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        高強(qiáng)度超聲對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

        2022-10-28 07:17:48戴澤川毛相朝郝亞楠
        食品科學(xué) 2022年19期
        關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)

        戴澤川,毛相朝,2,郝亞楠,李 嬌,*

        (1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003;2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237)

        凡納濱對(duì)蝦()是世界第一大養(yǎng)殖蝦種,產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖蝦總產(chǎn)量的70%,其味道鮮美,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。我國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦年產(chǎn)量達(dá)170萬(wàn) t,已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。雖然我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量大,但是蝦類(lèi)加工產(chǎn)品的總量低、種類(lèi)少,并且加工產(chǎn)品大多是以鮮活蝦和冷凍蝦為主的初級(jí)加工產(chǎn)品,精深加工產(chǎn)品比例還遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家。凡納濱對(duì)蝦的常見(jiàn)食用方法是熱加工,但是熱加工在殺菌鈍酶的同時(shí)對(duì)蝦的食用品質(zhì)會(huì)造成較大改變,并且熱加工對(duì)蝦致敏性的消減效果甚微。非熱加工是一種新興的食品加工技術(shù),包括超高壓、超聲波、高壓二氧化碳、電離輻射、高壓脈沖電場(chǎng)、等離子體等,符合“最低限度加工”的趨勢(shì),能較大程度保留食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味,近年來(lái)非熱加工對(duì)食品致敏性的消減也引起了廣泛關(guān)注。

        超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波,超聲波在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要是依靠其在介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生的空化效應(yīng),以及伴隨超聲波產(chǎn)生的膨脹、閉合、振蕩等一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)低頻高強(qiáng)度的超聲波(20~100 kHz,強(qiáng)度大于10 W/cm)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和改變方面中具有廣泛的用途;而在水產(chǎn)加工領(lǐng)域,也已經(jīng)有應(yīng)用超聲波對(duì)魚(yú)類(lèi)肌肉蛋白進(jìn)行改性的研究,通過(guò)超聲波提高魚(yú)類(lèi)肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度,應(yīng)用于魚(yú)糜制品中可以增加產(chǎn)品附加值。目前超聲波在凡納濱對(duì)蝦類(lèi)研究中主要應(yīng)用在殺菌、保鮮和輔助解凍方面,對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性影響的研究還較少,且鮮見(jiàn)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,通過(guò)不同時(shí)間的高強(qiáng)度超聲波處理蝦肌肉全蛋白勻漿,觀察超聲波處理對(duì)樣品肌肉組織和微觀結(jié)構(gòu)的影響;此外,將高強(qiáng)度超聲處理樣品進(jìn)一步凍干成蝦粉,探究超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白致敏性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、平均粒徑及其理化和功能特性方面(如總抗氧化能力、游離氨基酸含量和體外蛋白消化率)的影響,為將超聲應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦的精深加工提供新的思路和參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        凡納濱對(duì)蝦(平均體長(zhǎng)(8.96±0.47)cm、體質(zhì)量(33.76±1.07)g)購(gòu)于青島市市南區(qū)團(tuán)島市場(chǎng)。

        胰蛋白酶(T8150-10G,250 U/mg)、胃蛋白酶(P8160-10G,250 U/mg)、甲苯胺藍(lán)水溶液 北京索萊寶科技有限公司;EPC-TPM-5蝦原肌球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)2.0試劑盒 美國(guó)Indoor Biotechnologies公司;氨基酸緩沖溶液 日本三菱株式會(huì)社;WAKO茚三酮顯色液緩沖溶液R1、R2 日本和光純藥株式會(huì)社。

        1.2 儀器與設(shè)備

        PL2002電子天平、DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Elixtm純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司;pHSJ-4實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司;CR21G高速冷凍離心機(jī)、L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本Hitachi公司;SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、SDC-6低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司;Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀 英國(guó)馬爾文儀器公司;Ni-E電動(dòng)熒光顯微鏡 日本尼康公司;Nova Nano SEM450掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品預(yù)處理

        將新鮮凡納濱對(duì)蝦用清水沖洗干凈,放入-20 ℃冰箱12 h致死,并在4 ℃條件下解凍,去頭、尾之后取蝦肉,按照質(zhì)量體積比1∶3將蝦肉與蒸餾水用勻漿機(jī)打勻。超聲處理?xiàng)l件:將上述蝦肉勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,以超聲功率300 W、超聲頻率20 kHz和超聲強(qiáng)度382 W/cm對(duì)對(duì)蝦肉勻漿分別超聲處理0(對(duì)照)、5、15、25、35 min,超聲探頭直徑為10 mm,用低溫恒溫槽循環(huán)系統(tǒng)控制超聲溫度在20 ℃以下,占空比為50%,超聲2 s間隔2 s。超聲處理后取樣,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察,剩余樣品在-80 ℃冰箱預(yù)凍后,在真空冷凍干燥機(jī)中-50 ℃下干燥48 h,凍干后的樣品在-20 ℃冰箱保存,待下一步檢測(cè)。

        1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

        參考Stratakos等的方法用移液槍將稀釋過(guò)的10 μL蝦樣品置于載玻片上,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲苯胺藍(lán)水溶液染色3 min,使用配有數(shù)碼相機(jī)的熒光電動(dòng)顯微鏡,在20 倍物鏡下觀察蝦樣品肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)。

        參考Wang Jia等的方法,將超聲處理后的蛋白樣品冷凍干燥48 h之后,取凍干粉末使用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu),放大倍數(shù)設(shè)置為250 倍,加速電壓為5.00 kV,使用掃描電子顯微鏡自帶軟件進(jìn)行圖像采集。

        1.3.3 平均粒徑的測(cè)定

        稱(chēng)取蝦粉充分溶于雙蒸水中,調(diào)整蝦粉質(zhì)量濃度至1 mg/mL,使用納米粒度及Zeta電位儀測(cè)定平均粒徑,采用protein測(cè)定程序,平衡時(shí)間3 min,每輪測(cè)試10 次,分析蝦粉溶液的粒度分布。

        1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

        十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)按照Laemmli的方法進(jìn)行。使用的電泳預(yù)制膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,分別將待測(cè)樣品溶液(5 mg/mL)與5×蛋白上樣緩沖液(體積比1∶4)充分混合,并在95 ℃水煮10 min后制成電泳樣品,180 kDa彩虹Marker上樣10 μL,電泳樣品上樣10 μL,先使用80 V電泳20 min,之后調(diào)整電壓到120 V電泳2 h,待電泳結(jié)束后取出預(yù)制膠,在55 ℃下使用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h,然后用脫色液(體積分?jǐn)?shù)10%乙酸、體積分?jǐn)?shù)5%乙醇)脫色,直至蛋白質(zhì)條帶清晰。

        1.3.5 過(guò)敏原檢測(cè)

        按照Dong Xin等的方法,通過(guò)雙夾心法ELISA試劑盒測(cè)定蝦中的過(guò)敏原原肌球蛋白的含量。

        1.3.6 總抗氧化能力測(cè)定

        參考Nadeem等的研究,采用鐵離子還原/抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)法檢測(cè)蝦樣品的總抗氧化能力。FRAP工作液是在室溫下分別將20 mmol/L氯化鐵溶液、300 mmol/L乙酸緩沖液和10 mmol/L 2,4,6-三吡啶--三嗪按體積比1∶1∶10混合而成,現(xiàn)配現(xiàn)用。將FRAP工作液(180 μL)和蝦蛋白溶液(5 μL 5 mg/mL)分別加入96 孔板的微孔中,在黑暗中37 ℃孵育5 min后,用酶標(biāo)儀在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1 000 μmol/L硫酸亞鐵溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定抗氧化活性。

        1.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

        根據(jù)劉斌等的方法,使用傅里葉變換紅外光譜儀分析樣品蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將干燥后的蝦粉樣品與KBr混合均勻,通過(guò)壓片法壓片,以4 cm的分辨率進(jìn)行32 次掃描,采集樣品之前先采集背景,以消除空氣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。樣品的傅里葉變換紅外譜圖采用OMNIC 9.2軟件處理對(duì)原圖譜進(jìn)行自動(dòng)修飾校正,使用PeakFit v4.12軟件對(duì)紅外圖譜進(jìn)行基線校正、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理和高斯擬合,去卷積的參數(shù)控制半峰寬為40.0,增強(qiáng)因子1.9;高斯擬合的子峰在8~10之間。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)分析相應(yīng)波數(shù)處對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

        1.3.8 巰基含量測(cè)定

        巰基含量測(cè)定的原理是巰基基團(tuán)與5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)會(huì)生成黃色化合物,其在412 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。參考張自業(yè)和杜琛等的方法并稍作修改進(jìn)行巰基含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g蝦粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖液中,8 000×、4 ℃離心10 min,取上清液40 μL加入到160 μL緩沖液中(0.01 mol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L KHPO,pH 6.0),再加入10 μL Ellman試劑(0.01 mol/L 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、0.01 mol/L KHPO,pH 6.0),充分混合后室溫避光靜置25 min,使用酶標(biāo)儀于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

        1.3.9 游離氨基酸含量的測(cè)定

        準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品加入至10 mL 0.02 mol/L稀鹽酸溶液,充分均質(zhì)后用冷凍離心機(jī)(5 000 r/min、4 ℃)離心10 min,收集上清液。將剩余殘?jiān)尤胫?0 mL 0.02 mol/L稀鹽酸中攪拌,再次離心5 min,合并兩次離心上清液,定容至50 mL。定容后移取2 mL樣品溶液,加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液,再次離心(5 000 r/min、4 ℃)10 min,然后經(jīng)0.22 μm水相過(guò)濾膜過(guò)濾,通過(guò)L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為P/N 855-4507標(biāo)準(zhǔn)蛋白水解分析柱(4.6 mm×60 mm);流動(dòng)相為氨基酸緩沖溶液、茚三酮緩沖溶液R1、R2;分離柱溫度:梯度升溫;梯度洗脫;反應(yīng)柱溫度:135 ℃,進(jìn)樣體積:10 μL。

        1.3.10 總可溶性蛋白含量測(cè)定

        準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)不同處理的凍干蝦粉樣品0.2 g,溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中,7 000 r/min、4 ℃離心10 min,收集上清液,采用考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè)法測(cè)定蝦樣品的總可溶性蛋白含量,首先用系列質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取40 μL待測(cè)樣品與200 mL考馬斯亮藍(lán)G250充分混合,室溫避光反應(yīng)5 min后,用移液槍吸取200 μL至96 孔板,在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的總可溶性蛋白含量。

        1.3.11 體外蛋白模擬消化測(cè)定

        根據(jù)Hejazi和劉艷美等的方法并加以改進(jìn),采用胃-胰蛋白酶兩步消化法對(duì)蝦粉進(jìn)行體外模擬消化。使用1 mol/L HCl溶液將樣品(20 mL 50 mg/mL)pH值調(diào)至2,將胃蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中,按照樣品與胃蛋白酶100∶1的質(zhì)量比添加胃蛋白酶,37 ℃恒溫?fù)u床中消化3 h,用1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),調(diào)節(jié)pH值至7.6,將胰蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中,按照樣品與胰蛋白酶100∶1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶,37 ℃條件下消化2 h,用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,體外消化率按下式計(jì)算。

        式中:為消化前的蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL);為消化后的蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中Duncan multiple range test法對(duì)數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉提取物微觀結(jié)構(gòu)的影響

        Aguilera等指出,結(jié)構(gòu)和功能之間存在聯(lián)系,要想正確分析和控制食物的屬性,對(duì)其加工過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的了解至關(guān)重要。本研究使用熒光電動(dòng)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察不同超聲時(shí)間處理的蝦樣品。通過(guò)圖1可以觀察出,未經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品細(xì)胞組織之間連接緊密,且分布不均勻,超聲5 min的樣品與之相比細(xì)胞組織之間分布松散、空隙增大;隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),樣品組織之間的間隙進(jìn)一步增大,在視野范圍內(nèi)分散得也更加均勻,而超聲25 min和超聲35 min的細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間沒(méi)有明顯差異,分布都比較均勻松散。

        圖1 不同超聲時(shí)間處理蝦樣品的熒光電動(dòng)顯微鏡圖Fig. 1 Fluorescence electromotive microscopic images of shrimp samples treated with ultrasound

        從圖2掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果可以看出,未經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品顯示出完整、光滑的邊緣,而超聲處理5 min就能明顯觀察到片狀組織碎片的產(chǎn)生;超聲時(shí)間延長(zhǎng)至15 min可以觀察到更多的碎片,并且開(kāi)始出現(xiàn)條狀組織碎片;超聲25~35 min可以看到表面出現(xiàn)了不規(guī)則的孔洞,結(jié)構(gòu)被破壞的程度進(jìn)一步加劇,可能是超聲產(chǎn)生的剪切力和空化作用對(duì)蝦樣品的微觀結(jié)構(gòu)造成了破壞,且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)破壞程度也增大。

        圖2 超聲處理蝦樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of shrimp samples treated with ultrasound

        2.2 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白粒徑的影響

        粒徑的變化可以反映出蛋白質(zhì)的聚集程度。由圖3可知,與對(duì)照組相比,超聲處理5 min后,平均粒徑從(268.70±3.70)nm下降到(153.90±2.67)nm,說(shuō)明超聲波處理可以顯著減小蛋白質(zhì)的平均粒徑,這是超聲過(guò)程中的空化泡破裂產(chǎn)生的機(jī)械力高速剪切,使得蛋白質(zhì)溶液變得更均勻。超聲波處理25 min后,平均粒徑降至(112.40±3.00)nm,隨著處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),平均粒徑變化不顯著,超聲35 min時(shí)平均粒徑甚至略有上升,這可能是過(guò)度超聲處理使蛋白質(zhì)發(fā)生變性,蛋白質(zhì)分子之間非共價(jià)鍵被破壞,形成新的化學(xué)鍵,使得相互作用力增加,從而使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。孫攀研究超聲處理對(duì)金槍魚(yú)肌原纖維蛋白粒徑的影響,也發(fā)現(xiàn)在超聲18 min時(shí)蛋白的平均粒徑降低28%,但是延長(zhǎng)超聲時(shí)間至24 min時(shí),粒徑反而增加。此外,葉鈺等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以使蛋清蛋白部分蛋白質(zhì)分子平均粒徑變小,還可以使整體粒徑分布范圍變窄,均勻度提高;而蛋白平均粒徑的降低,從理論上可以增加蛋白的消化率。

        圖3 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白粒徑的影響Fig. 3 Influence of ultrasound on the particle size of shrimp proteins

        2.3 超聲對(duì)對(duì)蝦原肌球蛋白含量的影響

        原肌球蛋白(34~36 kDa)是對(duì)蝦的主要過(guò)敏原,具有一定的熱穩(wěn)定性。Shriver等分別用煮沸和脈沖紫外光處理大西洋白蝦,發(fā)現(xiàn)用脈沖紫外光處理大西洋白對(duì)蝦4 min可以使蝦原肌球蛋白的反應(yīng)原性和免疫球蛋白E結(jié)合水平降低,而煮沸反而會(huì)增加原肌球蛋白和免疫球蛋白E的結(jié)合能力。由圖4可知,35 kDa處蛋白電泳條帶隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)顏色逐漸變淺,說(shuō)明超聲處理后35 kDa處原肌球蛋白含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。由圖5可知,經(jīng)ELISA定量分析,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),原肌球蛋白含量從對(duì)照組的(2.09±0.08)ng/mg降低至超聲處理25 min后的(0.81±0.06)ng/mg(<0.05),在超聲35 min時(shí)原肌球蛋白的含量降到最低((0.78±0.08)ng/mg),降低了62.68%,表明超聲波可以顯著降低原肌球蛋白含量,進(jìn)而降低對(duì)蝦致敏性,這可能是高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空化作用以及引入的自由基攻擊原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)所致。Liu Guangxian等研究了超聲處理對(duì)乳糖蛋白致敏性的消減作用,結(jié)果表明,經(jīng)超聲處理后乳糖蛋白抗原性出現(xiàn)一定程度降低,且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)乳糖蛋白抗原性不斷降低,本研究結(jié)果與之相符。

        圖4 超聲處理對(duì)蝦蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE patterns of shrimp proteins subjected to ultrasonic treatment

        圖5 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品原肌球蛋白含量的影響Fig. 5 Influence of ultrasonic treatment on tropomyosin content in shrimp samples

        2.4 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

        采用傅里葉變換紅外光譜分析不同超聲時(shí)間處理對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。對(duì)于酰胺I區(qū),不同的波數(shù)范圍對(duì)應(yīng)不同的二級(jí)結(jié)構(gòu),其中1 600~1 640 cm對(duì)應(yīng)-折疊,1 640~1 650 cm對(duì)應(yīng)無(wú)規(guī)卷曲,1 650~1 660 cm對(duì)應(yīng)-螺旋,1 660~1 700 cm對(duì)應(yīng)-轉(zhuǎn)角,通過(guò)Peakfit 4.12軟件擬合可以得到蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。從圖6和圖7可以看出,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量明顯減少,而-轉(zhuǎn)角和-折疊相對(duì)含量總體有所增加,表明超聲波處理使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中部分無(wú)規(guī)卷曲向-轉(zhuǎn)角和-折疊轉(zhuǎn)化,這與Jiang Lianzhou等研究超聲波處理對(duì)黑豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致。-轉(zhuǎn)角是對(duì)蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分,經(jīng)過(guò)超聲之后其相對(duì)含量較對(duì)照組略有增加,而-螺旋相對(duì)含量的變化隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,這使得蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向于展開(kāi),這與Yang Xue等研究300 W超聲波處理使大米蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋向-折疊轉(zhuǎn)化的結(jié)果相符。綜上,超聲處理可以使蝦蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從無(wú)規(guī)卷曲、-螺旋向-折疊和-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化。

        圖6 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 6 FTIR spectra of shrimp proteins treated by ultrasound

        圖7 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 7 Influence of ultrasonic treatment on secondary structure of shrimp proteins

        2.5 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白巰基含量的影響

        巰基基團(tuán)屬于弱二級(jí)鍵,可以參與次級(jí)鍵的形成,起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用,巰基含量和表面疏水性的變化在一定程度上可以揭示蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。從圖8可以看出,蝦肉中巰基含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,當(dāng)超聲處理35 min時(shí),巰基含量從對(duì)照組的19.52 μmol/g顯著提高到25.81 μmol/g。巰基含量的增加可能是超聲產(chǎn)生的空化作用破壞了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨向于延伸和展開(kāi),導(dǎo)致在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基等疏水基團(tuán)暴露;也可能是超聲波在液體介質(zhì)傳播中產(chǎn)生的剪切力和湍流作用導(dǎo)致蝦肉蛋白中二硫鍵斷裂,從而產(chǎn)生了新的巰基。

        圖8 超聲處理對(duì)對(duì)蝦樣品巰基含量的影響Fig. 8 Influence of ultrasonic treatment on sulfhydryl content of shrimp samples

        2.6 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品總抗氧化能力的影響

        圖9反映了超聲波處理對(duì)對(duì)蝦蛋白抗氧化能力的影響。對(duì)蝦蛋白的總抗氧化能力隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,超聲35 min時(shí),從(24.61±1.14)μmol/100 mg增加到(47.76±1.64)μmol/100 mg,表明長(zhǎng)時(shí)間的高強(qiáng)度超聲處理有利于增加蝦樣品的抗氧化能力。Abid等的研究結(jié)果表明超聲處理能顯著提高蘋(píng)果汁的自由基清除能力,超聲處理后蘋(píng)果汁總抗氧化能力顯著提高,這是由于超聲波的機(jī)械作用增加了果汁中抗壞血酸和多酚類(lèi)化合物的提取率和有效性。因此,推測(cè)超聲波處理也可能提高了蝦肌肉提取物中抗氧化活性物質(zhì)的提取率,導(dǎo)致對(duì)蝦樣品的總抗氧化能力提高;除此之外,Alicia等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熱超聲處理的黑莓汁與普通巴氏殺菌黑莓汁相比,抗氧化活性和滅酶能力顯著提高。由此推斷,在超聲波處理的過(guò)程中一些與氧化反應(yīng)相關(guān)的酶(如多酚氧化酶)由于超聲的空化作用引入自由基攻擊而失活,這也可能會(huì)增加樣品的總抗氧化能力。

        圖9 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品總抗氧化能力的影響Fig. 9 Influence of ultrasonic treatment on total antioxidant capacity of shrimp samples

        2.7 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉提取物游離氨基酸含量的影響

        凡納濱對(duì)蝦具有較好的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值,蝦肉中含有18 種氨基酸,其中必需氨基酸占比達(dá)到近40%。通過(guò)表1可以看出,隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng),部分游離氨基酸的含量明顯增加,這是超聲波的空化效應(yīng)及伴隨其產(chǎn)生的機(jī)械作用和瞬時(shí)高溫高壓破壞了蛋白質(zhì)肽鏈,以及對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞可能使更多酶作用位點(diǎn)暴露所致。其中甘氨酸、天冬氨酸等呈鮮味的氨基酸含量增加較多,脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸等和甘味相關(guān)的氨基酸含量也明顯提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn),一些人體必需氨基酸如賴(lài)氨酸、甲硫氨酸的含量明顯增加,其在人體中可以起到抗氧化和增強(qiáng)免疫力的作用,精氨酸含量的增加對(duì)人體代謝具有積極的作用,它能催化鳥(niǎo)氨酸循環(huán)的進(jìn)行、促進(jìn)尿素的形成,從而使人體內(nèi)的氨變成無(wú)毒尿素,這些必需游離氨基酸含量的增加從理論上可以提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

        表1 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of ultrasonic treatment on the contents of free amino acids in shrimp samples mg/g

        2.8 超聲對(duì)對(duì)蝦可溶性蛋白含量及體外消化率的影響

        由表2可知,長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理降低了對(duì)蝦樣品的總可溶性蛋白含量,經(jīng)過(guò)超聲處理35 min后對(duì)蝦樣品的總可溶性蛋白含量從(331.83±7.75)mg/g顯著降低到(232.29±9.47)mg/g(<0.05)。Kang Dacheng等發(fā)現(xiàn)20 kHz超聲波處理30~120 min后,牛肉的總可溶性蛋白含量會(huì)顯著降低,這可能與超聲波處理后超聲空化泡破裂產(chǎn)生的強(qiáng)微射流作用于蛋白質(zhì),導(dǎo)致其氫鍵和肽鏈斷裂有關(guān),同時(shí)由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞,埋藏在內(nèi)部的疏水性基團(tuán)更多暴露在表面,這也導(dǎo)致了可溶性蛋白含量的降低。經(jīng)過(guò)超聲處理5 min后的蝦肌肉提取物體外消化率與對(duì)照組相比有所提高,超聲15 min時(shí)顯著提高到78.13%,超聲35 min時(shí)消化率顯著提高到81.97%。根據(jù)Dong Xin等的研究,高強(qiáng)度超聲處理20 min能顯著增加蝦樣品的體外消化率,超聲波處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象展開(kāi)和平均粒徑降低,可以提高體外蛋白消化率;Jia Junqiang等也發(fā)現(xiàn),在20 kHz、1 500 W、20 min超聲處理?xiàng)l件下脫脂小麥胚芽蛋白肽的酶解消化率提高到21.0%,這可能是超聲波的微射流和空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,使蛋白質(zhì)構(gòu)象從卷曲和緊密折疊到趨向于展開(kāi),增加了和酶反應(yīng)的活性位點(diǎn)數(shù)量和空間,從而進(jìn)一步增加了消化率。

        表2 超聲對(duì)對(duì)蝦可溶性蛋白含量和體外消化率的影響Table 2 Effect of ultrasonic treatment on solubility and in vitro digestibility of shrimp proteins

        3 結(jié) 論

        本研究以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,通過(guò)超聲波處理凡納濱對(duì)蝦肌肉全蛋白提取物,探究高強(qiáng)度超聲對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果表明,高強(qiáng)度的超聲波處理可以改變凡納濱對(duì)蝦的微觀結(jié)構(gòu),同時(shí)顯著降低原肌球蛋白含量;經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變,無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量明顯減少,-螺旋相對(duì)含量略有降低,-折疊和-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加;高強(qiáng)度超聲還可以影響凡納濱對(duì)蝦的理化和功能特性,提高其抗氧化能力和游離氨基酸含量;同時(shí)蛋白平均粒徑也隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而減小,體外蛋白消化率則會(huì)因?yàn)槌曁幚矶黾?,表明高?qiáng)度超聲處理產(chǎn)生的空化作用、剪切力和湍流力等作用對(duì)蝦肌肉蛋白產(chǎn)生影響,可以有效降低蝦蛋白的致敏性,改變蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性以及提高其潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

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