難，造成通道孔徑更加不均一（近冷源端樣品局部溫度梯度大，通道孔徑?。?，從而導致良好的通道長度和通道孔徑均勻度無法兼得。這一問題削弱了定向冷凍法大規(guī)模生產定向支架（尤其是用于整塊肉的大尺寸支架）的潛力。

2.3.2 機械拉伸

機械拉伸法是對材料沿部分方向施加拉力，從而使材料沿拉伸方向具有更高取向性的方法。其定向效果受材料的力學性能（如彈塑性）、天然結構、拉伸方式等因素影響。該法的最大優(yōu)點在于操作簡單、快速，易于規(guī)模化。Wang Sha等對BC膜施加40%應力的濕拉伸，然后在60 ℃下熱壓以固定結構，從而獲得高度定向排列的纖維結構（圖3）。Mredha等在對單層材料進行線性機械拉伸的基礎上，將多層已拉伸材料進行平行層疊、正交層疊、軸向卷疊、同心卷疊，獲得4 種形式的具有各向異性結構與力學性能的3D材料。這可用于制備各向異性的纖維素細胞培育肉支架，進而生產可調控的、擁有多種紋理方向和多層次咀嚼感的全切肉。

圖3 經40%應力濕拉伸的BC薄膜側視圖[60]Fig. 3 Side view of 40% wet-drawn bacterial cellulose film[60]

2.3.3 針對BC的定向方法

除上述方法外，對于BC可采取以下特定方式獲得高取向性結構：在產BC微生物的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過引入條紋溝槽狀模板的方式將微生物的運動路徑限制在單向通道內（模板法），或通過施加靜電場的方式誘導微生物沿電場力方向運動（電場法），或通過使用外壁透氧的圓柱形攪拌式生物反應器（旋轉攪拌法），均可原位生成定向的BC支架。將帶有針狀陣列的模具放入微生物培養(yǎng)體系中靜態(tài)發(fā)酵（模具法），則可得到帶有定向孔道的BC。

2.4 天然精細結構獲取——植物去細胞化

去細胞法是指將細胞生物組織或器官中的細胞內容物去除以獲取ECM的方法，近年來在組織工程與再生醫(yī)學領域內得到持續(xù)關注。這種方法是直接獲取而非模擬ECM，因此可獲得其他生物材料難以比擬的生物相容性，并且其原料往往廣泛易得。然而，如何完全去除DNA、RNA等可能引起免疫反應的異體乃至異種物質，同時盡可能多地保留ECM且不改變其結構原貌，有待更多研究。此外，去細胞化試劑多數不可食用，殘留在用于細胞培育肉的生物材料中可能帶來食品安全隱患。目前，去細胞化的主要研究對象是動植物而非微生物。從動物福利、生產成本、去細胞化操作難度等方面考慮，應用于細胞培育肉的去細胞化生物材料優(yōu)先以植物為原料。

植物的根、莖、葉作為營養(yǎng)器官，具有可運輸水和營養(yǎng)物質的天然通道（直徑范圍大，可滿足生物材料的多種孔隙需求），而原有的薄壁細胞等細胞排列整齊。上述天然結構在去除細胞內含物后可通過遺留的細胞壁而維持，利于用作支架，輔助整塊細胞培育肉生產。細胞壁中的主要化學成分為天然纖維素，具有親水性、耐久性、生物相容性和可食用性。

對于植物原料，根、莖、葉、果實均已被研究用于制備去細胞化生物材料。其中，蔬菜、水果的莖、葉、果實在已有研究中更為常見。去細胞化可保留導管、維管束等特定組織的結構，這些結構將利于被接種細胞的附著、排列、遷移、分化，以及營養(yǎng)物質交換，因此該方法目前成為生物醫(yī)學工程的熱點話題（如替代器官），并且已在細胞培育肉領域用于制備支架。Allan等對觀賞草進行去細胞化并用C2C12細胞測試細胞生長效果，發(fā)現觀賞草的天然溝槽結構使其具有優(yōu)越的誘導細胞定向能力（與草葉溝槽夾角＜10°的細胞占50%，夾角＜20°的細胞占70%）。Jones等用富含維管網絡的去細胞化菠菜葉培養(yǎng)初級牛衛(wèi)星細胞，發(fā)現該支架上的細胞可以較長時間（14 d）保持高細胞活性（99%）。對于植物去細胞化常用植物種類與部位、方法與試劑等內容細節(jié)，可參考已有綜述，此處不再贅述。

去細胞化用于生物醫(yī)學材料的優(yōu)點包括：1）與體內ECM高度近似，具有良好的細胞相容性；2）該過程脫除細胞核、細胞質等細胞器，從而去除大多數免疫活性成分、DNA等物質，因此具有低排異性或副作用。

去細胞化用于細胞培育肉支架材料的優(yōu)點則在于以下4 個方面：1）去細胞化可充分利用植物去除原有細胞后留下的天然3D多孔結構，有效簡化支架制備過程，并且可為目標細胞提供尺寸合適的生長空間和真實的細胞外環(huán)境；進一步地，去細胞化有助于構建一些常規(guī)手段難以獲得的精密、復雜的微觀支架結構，如導管、維管束等，這些定向結構可以誘導細胞定向排列并實現營養(yǎng)物質輸送，利于整塊細胞培育肉組織形成。2）若采用常見蔬果的莖、葉、果實進行去細胞化，則原料來源廣泛、綠色天然、可再生、成本相對低廉、可食用，并可實現部分農林廢棄物的高值化利用。3）一些去細胞化試劑（如乙醇、乙酸、氯化鈉、次氯酸鈉）和去細胞化方法（如物理低溫凍融，或化學浸漬）成本低，并且易獲得、易實現，這有助于規(guī)?；a。4）一些去細胞化植物支架可以實現約95%及以上的高細胞活性。

但是同時，去細胞化用于細胞培育肉主要存在如下缺點或問題：1）目前主流的洗滌劑去細胞化方法所需處理時間較長，不利于商品化，如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）處理的菠菜葉從預處理到凍干結束，累計需要超過10 d。2）去細胞化支架的可食用性存疑。雖然目前研究中的原料優(yōu)選可食用的蔬果（如蘋果、菠菜、芹菜、蔥等），但是使用化學試劑法去細胞化會存在不可食用物質殘留的風險（如表面活性劑SDS），因此應關注化學試劑殘留量并與有關食品標準進行比對。一些學者提到了有毒有害試劑的安全替代品（如用聚山梨酯60替代Triton X-100），但相關替代品的去細胞化效果有待進一步證實。同時，一些化學試劑處理可能在支架中進而在細胞培育肉產品中引入異味（如次氯酸鈉、乙酸）。此外，支架的營養(yǎng)評定與感官評價需要被進一步研究。3）同一種類原料的不同個體、同一個體的不同位置均會不可避免地存在變異性，造成不同批次支架差異，不利于商品標準化。4）對于表現出良好細胞活性的去細胞化植物支架，其成功因素主要被歸結于良好的孔隙結構或定向微圖案，不具備這些物理優(yōu)勢的去細胞化植物支架的表現并不令人滿意。雖然后者可能仍與非結構的物理特性有關（如表面親水性、彈性模量），但這似乎也再次印證了支架主要化學成分天然纖維素本身在細胞黏附性方面的不足。

2.5 定制化結構獲取——3D打印

3D打印也被稱為增材制造、快速成型，是從計算機輔助設計中獲取信息并在3D打印機上建立連續(xù)的材料層從而創(chuàng)建固體物體的技術。3D打印技術可分為7 種，其中食品領域較為接受的是熱熔/室溫擠出、選擇性激光燒結/熱空氣燒結、黏結劑噴射、噴墨打印4 種。3D打印可減少原料損耗，并且可通過同一套設備制造具有多種復雜結構的產品，這一“可自由定制”特性對用于細胞培育肉領域的生物材料目前所處的初期發(fā)展階段而言尤為重要，可幫助研究人員廣泛嘗試并篩選出適合的生物材料構造。在生物醫(yī)學工程中，3D打印的應用不斷擴展，小到藥物遞送系統(tǒng)、微血管，大到人工器官乃至解剖模型（以輔助外科手術）。

如圖4所示，Erkoc等有研究者采用明膠-纖維素-海藻酸鹽復合配制生物墨水以兼顧墨水流變性、擠出成型后材料的力學性能、細胞相容性，然后通過擠出式3D打印制得多層三維填充的和空心的圓柱結構、錐形結構、帶有圓柱形和方形孔的網格結構、解剖學仿人工耳4 種結構的水凝膠。

圖4 擠出式3D打印獲得的不同結構的明膠-纖維素-海藻酸鹽水凝膠[77]Fig. 4 Gelatin-cellulose-alginate hydrogels with different structures obtained by extrusion-based 3D printing[77]

如圖5所示，Mohan等僅選用纖維素及其衍生物（CMC、CNF）為原料，以水為溶劑制成墨水，利用3D打印、冷凍干燥和脫水熱處理方法制得物理交聯(lián)的、具有200～800 μm可調大孔網格結構的支架。

圖5 孔徑可調控的3D打印CMC-CNF支架[78]Fig. 5 3D printed CMC-CNF scaffolds with adjustable pore size[78]

3 纖維素在細胞培育肉支架中的挑戰(zhàn)與潛在解決方案

3.1 細胞黏附性

天然纖維素表面的非特異蛋白吸附量低（即不含有RGD等細胞錨點），不利于哺乳動物細胞黏附。這是纖維素作為細胞培育肉支架原料的最大挑戰(zhàn)。

引入RGD三肽（Arg-Gly-Asp）可增強纖維素的細胞黏附性。RGD是在ECM中發(fā)現的具有生物活性的細胞黏附序列，可以與細胞表面的整合素（介導細胞與ECM或與其他細胞的識別和黏附）特異性結合。因此，可以在纖維素表面修飾RGD肽或者含RGD的蛋白，如纖連蛋白、層黏連蛋白、玻連蛋白、膠原或明膠等。然而，RGD與纖維素等非蛋白物質的吸附作用有限，為此可引入纖維素結合模塊（cellulose-binding module，CBM）（CBM既有對纖維素表面的高親和性與特異性，又有對幾乎任何生物活性蛋白的結合能力）作為橋梁，從而實現纖維素-RGD的牢固連接。

表面電荷改性可增強纖維素的細胞黏附性。一種方式是化學官能團改性，如陽離子化（如引入季銨基團）和強陰離子化（如引入-SO）。商業(yè)化支架中已有化學改性調節(jié)纖維素表面電荷的實例，如Cytopore微載體的主要成分是帶正電荷的二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維素，而GrowDex-T水凝膠則是帶負電纖維素，二者細胞黏附性均獲得提升。采用該方法時需要注意，修飾的官能團是否會損害纖維素可食用性。如季銨鹽雖然是提供陽離子、提升纖維素細胞黏附性的代表性物質，但是季銨鹽通常不可食用，對應改性纖維素不在批準的食品添加劑范圍內；而羧甲基基團修飾的纖維素則可食用，且細胞黏附性獲得提升。除化學官能團修飾外，另一種方式是將纖維素與其他陽離子物質復合以改變表面電荷，如天然陽離子多糖——甲殼素或殼聚糖。這種復合可以是物理共混也可以是化學交聯(lián)，并且可以在纖維素獲取時（如加入BC培養(yǎng)體系）、纖維素原料預處理時（如與已獲取的纖維素共混制備支架）、纖維素支架制備后（如將支架浸泡）等多個環(huán)節(jié)之一進行。

3.2 原料成本降低與規(guī)?；a

對于細胞培育肉行業(yè)，組織工程等領域的研究已經為其提供了堅實的技術基礎，因此目前更為迫切的問題是如何降低成本、擴大規(guī)模。纖維素作為細胞培育肉支架的潛在材料，同樣需要思考這一問題。纖維素原料的成本可大致分為前期的生產成本和后期的純化成本。

對于植物纖維素，其資源豐富、廣泛、易得，商業(yè)化植物纖維素來源主要為木材、棉花，因此前端生產成本低廉。棉花中纖維素含量高達90%，但是木材中纖維素占比約40%～47%，纖維素所在的細胞壁中還含有半纖維素、木質素、果膠等成分，因此需要進行一系列提取純化操作以達到可食用支架所需原料的高純度和均一的特定纖維形態(tài)。目前，植物纖維素已形成成熟、低廉的提純工藝（主要為酸水解、機械處理兩種）。據有關研究顯示，植物納米纖維素（CNF、CNC）在世界范圍內已實現大規(guī)模生產且產量仍不斷擴大，代表性企業(yè)的納米纖維素產量從20 kg/d（荷蘭SAPPI公司）到5 000 kg/d（加拿大Kruger公司）不等，預計納米纖維素全球產量為33×10t/年。但是為避免纖維素出現不可逆聚集或角質化，需要將纖維素保存在水溶液中，這一方面增加了運輸成本，另一方面容易導致微生物污染，增加損耗成本。對此，可先將纖維素失水干燥，運抵后進行再分散。在烘箱干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、超臨界干燥方法中，冷凍干燥與超臨界干燥可以較好地避免團聚，實現再分散，但是冷凍干燥的成本更可接受。

對于BC，其纖維素純度遠高于植物纖維素，這大幅降低了提純工藝的繁瑣程度。但是上游的BC生產工藝（即傳統(tǒng)的微生物靜態(tài)發(fā)酵工藝）存在生產狀態(tài)不連續(xù)、單批次生產時間長、占用空間大、需要的勞動力多、產率低等問題，導致BC綜合成本高（是植物纖維素的80 倍）。對此，可從菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、生物反應器方面著手。菌株方面，可進行自然突變株篩選以獲得BC高產菌株，同時，基因修飾獲得高產菌株或許是可以接受的，因為轉基因成分理論上不存在于BC中，并且BC經歷的純化過程（如1 mol/L NaOH煮沸1 h）會去除攜帶轉基因的細菌。培養(yǎng)基方面，合成培養(yǎng)基是造成BC生產成本高昂的一大主要因素。可開發(fā)廢棄物作為培養(yǎng)基成分（主要是碳源），如生物柴油生產和葡萄渣中剩余的甘油、無法食用的腐爛香蕉、酒糟水、干酪乳清、甜菜糖蜜等。與人工合成的典型HS（Hestrin and Schramm）培養(yǎng)基相比，上述培養(yǎng)基可降低成本，甚至可以增加產量。培養(yǎng)條件方面，可尋找能耗更低的培養(yǎng)條件，如進行菌株馴化使其可耐10～20 ℃低溫（一般菌株適宜溫度約為25～30 ℃），以滿足寒冷地區(qū)的BC培養(yǎng)。生物反應器方面，生物反應器為BC高效、規(guī)?；⑦B續(xù)化生產提供條件，為此可設計并優(yōu)化生物反應器，包括相對靜態(tài)條件下的反應器如盤式反應器、氣溶膠反應器、膜反應器等，以及動態(tài)條件下的反應器如球形鼓泡塔式反應器、氣升式反應器等。

3.3 材料加工性能

天然纖維素“不熔”，且“不溶”的特點使其在加工方面存在挑戰(zhàn)。具體來說，一方面，天然纖維素無法熔化，高溫下直接分解；另一方面，天然纖維素溶解性低，不溶于常見的水和有機溶劑，可溶于氯化鋰/,-二甲基乙酰胺（lithium chloride/,-dimethylacetamide，LiCl/DMAc）、-甲基嗎啉--氧化物（-methylmorpholine--oxide，NMMO）、NaOH/尿素水溶液等溶劑體系，但是這些溶劑不可食用甚至有毒有害，難以應用于細胞培育肉支架。對于纖維素溶解的原理存在兩種主流觀點，一是溶劑破壞了分子內和分子間的氫鍵網絡。與之相反，另一種觀點則認為，纖維素具有兩親性，溶劑消除了強烈影響溶解的纖維素分子間疏水相互作用。

對于天然纖維素難加工的問題，可以對纖維素進行化學改性以增強水溶性。降低DP或分子質量也有助于纖維素溶解。此外，可以選擇適用于纖維素分散液（而不是只適用于溶液）的加工方式，從而避免不可食用溶劑的引入。

3.4 力學性能

支架各項力學性能中受重點關注的是剛度，其常用評價指標為彈性模量（尤其是楊氏模量）。肌肉和脂肪細胞均對基質剛度敏感，但是不同類型的細胞對剛度有不同要求。以肌肉細胞為例，雖然在不同剛度的基質上均可形成肌管，但是所得肌管長度和肌管簇數量存在差異，并且僅在近似天然骨骼肌的剛度（楊氏模量約12 kPa）上出現含肌球蛋白或肌動蛋白條紋的肌管?；诩毎?剛度響應這一因素，Bomkamp等提出，對于肌源性細胞和脂肪源性細胞，支架的理想楊氏模量分別約為12～21 kPa和2～3 kPa。除細胞增殖與分化的角度外，從食品口感的角度考量，細胞培育肉支架在烹飪后應具有適中的剛度以保證良好咀嚼性已達到對肉品的逼真模仿，盡管目前對熱處理支架力學性能的研究極其有限。

纖維素本身剛度大。對于植物纖維素，MCC的楊氏模量約為25 GPa。受各向異性、纖維素中的晶體缺陷、結晶度、尺寸、測量方法等因素影響，CNC的楊氏模量數值不等（7.5～143.0 GPa）。BC單根纖維的楊氏模量約為80 GPa，由雙向和單向拉伸測試得到的BC膜的楊氏模量則分別為200～500 MPa和1～10 MPa。雖然纖維素材料本身的剛度大，但是纖維素支架成品的剛度受纖維素原料特性、制備方法等眾多因素影響而呈現出寬闊的可變范圍?？傮w而言，支架的剛度由材料剛度、結構剛度二者從不同維度共同決定。因此，相關研究人員可從這兩方面入手調整纖維素支架整體的剛度。

調節(jié)纖維素材料剛度的方式包括與其他材料復合、物理或化學交聯(lián)等。比如，用海藻酸鹽（1 g/100 mL）和CNF（0.15～0.75 g/100 mL）為原料、CaCO和-葡萄糖酸--內酯為交聯(lián)劑可制備楊氏模量約為5～60 kPa的水凝膠。這一剛度范圍適合肌源細胞生長，并且上述原料均可食用。再如，膠原功能化（楊氏模量（2.2±0.2）kPa）、戊二醛化學交聯(lián)（楊氏模量（4.1±0.3）kPa）均可增加去細胞化蘋果組織（（1.1±0.1）kPa）的剛度。但是來自動物的膠原和有毒的戊二醛不適于構建細胞培育肉支架，因此在復合材料、交聯(lián)材料的選擇上應慎重考量。不影響食用性的常用纖維素-纖維素交聯(lián)材料主要為檸檬酸。對于纖維素-復合材料交聯(lián)，交聯(lián)劑是否使用及選用種類視二者物理化學特性而定。比如利用蛋白和碳水化合物混合后在高溫下發(fā)生的美拉德反應，可實現纖維素與大豆蛋白等非動物源蛋白的交聯(lián)。此外，纖維素結晶度與材料剛度呈正相關，因此可選用適宜結晶度的纖維素制備支架。

減小結構剛度的方式包括前文中提到的造孔、構建定向孔道等。隨著孔隙度增加，支架中起力學支撐的實質減少，整體結構更為松散，剛度降低。Isobe等通過調節(jié)纖維素濃度，制備出楊氏模量30 kPa～1.3 MPa的纖維素水凝膠。而在通過鹽析法引入直徑約為300 μm的孔隙后，材料的楊氏模量降低至5.4 kPa。

此外，為滿足理想的支架剛度，去細胞化植物支架似乎是最簡便的選擇。植物支架在去細胞化處理后楊氏模量普遍下降，多數未改性去細胞化植物支架的楊氏模量在1 kPa（蘋果萼筒組織）～21 kPa（菠菜葉）范圍內，這與期待的細胞培育肉支架剛度相接近，省去大量額外操作。當然，這一合適的模量區(qū)間也得益于研究者傾向于選擇較為柔軟的植物樣品，比如禾本科植物的葉片。實際上，在植物種類、來源部位、處理方式等多種因素影響下，去細胞化植物的剛度可以實現楊氏模量從千帕級到吉帕級的大范圍波動。

4 結 語

本文討論了纖維素在細胞培育肉支架中的應用潛力與挑戰(zhàn)。細胞培育肉領域迫切尋求非動物源、可食用、成本低廉的支架原料。細胞培養(yǎng)常用的可食用支架材料包括膠原或明膠、殼聚糖、透明質酸、大豆蛋白、海藻酸鈉、瓊脂糖、纖維素等。在限定非動物來源的情況下，纖維素具有明顯的成本優(yōu)勢。纖維素主要存在于植物細胞壁，是自然界中含量最豐富的高分子，作為膳食纖維有助人體健康。此外，纖維素已在醫(yī)學、生物領域具有研究基礎和商業(yè)化生產基礎。因此，纖維素有望成為優(yōu)質支架原料，推動細胞培育肉產業(yè)發(fā)展。

本文介紹了適用于纖維素基細胞培育肉支架的制備方法。多孔結構可通過冷凍干燥、發(fā)泡、犧牲材料、鹽析等方式形成。分化用支架所需的定向結構可通過定向冷凍、機械拉伸等實現。微載體所需的微球結構更適合由微生物原位生成球形BC而獲得。因此，如需獲得具有兩種及以上上述結構的支架，可同時采取多種方式。如希望僅用一種方法獲得上述多種特定結構的支架，則可通過去細胞化法獲得天然精細結構，或者通過3D打印獲得可定制化的復雜結構。

然而，纖維素在細胞培育肉支架中存在一定挑戰(zhàn)。對于細胞黏附性有限的問題，可以引入RGD肽和含RGD的蛋白，更經濟的方法是進行表面電荷改性。對于不易溶解導致加工困難的問題，可使用水溶性良好的纖維素衍生物，此外也可采用非溶解狀態(tài)纖維素制備支架，以規(guī)避有毒溶劑問題。對于纖維素剛度與細胞培育肉理想支架差異較大的問題，可以通過調控支架結構、交聯(lián)、與其他材料復合、選擇合適結晶度的纖維素等方式調節(jié)剛度，不過更直接可行的方法是以去細胞化植物為支架。

整體而言，雖然植物纖維素支架的工藝更成熟，但BC和去細胞化纖維素分別以其原位調控成形的靈活性和簡單操作即可獲得的精細結構而在細胞培育肉支架中同樣具有良好前景。纖維素基生物材料的設計與優(yōu)化有待相關科研人員進一步探索研究，從而助力細胞培育肉生產。