吳靖娜，潘 南，陳曉婷，陳 貝，劉智禹,*

（1.廈門醫(yī)學院，海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013）

惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類身體健康和生命安全的常見疾病，目前化療仍是其主要的治療方法之一，然而，化療藥物在消滅腫瘤細胞的同時，會導致患者腸道炎癥反應造成腸道菌群紊亂，破壞腸道上皮屏障作用及腸道的免疫作用，從而引起其他病癥，如骨髓抑制、肝損傷等疾?。淮送?，臨床診斷顯示，接受長期化療的患者會出現(xiàn)免疫抑制的狀況，導致機體對抗原的應答能力出現(xiàn)抑制甚至缺失的現(xiàn)象，所以多數(shù)患者在治療期間會被給予適當?shù)拿庖哒{節(jié)劑來緩解免疫抑制現(xiàn)象。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是一種常用的化療藥物，其不僅會損傷機體的正常細胞，而且容易誘發(fā)機體的免疫功能低下，已成為建立免疫抑制實驗動物模型的常用藥物。免疫抑制是一種表現(xiàn)為臨時性或永久性的免疫應答功能障礙的免疫反應，大量研究表明，多糖可通過激活固有免疫細胞、適應性免疫細胞、補體系統(tǒng)和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）的表達，從而提升機體的免疫功能，是一種非特異性免疫增強劑，能夠以多靶點、多通道及多重效應的方式從免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質對機體免疫系統(tǒng)進行調控。如羊棲菜多糖對CTX誘導的免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖和細胞因子分泌有明顯的促進作用；雙孢菇子實體多糖、菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖能夠恢復CTX誘導的免疫抑制小鼠胸腺和脾臟臟器指數(shù)，顯著提高免疫抑制小鼠血清中免疫相關細胞因子和IgG的分泌水平，增強巨噬細胞吞噬能力，具有明顯的免疫增強能力；黑虎掌菌子實體多糖能夠促進免疫抑制小鼠血清和脾臟中Ig和細胞因子的生成，增強細胞免疫和體液免疫應答作用，對CTX誘導的免疫抑制具有保護作用；香菇多糖能增強免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，促使脾臟淋巴細胞增殖分化和血清溶血素形成，提高小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，降低血清中細胞因子IL-10的水平，提高血清Ig含量，逆轉CTX誘導的免疫抑制。因此，尋找食源性多糖并闡明其發(fā)揮免疫調節(jié)活性的具體作用機制，可以為食源性免疫調節(jié)劑的開發(fā)與應用提供參考。

海洋藻類含有豐富的活性物質，從藻類中提取的多糖已被證明具有多種治療功效。紅毛藻（）屬于紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜屬植物，生長于亞寒帶至亞熱帶區(qū)域，我國的主要產(chǎn)地在福建莆田。目前，對于紅毛藻中多糖的研究主要集中在制備工藝及活性評價，如宋田源等的研究結果顯示紅毛藻中多糖具有潛在的降血壓、降血糖和降血脂的活性；詹慧等通過構建酶活力和細胞模型，同樣證明了紅毛藻中多糖具有降血脂活性；余剛等的研究結果表明紅毛藻中多糖具有顯著的體外免疫誘導活性；孫惠潔和吳云輝等的研究結果顯示紅毛藻中多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基具有明顯的清除能力，具有一定的體外抗氧化活性；何萍萍等的研究結果顯示紅毛藻中多糖對HO誘導氧化損傷的Caco-2細胞具有保護作用；張一非等在優(yōu)化紅毛藻中多糖提取工藝基礎上，對其抗光氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)多糖質量濃度為0～200 μg/mL時具有抗人皮膚成纖維細胞光氧化損傷能力。本課題組前期從紅毛藻中提取獲得一種分子質量約為333 kDa的紅毛藻多糖（polysaccharides，BFP），其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5 種單糖組成。本研究通過腹腔注射CTX構建免疫抑制小鼠模型，從多個角度初步探討B(tài)FP對免疫抑制小鼠的保護作用及其作用機制，以期為BFP開發(fā)成食源性免疫調節(jié)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SPF級BALB/c小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

BFP由課題組自制。

CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液 上海碧云天生物技術有限公司；乳酸脫氫酶測試盒 南京建成生物工程研究所；胎牛血清、預染蛋白Marker 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基 美國Corning公司；YAC-1細胞、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-2、IgG、IgA、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、核因子（nuclear factor，NF）-κB酶聯(lián)免疫吸附測試（enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒、磁珠法總RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex試劑盒上海美軒生物科技有限公司；麗春紅染色液 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；增強型化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL） 美國Millipore公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 瑞士Roche公司；Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、IL-6、TNF-α抗體武漢三鷹生物科技有限公司；TLR9抗體、核苷酸結合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）1抗體、NOD2抗體 英國Abcam公司；細胞激活劑、固定破膜套裝（固定/濃縮工作液、孵育緩沖液）、抗鼠CD3、CD25、CD19、CD4、CD8、IL-17抗體 美國BD公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3酶標儀、311二氧化碳培養(yǎng)箱、Fresco低溫冷凍離心機 美國Thermo公司；FACS Calibur流式細胞儀 美國BD公司；Scepter細胞計數(shù)器美國Millipore公司；7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；165-8001小型垂直電泳槽、164-5050基礎電泳儀、170-3930小型轉印槽 美國Bio-Rad公司；164-5050超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組

實驗小鼠4～5 周齡，體質量（18±2）g，維持每天12 h的交替光照，25 ℃恒溫環(huán)境，充足食物和水供給，在SPF級動物房中進行適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。60 只小鼠隨機分為6 組，每組10 只。分組：生理鹽水組（空白對照組）、CTX免疫抑制組（模型組）、低劑量BFP處理組、中劑量BFP處理組、高劑量BFP處理組、香菇多糖（陽性對照組）。給藥方式：前3 d每天進行1 次腹腔注射，空白對照組小鼠腹腔注射100 μL生理鹽水，模型組、陽性對照組和低、中、高劑量BFP處理組小鼠腹腔注射100 μL CTX（40 mg/kg）；第4天開始，各組分別灌胃100 μL生理鹽水、香菇多糖（40 mg/kg）、低劑量BFP（100 mg/kg）、中劑量BFP（200 mg/kg）、高劑量BFP（400 mg/kg），連續(xù)灌胃4 周。

頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，進行自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性和脾淋巴細胞轉化實驗；用2 mL生理鹽水灌洗小鼠腹腔2 次，吸出腹腔液，進行腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力檢測；收集小鼠全血，對淋巴細胞分群情況進行檢測；將小鼠血液3 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集小鼠血清，測定IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgA和IgG水平；收集結腸組織，檢測NF-κB、TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA表達水平。

1.3.2 增強免疫力的指標測定

增強免疫力功能評價參照《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》中“有助于增強免疫力功能檢測方法”，采用細胞免疫、體液免疫功能和非特異性免疫中單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性多個維度進行綜合評價。NK細胞活性評價采用乳酸脫氫酶測定法；腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力采用中性紅吞噬實驗法測定；碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α采用小鼠碳廓清實驗中校正吞噬指數(shù)法測定；血清溶血素水平采用凝血法測定；T細胞增殖率采用ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗中的MTT法測定。

1.3.3 相關細胞因子和免疫球蛋白質量濃度的測定

按試劑盒說明書操作，采用ELISA法定量測定血清中免疫相關細胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ）、IgA、IgG的質量濃度，每組3 個平行。

1.3.4 流式細胞術分析淋巴細胞分群

每管加入100 μL全血，并分別加入10 μL相應的抗體（CD3/CD4/CD8、CD3/CD19和CD4/CD25），振蕩，室溫避光20 min。加入1 mL溶血素試劑，振蕩后室溫避光10 min，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，振蕩。加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline（PBS），pH 7.2、0.01 mol/L），振蕩，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，振蕩。加入500 μL PBS，采用FACS Calibur流式細胞儀分析CD3CD4T細胞、CD3CD8T細胞、CD4CD25T細胞、CD3CD19B細胞的比例，計算CD4T細胞/CD8T細胞（即CD4/CD8）。每組6 個平行。

每管加入100 μL全血，然后加入1 mL溶血素，振蕩后室溫避光10 min，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入2 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，取200 μL細胞懸液，加入0.4 μL細胞激活劑混勻，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，收集細胞。1 200 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)基，用100 μL PBS重懸細胞，加入5 μL CD4抗體，室溫放置30 min。加入2 mL PBS，1 500 r/min離心5 min棄去上清液。加入1 mL固定/濃縮工作液（固定濃縮液與稀釋液體積比1∶3），室溫放置30 min。加入2 mL孵育緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入2 mL孵育緩沖液重懸細胞，1 500 r/min離心5 min。取100 μL上清液，加入5 μL IL-17抗體，室溫避光放置30 min。加入1 mL孵育緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入500 μL PBS，上機檢測，分析CD4IL-17T細胞的比例。每組6 個平行。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測

利用實時熒光定量PCR檢測小鼠結腸組織中、（、、、、、）、NOD樣受體（nucleotide oligomerization domain-like receptor，）（和）、細胞因子（和）mRNA相對表達水平的變化，每組3 個平行。

取50 mg結腸組織切成小塊后，液氮研磨成粉狀，按照磁珠法總RNA提取試劑盒的操作說明提取總RNA。按照SYBR Premix Ex試劑盒說明書操作，反應體系20 μL，樣品管和內參管均設3個復管。反應條件為50 ℃、10 min反轉錄，95 ℃預變性5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)。以為內參基因，采用2法比較各組mRNA相對表達水平的差異。

實驗所用引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 目的基因和內參基因引物Table 1 Primer sequences used for amplification of target and internal reference genes

1.3.6 Western blot分析

收集小鼠的結腸組織，Western blot方法檢測小鼠結腸組織NF-κB、TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9）、NLR（NOD1和NOD2）以及細胞因子（IL-6和TNF-α）的相對表達水平，每組3 個平行。

把20 mg結腸組織剪切成小塊，加入200 μL RIPA裂解液，經(jīng)勻漿機充分勻漿后，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每孔加入20 μL上樣液，留一孔加入10 μL預染的Marker，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將凝膠中的蛋白質轉至聚偏二氟乙烯膜，加入5%（質量分數(shù)）牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育24 h，TBST洗膜3 次，每次5 min，然后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜5 次，每次15 min，加入ECL試劑反應發(fā)光后，暗室中用X膠片感光、顯影、定影，采集圖像，Quantity-one軟件分析灰度值。蛋白相對表達水平為目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值之比。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以平均值±標準差表示，采用檢驗進行組間差異分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 BFP對免疫抑制小鼠非特異性免疫的影響

由圖1A可知，與空白對照組相比，模型組小鼠NK細胞活性極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量BFP處理組極顯著地增強NK細胞活性（＜0.01）；高劑量BFP的增強作用與陽性對照組相當，NK細胞活性高達57.36%。由圖1B可知，與空白對照組相比，模型組小鼠巨噬細胞中性紅吞噬能力極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，低劑量BFP處理組能略微提高巨噬細胞吞噬中性紅的能力，但無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；中、高劑量組對巨噬細胞吞噬中性紅能力的促進效果達到極顯著水平（＜0.01）。由圖1C、D可知，與空白對照組相比，模型組小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α均極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，中、高BFP處理組可極顯著提高碳廓清指數(shù)K（＜0.01）；低、中、高BFP處理組均能顯著或極顯著提高吞噬指數(shù)α（＜0.05、＜0.01）。

圖1 BFP對免疫抑制小鼠免疫功能的影響Fig. 1 Effect of BFP on the immunity of immunosuppressed mice

2.2 BFP對免疫抑制小鼠體液免疫和細胞免疫的影響

由表2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠T細胞增殖率、CD4T細胞比例、CD4/CD8均極顯著降低；與模型組相比，低劑量BFP處理組能促進小鼠T淋巴細胞的增殖，但效果不顯著（＞0.05）；中劑量BFP處理組的增殖效果達到顯著水平（＜0.05）；高劑量BFP處理組達到極顯著水平（＜0.01），細胞增殖率高達18.58%，增殖效果與陽性對照組相當；與模型組相比，低、中劑量BFP干預能夠顯著提高血液中CD4T細胞的比例（＜0.05），高劑量BFP處理組可以極顯著提高血液中CD4T細胞的比例（＜0.01）；與模型組相比，低、中劑量BFP處理能夠降低CD8T細胞比例，但效果不顯著（＞0.05），而高劑量BFP干預顯著下調CD8T細胞比例（＜0.05），并顯著提高CD4/CD8。與空白對照組相比，模型組小鼠輔助性T細胞（helper T cell，Th）17（CD4IL-17T細胞）比例極顯著升高，調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）（CD4CD25T細胞）比例無顯著變化；與模型組相比，低、中、高BFP處理均能夠顯著或極顯著降低Th17（CD4IL-17T細胞）的比例（＜0.05、＜0.01），而對Treg（CD4CD25T細胞）比例沒有顯著影響（＞0.05）；中、高劑量BFP干預極顯著降低了免疫抑制小鼠血液中CD3CD19B細胞的比例（＜0.01）。

表2 BFP對免疫抑制小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞的影響Table 2 Effect of BFP on T lymphocytes and B lymphocytes in immunosuppressed mice

由圖2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清溶血素水平極顯著降低；與模型組相比，低、中BFP處理組對血清溶血素水平的影響不顯著（＞0.05）；而高劑量BFP對其的促進效果達到極顯著水平（＜0.01），且略高于陽性對照組。

圖2 BFP對免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響Fig. 2 Effect of BFP on serum hemolysin level in immunosuppressed mice

由圖3可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中免疫相關細胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ）、IgA和IgG的質量濃度極顯著下降（＜0.01）；與模型組相比，低、中、高BFP劑量處理組均能極顯著促進IL-2、IL-6、TNF-α和INF-γ的釋放（＜0.01），極顯著提高IgA和IgG的產(chǎn)生（＜0.01）。

圖3 BFP對免疫抑制小鼠血清中IgA（A）、IgG（B）、IL-2（C）、IL-6（D）、INF-γ（E）和TNF-α（F）質量濃度的影響Fig. 3 Effect of BFP on IgA (A), IgG (B), IL-2 (C), IL-6 (D), INF-γ (E)and TNF-α (F) levels in serum of immunosuppressed mice

2.3 BFP對免疫抑制小鼠腸道組織中免疫相關細胞表面受體及細胞因子表達水平的影響

如表3所示，與空白對照組相比，CTX處理后，模型組小鼠結腸組織中和的mRNA相對表達水平顯著增加（＜0.05），而其他和變化不顯著（＞0.05），免疫相關因子（、）的轉錄水平顯著高于空白對照組（＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量BFP組干預顯著下調了和的轉錄水平（＜0.05），同時，中、高劑量組基因表達水平較模型組顯著降低（＜0.05），低、中、高劑量的基因表達水平較模型組均顯著降低（＜0.05），但是和mRNA相對表達水平的變化趨勢與血清中IL-6和TNF-α質量濃度變化趨勢不同。

表3 BFP對小鼠結腸組織中TLR、NLR以及免疫相關細胞因子mRNA相對表達水平的影響Table 3 Effect of BFP on the relative mRNA expression levels of TLR, NLR and immune-associated cytokines in the colon of mice

采用免疫印跡進一步驗證免疫相關細胞表面受體及細胞因子的變化，結果如圖4所示。與空白對照組相比，CTX處理后，模型組小鼠結腸組織中TLR2、TLR4、IL-6和TNF-α的蛋白相對表達水平極顯著提高（＜0.01）；而經(jīng)低、中、高劑量BFP干預后，TLR2和TLR4蛋白相對表達水平較模型組均極顯著降低（＜0.01），IL-6和TNF-α的蛋白相對表達水平顯著降低，與基因表達檢測結果一致。

圖4 BFP對免疫抑制小鼠結腸組織中TLR2（A）、TLR4（B）、IL-6（C）和TNF-α（D）蛋白相對表達水平的影響及其免疫印跡圖（E）Fig. 4 Effect of BFP on the relative protein expression levels of TLR2 (A),TLR4 (B), IL-6 (C) and TNF-α (D) in the colon of immunosuppressed mice and their western blot (E)

3 討 論

機體免疫系統(tǒng)是關聯(lián)免疫器官、免疫細胞以及免疫分子的極其復雜的防御體系，分為特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫防御體系包括B淋巴細胞介導的體液免疫應答和T淋巴細胞介導的細胞免疫應答。研究表明臨床常用的抗癌藥物CTX可以通過抑制免疫相關細胞因子的產(chǎn)生，降低NK細胞，脾臟T、B淋巴細胞，白細胞的活性，以及減弱腹腔巨噬細胞吞噬功能，從而達到免疫抑制的目的。因此，本研究采用CTX作為免疫抑制造模藥物，通過口服BFP，從非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫等多維度探討B(tài)FP增強免疫抑制小鼠免疫能力的作用機理。

NK細胞在機體免疫中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視作用，當它接觸靶細胞后在其表面釋放細胞毒性顆粒，能非特異性地殺傷各種腫瘤細胞，而吞噬細胞（中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞）也是非特異性免疫的關鍵參與者。因此，NK細胞的活性以及細胞吞噬功能常用于評估機體的非特異性免疫狀態(tài)。本實驗結果表明，BFP干預能夠活化CTX所致免疫抑制小鼠NK細胞，并能提高巨噬細胞吞噬能力，增加小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α，這些結果說明口服BFP能有效提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫。

淋巴細胞分為介導細胞免疫的T淋巴細胞（CD3）和介導體液免疫的B淋巴細胞（CD19）。成熟T淋巴細胞主要定居在外周免疫器官和血液中，可經(jīng)過血液、組織液等進行循環(huán)，主要以殺傷靶細胞或釋放免疫相關細胞因子發(fā)揮細胞免疫功能，而T淋巴細胞的增殖分化是機體細胞免疫反應的前提。實驗結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，中、高劑量BFP處理能促進小鼠T淋巴細胞的增殖（＜0.05）。T淋巴細胞在胸腺中分化為成熟T細胞，即CD4T細胞和CD8T細胞。CD4T細胞可促使B淋巴細胞、T淋巴細胞以及其他免疫細胞的增殖，調控免疫細胞之間的相互作用，在免疫調節(jié)中處于中心地位，而CD8T細胞具有細胞毒性作用，可殺傷靶細胞，一般認為，CD4/CD8降低即提示機體處于免疫抑制狀態(tài)。CD4T細胞在局部微環(huán)境中經(jīng)抗原刺激及細胞因子的調控作用，分化為多種不同的細胞亞群，共同參與機體免疫應答，目前研究較多的亞群有Th1、Th2、Th17和Treg亞群，它們相互作用共同維持機體的免疫平衡，其中Th17主要介導固有免疫，其可分泌具有促炎作用的細胞因子IL-17，而Treg主要介導負向調控應答。研究發(fā)現(xiàn)，瑪咖多糖能夠促進CD4T細胞增殖；海膽多糖可對抗CTX引起的CD4T細胞、CD8T細胞比例以及CD4/CD8的下降，從而起到增強免疫的作用；絞股藍粗多糖能夠提高CTX誘導的免疫抑制小鼠血清和脾臟中的CD4T細胞和CD4/CD8；黑靈芝多糖可促進免疫低下小鼠小腸CD4T細胞的表達，提高CD4/CD8，強化機體細胞免疫調節(jié)，促進Th17/Treg平衡的恢復。實驗結果表明，BFP能夠提高免疫抑制小鼠CD4T細胞并增加CD4/CD8，降低Th17的比例，但是Treg比例沒有顯著差異（＞0.05）。這些結果說明BFP能有效改善由CTX引起的小鼠免疫功能下降。

體液免疫是指活化的B淋巴細胞分化成漿細胞，漿細胞又分泌特異性抗體從而清除抗原并產(chǎn)生記憶細胞保護機體的免疫應答過程。B淋巴細胞作為專職的抗原提呈細胞，發(fā)揮著連接固有免疫和獲得性免疫的作用，其特異性表面標志為CD19分子。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，BFP干預降低了CD3CD19B細胞的比例。血清溶血素水平反映機體形成抗體的能力，常用于評價機體體液免疫功能，本實驗結果表明，與模型組相比，高劑量BFP處理后免疫抑制小鼠的血清溶血素水平極顯著升高（＜0.01）。Ig是血清和體液中具有抗體活性的一類蛋白質，能夠調節(jié)機體免疫環(huán)境，包括IgA、IgG、IgM等多種類型，其分泌量可以反映體液免疫系統(tǒng)的狀況。本研究結果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中IgA和IgG的質量濃度極顯著下降（＜0.01），低、中、高BFP劑量處理組均能極顯著提高IgA和IgG的釋放量（＜0.01），這些結果說明BFP能有效改善由CTX引起的小鼠體液免疫功能下降。

細胞因子不僅能夠單獨起效，還能與其他細胞因子相互協(xié)同或相互制約，從而在機體免疫應答時發(fā)揮生物學效應。細胞因子大部分是小分子物質，是通過刺激免疫細胞及某些非免疫細胞合成分泌而成，可參與多種免疫功能。比如IL-2是引起T細胞增殖分化的主要細胞因子，其表達水平是衡量機體細胞免疫的重要指標之一；IL-6能夠調節(jié)包括T、B淋巴細胞等在內的免疫細胞功能，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用；IFN-γ屬于II型干擾素，主要由單核/巨噬細胞產(chǎn)生，具有促進主要組織相容性復合體分子表達、抗原提呈、抑制Th2細胞等功效。由單核巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α是免疫防護的重要介質，能夠通過激活轉錄因子NF-κB，促使多種細胞因子基因的轉錄，增加細胞因子的分泌，增強T、B淋巴細胞活性，與機體免疫調節(jié)功能密切相關。本研究采用ELISA法檢測小鼠血清中免疫相關細胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ）的質量濃度，發(fā)現(xiàn)CTX免疫抑制小鼠血清中的IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ質量濃度極顯著下降（＜0.01），經(jīng)低、中、高劑量BFP處理后均能極顯著促進IL-2、IL-6、TNF-α和INF-γ的釋放（＜0.01），表明BFP能夠通過促進細胞因子的分泌，參與調節(jié)機體免疫。

模式識別受體是非特異性免疫中免疫受體的代表，入侵的微生物或抗原物質可以被宿主腸道黏膜上特定模式識別受體識別，引起免疫反應，進而促進炎性細胞因子的分泌和多種免疫細胞的分化，它們是連接非特異性免疫和特異性免疫應答的關鍵橋梁。其中TLR和NLR是兩類重要的模式識別受體，TLR位于細胞表面或胞內吞噬體膜，而NLR分布于胞質溶膠，共同借助識別細胞外和進入胞內的病原體相關分子模式而啟動信號轉導，促進免疫應答。多糖是具有空間結構的復雜大分子，存在活性中心，可作為配體被模式識別受體識別并激活其下游信號轉導途徑，最終可能會起到調控細胞免疫功能和調節(jié)免疫反應的作用。如黃芪多糖、當歸多糖等多種中藥多糖可以通過TLR4活化轉錄因子NF-κB，激活下游信號通路，調控細胞因子的表達最終發(fā)揮免疫調節(jié)作用。豬苓多糖通過TLR4受體識別，可促進樹突狀細胞成熟及分泌細胞因子IL-12、IL-10。本實驗對小鼠腸道中部分、以及其下游部分促炎細胞因子（、）的mRNA表達水平進行檢測，結果顯示BFP顯著下調了、的mRNA表達水平（＜0.05），而對其他和的表達并沒有顯著影響；此結果與白術多糖和豬苓多糖的結果剛好相反，可能是因為，此時多糖是通過調控機體TLR受體的表達情況或其通路蛋白活性來發(fā)揮提高免疫力的活性，比如褐藻多糖硫酸酯通過抑制TLR4的表達及抑制NF-κB通路的激活而減緩炎癥病程進展。同時，腸道組織中促炎細胞因子（、）mRNA表達水平的變化趨勢與血清中不一致。這可能是由于CTX對腸道黏膜損傷主要以促炎為主，表現(xiàn)為促炎細胞因子mRNA表達水平的增加，而外周免疫系統(tǒng)中細胞因子的釋放來源于脾臟和胸腺等全身性免疫系統(tǒng)的控制，CTX造成了免疫抑制，即表現(xiàn)為細胞因子水平的降低。此外免疫應答分為抗原識別、淋巴細胞增殖活化和效應階段，在脾臟、胸腺完成應答程序之后，腸道免疫應答正好處于效應階段。對其蛋白表達進行進一步的驗證發(fā)現(xiàn)，BFP顯著抑制了小鼠結腸組織中TLR2、TLR4、IL-6和TNF-α蛋白的表達，這與基因測定結果一致。因此，推測BFP可能通過TLR2/TLR4下游相關信號通路調節(jié)軸起到免疫功能保護作用。

4 結 論

BFP對CTX誘導的免疫抑制小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫具有良好的調節(jié)作用，能夠有效改善CTX所致的小鼠免疫功能抑制情況。同時，BFP能夠下調免疫抑制小鼠腸道相關免疫細胞表面受體（TLR2、TLR4）基因和蛋白的表達水平，降低免疫相關因子（IL-6、TNF-α）基因和蛋白的表達水平，綜上，推測BFP可能通過TLR2/TLR4下游相關信號通路調節(jié)軸改善小鼠的腸道免疫環(huán)境進而起到免疫功能的保護作用，而具體的作用機制還需進一步研究。