郭薇丹，周湘人，徐莉娜，付湘晉,3,4,*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省特殊醫(yī)學(xué)食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；3.湖南省營養(yǎng)健康品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；4.湖南省調(diào)味料綠色制造工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004）

草魚是世界上養(yǎng)殖量、產(chǎn)量最高的魚種，年產(chǎn)量約400萬 t。作為中國特色的養(yǎng)殖品種，草魚肉質(zhì)鮮美，富含必需氨基酸及多不飽和脂肪酸，營養(yǎng)價(jià)值高。低溫能抑制魚體內(nèi)酶的活性和微生物的生長繁殖，冷藏是草魚常用的貯存方法。冷藏過程中草魚肉品質(zhì)變化是研究熱點(diǎn)，如冷藏過程中蛋白質(zhì)降解、脂肪氧化及揮發(fā)性物質(zhì)、核苷酸、生物胺含量和微生物數(shù)量變化等都已有研究報(bào)道。相應(yīng)的研究結(jié)果用于解釋品質(zhì)形成、劣化機(jī)制及建立品質(zhì)、新鮮度指標(biāo)，如硫代巴比酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid substances，TBARS）值、值（魚類新鮮度評價(jià)指標(biāo)）、生物胺含量、菌落總數(shù)等。

代謝物組學(xué)是解析食品品質(zhì)形成的新工具，可從整體全面分析食品中小分子成分變化。有文獻(xiàn)報(bào)道了豬肉、貝肉、鴨肉、雞肉等在冷藏過程中代謝物組的變化。例如，Muroya等基于毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜的豬肌肉代謝組學(xué)分析探明了豬肉成熟過程中相關(guān)代謝途徑的機(jī)制，宰后豬背最長肌、股中間肌中腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）和肌苷（inosine，HxR）的含量在成熟過程中變化規(guī)律不同，腺苷酸激酶和5’-核苷酸酶是控制豬肉品質(zhì)關(guān)鍵酶，與豬肉風(fēng)味的形成密切相關(guān)。Aru等分析了0 ℃和4 ℃下貽貝腐敗過程中的代謝譜變化，在貯存過程中，醋酸鹽、乳酸、琥珀酸、丙氨酸、支鏈氨基酸、三甲胺含量顯著增加，同時(shí)甜菜堿、肌堿和牛磺酸等含量逐漸降低，它們可能是潛在的貽貝腐敗生物標(biāo)志物。Liu Chunli等分析了鴨肉代謝物與其育齡之間的關(guān)系，結(jié)果表明4 個不同育齡期的鴨肉代謝物之間存在顯著差異，隨著育齡的增長，乳酸和鵝肌肽含量增加，富馬酸、甜菜堿、?；撬?、HxR、取代烷基的游離氨基酸含量減少。Wen Dongling等發(fā)現(xiàn)雞肉在冷藏過程中大多數(shù)氨基酸含量減少，而生物胺含量增加，此外結(jié)合IMP及其代謝產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)冷藏雞肉的保質(zhì)期最長為6 d，最佳食用時(shí)間應(yīng)為冷藏4 d之內(nèi)。

冷藏草魚肉的代謝組學(xué)鮮有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatograph-time of mass spectrometer，GC-TOF-MS）法和透射掃描電子顯微鏡分析草魚肉冷藏過程中（4 ℃，0、24、72 h）代謝物組和超微結(jié)構(gòu)的變化，通過數(shù)據(jù)分析篩選，鑒定變化顯著的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物及途徑，以期為冷藏草魚肉品質(zhì)形成機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚（）購自長沙樂爾樂超市。

甲醇（色譜純） 德國CNW科技公司；氯仿、吡啶（色譜純） 上海Adamas有限公司；甲氧銨鹽（分析純） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；核糖醇（分析純） 美國Sigma公司；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）試劑（含體積分?jǐn)?shù)1%三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMCS）） 美國Regis公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890 GC-TOF-MS、DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius公司；Heraeus Fresco17離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司；LNG-T98真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草魚的預(yù)處理

參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行草魚預(yù)處理，選?。? 000±110）g/尾鮮活草魚，擊打頭部致死，去內(nèi)臟、鱗、頭，剖邊，冷水（4 ℃）清洗，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭魚體表面，在超凈工作臺中用無菌刀片取魚背部白肉，切成約3 cm×3 cm×2 cm的長方體，裝入無菌保鮮袋，（4.0±0.5）℃冷藏0、24、72 h。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察魚肉結(jié)構(gòu)

參照付湘晉等的方法采用透射電子顯微鏡觀察魚肉結(jié)構(gòu)。

1.3.3 魚肉代謝物分析

1.3.3.1 提取及衍生化

取無刺白肉（200±1）mg于5 mL EP管中，加入1 800 μL預(yù)冷提取液（甲醇、水體積比3∶1），再加入20 μL核糖醇溶液（200 mg/mL），渦旋30 s；加入鋼珠，35 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min（冰水?。粚颖? ℃、10 000×離心15 min；小心移取150 μL上清液于1.5 mL EP管中；在真空濃縮器（28 ℃）中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入40 μL 20 mg/mL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶），輕輕混勻后，80 ℃孵育30 min；向樣品中加入60 μL BSTFA試劑（含有1% TMCS），將混合物70 ℃孵育1.5 h。取出離心管，冷卻至室溫，加1 mL己烷，渦旋30 s使其混合均勻，冷凍離心，取上清液待GC-TOF-MS分析。

1.3.3.2 GC-TOF-MS分析

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL；不分流；進(jìn)樣口溫度280 ℃，載氣氦氣；流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，10 ℃/min升溫到310 ℃，保持8 min；MS條件：傳輸線溫度280 ℃，電子電離源，電離電壓-70 eV，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～500 Da。

1.3.3.3 代謝物定性、定量分析

使用ChromaTOF V 4.3x軟件對MS數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。代謝物定性使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行MS圖譜及保留指數(shù)匹配；以核糖醇為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，采用SIMCA軟件對代謝物組成進(jìn)行主成分分析。＜0.05且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于1.5或小于1/1.5的物質(zhì)識別為差異代謝物。

1.3.4 分子對接分析

利用AutoDock Vina軟件模擬胡椒堿、柚皮素、茉莉酸甲酯、馬錢子苷、-蛔蒿素、樅酸、3,4-二羥基扁桃酸與黃嘌呤氧化酶的相互作用。分別從美國國家生物技術(shù)信息中心藥物信息綜合數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和蛋白數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）（http://www.rcsb.org/pdb）中獲得小分子代謝物的三維結(jié)構(gòu)和黃嘌呤氧化酶（PDB：1FIQ）的晶體結(jié)構(gòu)，并保存為mol2和pdb格式。采用Autodock Vina等軟件處理上述文件，并保存為pdbqt文件。設(shè)置對接盒子，保存config.txt（配置文件）。最后，采用Autodock Vina軟件進(jìn)行藥物分子與受體蛋白的對接，完成后用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用GraphPad軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏對草魚肉超微結(jié)構(gòu)的影響

新鮮草魚肉及冷藏24、72 h魚肉的超微結(jié)構(gòu)見圖1。新鮮魚肉肌節(jié)清晰、整齊，肌纖維間隙較小；隨著冷藏時(shí)間延長，肌纖維間隙變大、排列散亂，部分肌節(jié)斷裂；與Ge Lihong等的研究結(jié)果一致。冷藏過程中，魚肉肌節(jié)斷裂，肌纖維間隙變大，主要與蛋白酶（如組織蛋白酶、鈣激蛋白酶、Caspase等）降解肌原纖維蛋白有關(guān)。隨著冷藏時(shí)間延長，肌纖維間隙中的線粒體顆粒明顯腫脹，在冷藏72 h魚肉中，部分線粒體顆粒崩解。在冷藏金邊鯛（）魚肉研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著冷藏時(shí)間的延長，線粒體逐漸崩解，線粒體完整性可作為魚肉新鮮度指標(biāo)。

圖1 冷藏對草魚肉超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of cold storage on the ultrastructure of grass carp muscle

2.2 冷藏草魚肉代謝物組分析結(jié)果

2.2.1 冷藏草魚肉差異代謝物識別

采用GC-TOF-MS從草魚肌肉中共檢測到211 種代謝物，包括糖類、氨基酸、脂肪酸、核苷酸和膽固醇等。含量最高的代謝物是肌酸（25～30 mg/g），表明肌酸激酶途徑在草魚肉能量代謝中有關(guān)鍵作用。肌酸激酶與胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）再生有直接關(guān)系，當(dāng)魚死亡且沒有能量可供利用時(shí)，磷酸肌酸就會迅速轉(zhuǎn)化為肌酸。Savorani等在金邊鯛肉中也檢測到大量肌酸，可能的原因是肌酸及磷酸肌酸是魚肉中重要的能量儲存物質(zhì)。草魚肉中含量較高的其他氨基酸有絲氨酸（0.20～0.76 g/kg）、丙氨酸（6.90～12.69 g/kg）、甘氨酸（2.19～4.36 g/kg）、?；撬幔?.20～9.27 g/kg）、酪氨酸（0.50～1.24 g/kg）、氨基丙二酸（0.47～1.78 g/kg）。魚肉是膳食中游離態(tài)牛磺酸主要來源之一，草魚肉中?；撬岷枯^高，是其高營養(yǎng)價(jià)值的體現(xiàn)，且?；撬岷颗c膽固醇代謝途徑密切相關(guān)。對冷藏期間草魚肉代謝物組成進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖2所示，不同貯藏時(shí)間的樣品分別聚集在不同象限。

圖2 不同冷藏時(shí)間草魚肉代謝物的主成分分析結(jié)果Fig. 2 Principal component analysis of metabolites in grass carp muscle at different cold storage time

以含量顯著變化（＜0.05）且FC＞1.5或＜1/1.5的代謝物為差異代謝物。如圖3所示，冷藏72 h草魚肉中識別到42 種差異代謝物，其中18 種代謝物含量顯著增加，包括氨基酸（纈氨酸、-半胱氨酸、GABA）、核苷酸（腺苷、尿嘧啶、尿苷、胞苷、HxR和5,6-二氫尿嘧啶）、有機(jī)酸（乳酸、葡萄糖二酸）以及苯乙醛、磷酸、3-羥基丁酸、4-HB。其中葡萄糖二酸、苯乙醛、磷酸、5,6-二氫尿嘧啶（數(shù)據(jù)未列出）在新鮮魚肉中的含量低于冷藏魚肉的檢出限，是冷藏過程中新產(chǎn)生的代謝物。冷藏72 h草魚肉中24 種代謝物含量顯著減少，主要包括脂肪酸類、糖類、膽固醇激素類等；其中丙酮酸鹽、亞麻酸含量變化最大。

圖3 冷藏72 h草魚肉中識別的差異代謝物Fig. 3 Differentiated metabolites identified in grass carp muscle during 72 h cold storage

大部分差異代謝物歸屬于糖酵解代謝、ATP代謝、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)代謝、氨基酸及脂肪酸代謝。膽固醇代謝途徑中腎上腺甾酮、雄酮、三羥基膽甾烷含量顯著降低；而5-二氫皮質(zhì)醇、三羥基糞甾烷含量顯著增加，其中三羥基膽甾烷、三羥基糞甾烷含量雖發(fā)生顯著變化，但FC在1/1.5～1.5之間。膽固醇類物質(zhì)是膜結(jié)構(gòu)中主要成分之一，膽固醇類代謝物含量的變化表明冷藏過程中魚肉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與透射電子顯微鏡觀察結(jié)果（圖1）一致。

此外，差異代謝物中苯乙醛可依賴于NADH的醇脫氫酶催化轉(zhuǎn)化成苯乙醇，苯乙醛、苯乙醇都具有花、水果香味，可能對草魚肉氣味有一定貢獻(xiàn)。本研究還發(fā)現(xiàn)馬錢子苷、松香酸含量顯著減少，這些植物性代謝物可能來源于草魚的食物。

2.2.2 冷藏草魚肉糖酵解途徑代謝物及酸類化合物累積

動物在宰殺后，肌肉中供氧終止，有氧代謝基本停止，糖類主要進(jìn)行無氧酵解。冷藏草魚肉中糖酵解代謝途徑相關(guān)代謝物含量變化見圖4。冷藏過程中，糖原、蔗糖、葡萄糖、丙酮酸的含量顯著降低（＜0.05），乳酸、葡萄糖二酸含量顯著增加（＜0.05），但葡萄糖二酸含量遠(yuǎn)低于乳酸。乳酸水平增加至貯藏初始的2 倍。此外，磷酸含量從低于檢出限（2 mg/kg）增加到400 mg/kg（磷酸參與通路較復(fù)雜，圖4H未列出），在有機(jī)酸中含量僅低于乳酸。因此磷酸、乳酸的累積是冷藏草魚肉pH值下降的主要原因之一。

圖4 冷藏對草魚肉中糖酵解途徑代謝物的影響Fig. 4 Effect of cold storage on glycolysis metabolites in grass carp muscle

2.2.3 冷藏草魚肉三羧酸循環(huán)代謝物含量的變化

冷藏魚肉中檢測到大量TCA相關(guān)代謝物，如檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸（圖5）。其中只有琥珀酸的含量顯著降低（＜0.05）；同時(shí)，4-HB、3-羥基丁酸以及GABA含量顯著增加（＜0.05），表明冷藏草魚肌肉中TCA循環(huán)代謝途徑基本停止，琥珀酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛，致使GABA與4-HB含量顯著增加。

圖5 冷藏對草魚肉中TCA循環(huán)代謝物的影響Fig. 5 Effect of cold storage on TCA cycle metabolites in grass carp muscle

不同肉類在冷藏中TCA循環(huán)代謝物的變化規(guī)律有一定差異，如豬肉、河蚌冷藏過程中琥珀酸含量均顯著增加（＜0.05），而冷藏鴨肉中TCA循環(huán)代謝物中只發(fā)現(xiàn)富馬酸含量顯著下降（＜0.05）。琥珀酸含量增加及富馬酸含量降低都與SDH的失活有關(guān)。SDH是TCA代謝途徑中唯一定位于線粒體內(nèi)膜上的酶，可催化琥珀酸氧化生成富馬酸，并且SDH對線粒體膜結(jié)構(gòu)的變化非常敏感，線粒體膜結(jié)構(gòu)失常會導(dǎo)致SDH失活。草魚肌肉冷藏過程中線粒體膜結(jié)構(gòu)逐漸崩解（圖1），宰殺后線粒體在活性氧（reactive oxygen species，ROS）、凋亡蛋白酶、磷脂酶等多因素作用下，其膜結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，因此，宰后肉類中琥珀酸含量的變化可間接反映線粒體膜結(jié)構(gòu)完整性。GABA、4-HB含量的變化與冷藏時(shí)間正相關(guān)。冷藏72 h，4-HB含量從5 mg/kg累積到約60 mg/kg，變化趨勢與值類似，可作為檢測冷藏草魚肉新鮮程度的潛在指標(biāo)。在值測定中需用較高濃度的高氯酸提取ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、AMP，由于高氯酸可助燃，具強(qiáng)腐蝕性，所以值的測定具有一定危險(xiǎn)性。相對而言，琥珀酸、4-HB、GABA含量的測定更加安全。

2.2.4 冷藏對草魚肉中脂肪酸、氨基酸含量的影響

草魚肉富含多不飽和脂肪酸，非常易被氧化，產(chǎn)生異味。冷藏72 h草魚肉中，十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、順-11-二十碳烯酸、花生酸、亞麻酸、花生四烯酸等脂肪酸及單棕櫚酸甘油酯、2-油酸單甘油酯、1-油酸單甘油酯（部分物質(zhì)含量變化FC在1/1.5～1.5之間，故數(shù)據(jù)未列出）的含量顯著降低（＜0.05），只有壬二酸含量顯著增加（＜0.05）（圖3）。亞麻酸、花生四烯酸、壬二酸含量變化見圖6A、B。壬二酸來源于油酸、亞油酸、亞麻酸的氧化，可能途徑是脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）催化這些脂肪酸的C9和C10之間雙鍵，形成C10氫過氧化物，再斷裂。LOX具有催化位置特異性，以花生四烯酸為底物，可分為9-、12-、15-LOX等；不同魚中LOX有一定差異，如本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)白鰱魚肉中的LOX主要是12-LOX；草魚肉中LOX已有大量報(bào)道，但還鮮有研究鑒定其底物特異性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，草魚肉中LOX可能主要是9-LOX。

圖6 冷藏對草魚肉中脂肪酸、氨基酸的影響Fig. 6 Effect of cold storage on fatty acids and amino acids in grass carp muscle

氨基酸的組成也會對魚肉的風(fēng)味造成影響。草魚肉冷藏72 h，氨基酸中的差異代謝物只有纈氨酸和-半胱氨酸（＜0.05）（圖3），冷藏期間纈氨酸和-半胱氨酸含量隨時(shí)間延長顯著增加（圖6C、D）。不同肉類冷藏過程中氨基酸含量變化規(guī)律不同，如冷藏鴨肉中鵝肌肽含量隨冷藏時(shí)間延長而顯著增加，但?；撬岷匡@著降低；冷藏河蚌肉中支鏈氨基酸和丙氨酸含量顯著增加，牛磺酸含量顯著降低（＜0.05）；冷藏雞肉中肌肽、絲氨酸、酪氨酸、精氨酸含量隨著冷藏時(shí)間延長而減少，而色氨酸和鳥氨酸含量分別在貯藏0～2 d和0～4 d增加，隨后才減少。肉類貯藏過程中氨基酸的增加主要源自內(nèi)源蛋白酶催化降解蛋白質(zhì)，溶酶體組織蛋白酶是魚肉蛋白質(zhì)降解的主要蛋白酶，主要降解低分子質(zhì)量的肌原纖維蛋白。

如圖6所示，亞麻酸、花生四烯酸含量在0～24 h內(nèi)即顯著降低，纈氨酸和-半胱氨酸含量在24～72 h才顯著增加；其可能機(jī)制是冷藏草魚肉中脂肪先發(fā)生氧化降解產(chǎn)生ROS，ROS的大量累積導(dǎo)致溶酶體失穩(wěn)，釋放組織蛋白酶，降解魚肉蛋白。冷藏牦牛肉、白鰱魚溶酶體的研究也表明，膜脂質(zhì)氧化、降解是溶酶體失穩(wěn)的主要原因之一。溶酶體中含有大量低分子質(zhì)量活性鐵，ROS可以在細(xì)胞膜上自由擴(kuò)散，然后與亞鐵離子相互作用，發(fā)生芬頓反應(yīng)，從而產(chǎn)生更多的ROS如羥自由基，參與脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速魚肉的脂肪氧化進(jìn)程。

2.2.5 冷藏對草魚肉中ATP代謝的影響

ATP的降解代謝途徑對魚肉品質(zhì)形成有重要影響。ATP降解產(chǎn)物ADP、AMP、IMP都具有鮮味，特別是IMP，是魚肉鮮味的主要呈味物質(zhì)，而進(jìn)一步降解的產(chǎn)物HxR、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）、黃嘌呤都有苦味，對魚肉滋味有負(fù)面影響。值為ATP降解產(chǎn)物HxR和Hx在ATP系列分解產(chǎn)物（ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx）含量中的占比，是評價(jià)魚肉新鮮度的重要指標(biāo)。草魚肉中ATP含量在冷藏24 h內(nèi)下降到低于檢出限（數(shù)據(jù)未列出），從圖7可看出，AMP含量在冷藏24 h內(nèi)快速降低（＜0.05），與文獻(xiàn)[23]中魚肉ATP含量較低，一般在宰后1～2 d消耗殆盡的報(bào)道一致；冷藏72 h期間，IMP含量在300～450 mg/kg，與文獻(xiàn)[29]報(bào)道基本一致；HxR含量顯著增加（＜0.05），從約2 g/kg增加到約22 g/kg，而Hx含量低于檢出限。不同魚肉宰后HxR和Hx的累積有顯著差異，并一般以其中一種為主，如比目魚、多線魚主要累積Hx，平鮋和太平洋鱈魚主要累積HxR，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，草魚主要累積HxR。

圖7 冷藏對草魚肉中ATP代謝物的影響Fig. 7 Effect of cold storage on ATP metabolites in grass carp muscle

HxR可由IMP在磷酸酶催化下脫磷酸生成，也可由腺苷在腺嘌呤脫氨酶催化下生成。冷藏72 h魚肉中，HxR含量是IMP、磷酸的幾十倍，是AMP、ADP、ATP的幾百倍，表明冷藏草魚肉中HxR的主要來源可能不是ATP降解，而是其他途徑。DNA、RNA、NAD、NADP等降解均可產(chǎn)生腺苷，腺苷再脫氨基轉(zhuǎn)化為HxR，草魚肉中DNA、RNA總含量只有1.5 g/kg左右，NAD、NADP含量均可以達(dá)到10 g/kg以上，所以草魚肉中HxR的主要來源更可能是NAD和NADP降解，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。NAD和NADP降解率和貯藏時(shí)間呈正相關(guān)，即源于NAD和NADP降解的HxR累積量與貯藏時(shí)間呈正相關(guān)，所以，即使HxR主要源于NAD和NADP降解，也不影響值作為魚肉新鮮度指標(biāo)。

HxR在黃嘌呤氧化酶催化下，轉(zhuǎn)化成Hx，但本實(shí)驗(yàn)樣品中Hx含量低于檢出限，推測是黃嘌呤氧化酶活性被抑制。根據(jù)代謝組學(xué)測定結(jié)果，草魚肉中含有胡椒堿、柚皮素、馬錢子苷等植物次級代謝物；文獻(xiàn)[32-33]報(bào)道植物次級代謝物（如生物堿、植物多酚）可抑制黃嘌呤氧化酶活性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過分子對接模擬方法分析草魚肉中檢測到的植物次級代謝物與黃嘌呤氧化酶的相互作用，如表1所示，胡椒堿、柚皮素、茉莉酸甲酯、馬錢子苷、-蛔蒿素、樅酸、3,4-二羥基扁桃酸、松香酸與黃嘌呤氧化酶結(jié)合能分別是-38.2、-34.4、-23.1、-29.4、-36.5、-36.5、-27.3、-20.2 kJ/mol，一般而言，結(jié)合能小于-21 kJ/mol表明配體與受體之間可形成穩(wěn)定的復(fù)合物；特別是馬錢子苷、3,4-二羥基扁桃酸與黃嘌呤氧化酶的對接位點(diǎn)位于黃嘌呤催化活性口袋附近（圖8）；所以，胡椒堿、柚皮素、茉莉酸甲酯、馬錢子苷、-蛔蒿素、樅酸、3,4-二羥基扁桃酸可能對黃嘌呤氧化酶有較強(qiáng)的抑制作用，這可能也是HxR含量較高的原因之一。

表1 冷藏草魚中植物次級代謝物與黃嘌呤氧化酶的Vina對接結(jié)合能Table 1 Vina docking binding energy of plant secondary metabolites with xanthine oxidase in refrigerated grass carp

圖8 黃嘌呤氧化酶與馬錢子苷（A）、3,4-二羥基扁桃酸（B）分子對接情況Fig. 8 Molecular docking of xanthine oxidase with loganin (A) and 3,4-dihydroxymandelic acid (B)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用GC-TOF-MS和透射掃描顯微鏡分析了草魚肉4 ℃冷藏0、24、72 h后代謝物組、超微結(jié)構(gòu)的變化。透射掃描顯微鏡結(jié)果顯示新鮮魚肉肌節(jié)清晰、整齊，肌纖維間隙較?。浑S著冷藏時(shí)間延長，肌纖維間隙變大、排列散亂，部分肌節(jié)斷裂。代謝組學(xué)共鑒定到211 種代謝物，識別出42 種差異代謝物；通過分析這些代謝物在冷藏過程中的含量變化發(fā)現(xiàn)，冷藏過程中，草魚肉中琥珀酸含量顯著減少，4-HB、GABA含量顯著增加，可能是檢測冷藏草魚肉新鮮度的潛在指標(biāo)；脂肪氧化降解先于蛋白質(zhì)降解；草魚肉含有的胡椒堿、柚皮素、馬錢子苷等植物次級代謝物可能可通過抑制黃嘌呤氧化酶影響魚肉核苷酸代謝及魚肉滋味。