戴澤川，毛相朝,2，郝亞楠，李 嬌,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

凡納濱對(duì)蝦（）是世界第一大養(yǎng)殖蝦種，產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖蝦總產(chǎn)量的70%，其味道鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。我國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦年產(chǎn)量達(dá)170萬(wàn) t，已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。雖然我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量大，但是蝦類(lèi)加工產(chǎn)品的總量低、種類(lèi)少，并且加工產(chǎn)品大多是以鮮活蝦和冷凍蝦為主的初級(jí)加工產(chǎn)品，精深加工產(chǎn)品比例還遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家。凡納濱對(duì)蝦的常見(jiàn)食用方法是熱加工，但是熱加工在殺菌鈍酶的同時(shí)對(duì)蝦的食用品質(zhì)會(huì)造成較大改變，并且熱加工對(duì)蝦致敏性的消減效果甚微。非熱加工是一種新興的食品加工技術(shù)，包括超高壓、超聲波、高壓二氧化碳、電離輻射、高壓脈沖電場(chǎng)、等離子體等，符合“最低限度加工”的趨勢(shì)，能較大程度保留食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，近年來(lái)非熱加工對(duì)食品致敏性的消減也引起了廣泛關(guān)注。

超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，超聲波在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要是依靠其在介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生的空化效應(yīng)，以及伴隨超聲波產(chǎn)生的膨脹、閉合、振蕩等一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)低頻高強(qiáng)度的超聲波（20～100 kHz，強(qiáng)度大于10 W/cm）在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和改變方面中具有廣泛的用途；而在水產(chǎn)加工領(lǐng)域，也已經(jīng)有應(yīng)用超聲波對(duì)魚(yú)類(lèi)肌肉蛋白進(jìn)行改性的研究，通過(guò)超聲波提高魚(yú)類(lèi)肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度，應(yīng)用于魚(yú)糜制品中可以增加產(chǎn)品附加值。目前超聲波在凡納濱對(duì)蝦類(lèi)研究中主要應(yīng)用在殺菌、保鮮和輔助解凍方面，對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性影響的研究還較少，且鮮見(jiàn)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，通過(guò)不同時(shí)間的高強(qiáng)度超聲波處理蝦肌肉全蛋白勻漿，觀察超聲波處理對(duì)樣品肌肉組織和微觀結(jié)構(gòu)的影響；此外，將高強(qiáng)度超聲處理樣品進(jìn)一步凍干成蝦粉，探究超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白致敏性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、平均粒徑及其理化和功能特性方面（如總抗氧化能力、游離氨基酸含量和體外蛋白消化率）的影響，為將超聲應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦的精深加工提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦（平均體長(zhǎng)（8.96±0.47）cm、體質(zhì)量（33.76±1.07）g）購(gòu)于青島市市南區(qū)團(tuán)島市場(chǎng)。

胰蛋白酶（T8150-10G，250 U/mg）、胃蛋白酶（P8160-10G，250 U/mg）、甲苯胺藍(lán)水溶液 北京索萊寶科技有限公司；EPC-TPM-5蝦原肌球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）2.0試劑盒 美國(guó)Indoor Biotechnologies公司；氨基酸緩沖溶液 日本三菱株式會(huì)社；WAKO茚三酮顯色液緩沖溶液R1、R2 日本和光純藥株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子天平、DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Elixtm純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；pHSJ-4實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)、L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本Hitachi公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、SDC-6低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；Ni-E電動(dòng)熒光顯微鏡 日本尼康公司；Nova Nano SEM450掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮凡納濱對(duì)蝦用清水沖洗干凈，放入-20 ℃冰箱12 h致死，并在4 ℃條件下解凍，去頭、尾之后取蝦肉，按照質(zhì)量體積比1∶3將蝦肉與蒸餾水用勻漿機(jī)打勻。超聲處理?xiàng)l件：將上述蝦肉勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，以超聲功率300 W、超聲頻率20 kHz和超聲強(qiáng)度382 W/cm對(duì)對(duì)蝦肉勻漿分別超聲處理0（對(duì)照）、5、15、25、35 min，超聲探頭直徑為10 mm，用低溫恒溫槽循環(huán)系統(tǒng)控制超聲溫度在20 ℃以下，占空比為50%，超聲2 s間隔2 s。超聲處理后取樣，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，剩余樣品在-80 ℃冰箱預(yù)凍后，在真空冷凍干燥機(jī)中-50 ℃下干燥48 h，凍干后的樣品在-20 ℃冰箱保存，待下一步檢測(cè)。

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Stratakos等的方法用移液槍將稀釋過(guò)的10 μL蝦樣品置于載玻片上，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲苯胺藍(lán)水溶液染色3 min，使用配有數(shù)碼相機(jī)的熒光電動(dòng)顯微鏡，在20 倍物鏡下觀察蝦樣品肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)。

參考Wang Jia等的方法，將超聲處理后的蛋白樣品冷凍干燥48 h之后，取凍干粉末使用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)設(shè)置為250 倍，加速電壓為5.00 kV，使用掃描電子顯微鏡自帶軟件進(jìn)行圖像采集。

1.3.3 平均粒徑的測(cè)定

稱(chēng)取蝦粉充分溶于雙蒸水中，調(diào)整蝦粉質(zhì)量濃度至1 mg/mL，使用納米粒度及Zeta電位儀測(cè)定平均粒徑，采用protein測(cè)定程序，平衡時(shí)間3 min，每輪測(cè)試10 次，分析蝦粉溶液的粒度分布。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）按照Laemmli的方法進(jìn)行。使用的電泳預(yù)制膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，分別將待測(cè)樣品溶液（5 mg/mL）與5×蛋白上樣緩沖液（體積比1∶4）充分混合，并在95 ℃水煮10 min后制成電泳樣品，180 kDa彩虹Marker上樣10 μL，電泳樣品上樣10 μL，先使用80 V電泳20 min，之后調(diào)整電壓到120 V電泳2 h，待電泳結(jié)束后取出預(yù)制膠，在55 ℃下使用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，然后用脫色液（體積分?jǐn)?shù)10%乙酸、體積分?jǐn)?shù)5%乙醇）脫色，直至蛋白質(zhì)條帶清晰。

1.3.5 過(guò)敏原檢測(cè)

按照Dong Xin等的方法，通過(guò)雙夾心法ELISA試劑盒測(cè)定蝦中的過(guò)敏原原肌球蛋白的含量。

1.3.6 總抗氧化能力測(cè)定

參考Nadeem等的研究，采用鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法檢測(cè)蝦樣品的總抗氧化能力。FRAP工作液是在室溫下分別將20 mmol/L氯化鐵溶液、300 mmol/L乙酸緩沖液和10 mmol/L 2,4,6-三吡啶--三嗪按體積比1∶1∶10混合而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。將FRAP工作液（180 μL）和蝦蛋白溶液（5 μL 5 mg/mL）分別加入96 孔板的微孔中，在黑暗中37 ℃孵育5 min后，用酶標(biāo)儀在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1 000 μmol/L硫酸亞鐵溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定抗氧化活性。

1.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)劉斌等的方法，使用傅里葉變換紅外光譜儀分析樣品蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將干燥后的蝦粉樣品與KBr混合均勻，通過(guò)壓片法壓片，以4 cm的分辨率進(jìn)行32 次掃描，采集樣品之前先采集背景，以消除空氣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。樣品的傅里葉變換紅外譜圖采用OMNIC 9.2軟件處理對(duì)原圖譜進(jìn)行自動(dòng)修飾校正，使用PeakFit v4.12軟件對(duì)紅外圖譜進(jìn)行基線校正、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理和高斯擬合，去卷積的參數(shù)控制半峰寬為40.0，增強(qiáng)因子1.9；高斯擬合的子峰在8～10之間。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)分析相應(yīng)波數(shù)處對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.8 巰基含量測(cè)定

巰基含量測(cè)定的原理是巰基基團(tuán)與5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)會(huì)生成黃色化合物，其在412 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。參考張自業(yè)和杜琛等的方法并稍作修改進(jìn)行巰基含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g蝦粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖液中，8 000×、4 ℃離心10 min，取上清液40 μL加入到160 μL緩沖液中（0.01 mol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L KHPO，pH 6.0），再加入10 μL Ellman試劑（0.01 mol/L 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、0.01 mol/L KHPO，pH 6.0），充分混合后室溫避光靜置25 min，使用酶標(biāo)儀于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.9 游離氨基酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品加入至10 mL 0.02 mol/L稀鹽酸溶液，充分均質(zhì)后用冷凍離心機(jī)（5 000 r/min、4 ℃）離心10 min，收集上清液。將剩余殘?jiān)尤胫?0 mL 0.02 mol/L稀鹽酸中攪拌，再次離心5 min，合并兩次離心上清液，定容至50 mL。定容后移取2 mL樣品溶液，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液，再次離心（5 000 r/min、4 ℃）10 min，然后經(jīng)0.22 μm水相過(guò)濾膜過(guò)濾，通過(guò)L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為P/N 855-4507標(biāo)準(zhǔn)蛋白水解分析柱（4.6 mm×60 mm）；流動(dòng)相為氨基酸緩沖溶液、茚三酮緩沖溶液R1、R2；分離柱溫度：梯度升溫；梯度洗脫；反應(yīng)柱溫度：135 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.10 總可溶性蛋白含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)不同處理的凍干蝦粉樣品0.2 g，溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，7 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè)法測(cè)定蝦樣品的總可溶性蛋白含量，首先用系列質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取40 μL待測(cè)樣品與200 mL考馬斯亮藍(lán)G250充分混合，室溫避光反應(yīng)5 min后，用移液槍吸取200 μL至96 孔板，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的總可溶性蛋白含量。

1.3.11 體外蛋白模擬消化測(cè)定

根據(jù)Hejazi和劉艷美等的方法并加以改進(jìn)，采用胃-胰蛋白酶兩步消化法對(duì)蝦粉進(jìn)行體外模擬消化。使用1 mol/L HCl溶液將樣品（20 mL 50 mg/mL）pH值調(diào)至2，將胃蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照樣品與胃蛋白酶100∶1的質(zhì)量比添加胃蛋白酶，37 ℃恒溫?fù)u床中消化3 h，用1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH值至7.6，將胰蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照樣品與胰蛋白酶100∶1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，37 ℃條件下消化2 h，用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，體外消化率按下式計(jì)算。

式中：為消化前的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為消化后的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中Duncan multiple range test法對(duì)數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉提取物微觀結(jié)構(gòu)的影響

Aguilera等指出，結(jié)構(gòu)和功能之間存在聯(lián)系，要想正確分析和控制食物的屬性，對(duì)其加工過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的了解至關(guān)重要。本研究使用熒光電動(dòng)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察不同超聲時(shí)間處理的蝦樣品。通過(guò)圖1可以觀察出，未經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品細(xì)胞組織之間連接緊密，且分布不均勻，超聲5 min的樣品與之相比細(xì)胞組織之間分布松散、空隙增大；隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品組織之間的間隙進(jìn)一步增大，在視野范圍內(nèi)分散得也更加均勻，而超聲25 min和超聲35 min的細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間沒(méi)有明顯差異，分布都比較均勻松散。

圖1 不同超聲時(shí)間處理蝦樣品的熒光電動(dòng)顯微鏡圖Fig. 1 Fluorescence electromotive microscopic images of shrimp samples treated with ultrasound

從圖2掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果可以看出，未經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品顯示出完整、光滑的邊緣，而超聲處理5 min就能明顯觀察到片狀組織碎片的產(chǎn)生；超聲時(shí)間延長(zhǎng)至15 min可以觀察到更多的碎片，并且開(kāi)始出現(xiàn)條狀組織碎片；超聲25～35 min可以看到表面出現(xiàn)了不規(guī)則的孔洞，結(jié)構(gòu)被破壞的程度進(jìn)一步加劇，可能是超聲產(chǎn)生的剪切力和空化作用對(duì)蝦樣品的微觀結(jié)構(gòu)造成了破壞，且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)破壞程度也增大。

圖2 超聲處理蝦樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of shrimp samples treated with ultrasound

2.2 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白粒徑的影響

粒徑的變化可以反映出蛋白質(zhì)的聚集程度。由圖3可知，與對(duì)照組相比，超聲處理5 min后，平均粒徑從（268.70±3.70）nm下降到（153.90±2.67）nm，說(shuō)明超聲波處理可以顯著減小蛋白質(zhì)的平均粒徑，這是超聲過(guò)程中的空化泡破裂產(chǎn)生的機(jī)械力高速剪切，使得蛋白質(zhì)溶液變得更均勻。超聲波處理25 min后，平均粒徑降至（112.40±3.00）nm，隨著處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，平均粒徑變化不顯著，超聲35 min時(shí)平均粒徑甚至略有上升，這可能是過(guò)度超聲處理使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子之間非共價(jià)鍵被破壞，形成新的化學(xué)鍵，使得相互作用力增加，從而使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。孫攀研究超聲處理對(duì)金槍魚(yú)肌原纖維蛋白粒徑的影響，也發(fā)現(xiàn)在超聲18 min時(shí)蛋白的平均粒徑降低28%，但是延長(zhǎng)超聲時(shí)間至24 min時(shí)，粒徑反而增加。此外，葉鈺等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以使蛋清蛋白部分蛋白質(zhì)分子平均粒徑變小，還可以使整體粒徑分布范圍變窄，均勻度提高；而蛋白平均粒徑的降低，從理論上可以增加蛋白的消化率。

圖3 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白粒徑的影響Fig. 3 Influence of ultrasound on the particle size of shrimp proteins

2.3 超聲對(duì)對(duì)蝦原肌球蛋白含量的影響

原肌球蛋白（34～36 kDa）是對(duì)蝦的主要過(guò)敏原，具有一定的熱穩(wěn)定性。Shriver等分別用煮沸和脈沖紫外光處理大西洋白蝦，發(fā)現(xiàn)用脈沖紫外光處理大西洋白對(duì)蝦4 min可以使蝦原肌球蛋白的反應(yīng)原性和免疫球蛋白E結(jié)合水平降低，而煮沸反而會(huì)增加原肌球蛋白和免疫球蛋白E的結(jié)合能力。由圖4可知，35 kDa處蛋白電泳條帶隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)顏色逐漸變淺，說(shuō)明超聲處理后35 kDa處原肌球蛋白含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。由圖5可知，經(jīng)ELISA定量分析，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，原肌球蛋白含量從對(duì)照組的（2.09±0.08）ng/mg降低至超聲處理25 min后的（0.81±0.06）ng/mg（＜0.05），在超聲35 min時(shí)原肌球蛋白的含量降到最低（（0.78±0.08）ng/mg），降低了62.68%，表明超聲波可以顯著降低原肌球蛋白含量，進(jìn)而降低對(duì)蝦致敏性，這可能是高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空化作用以及引入的自由基攻擊原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)所致。Liu Guangxian等研究了超聲處理對(duì)乳糖蛋白致敏性的消減作用，結(jié)果表明，經(jīng)超聲處理后乳糖蛋白抗原性出現(xiàn)一定程度降低，且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)乳糖蛋白抗原性不斷降低，本研究結(jié)果與之相符。

圖4 超聲處理對(duì)蝦蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE patterns of shrimp proteins subjected to ultrasonic treatment

圖5 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品原肌球蛋白含量的影響Fig. 5 Influence of ultrasonic treatment on tropomyosin content in shrimp samples

2.4 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

采用傅里葉變換紅外光譜分析不同超聲時(shí)間處理對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。對(duì)于酰胺I區(qū)，不同的波數(shù)范圍對(duì)應(yīng)不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中1 600～1 640 cm對(duì)應(yīng)-折疊，1 640～1 650 cm對(duì)應(yīng)無(wú)規(guī)卷曲，1 650～1 660 cm對(duì)應(yīng)-螺旋，1 660～1 700 cm對(duì)應(yīng)-轉(zhuǎn)角，通過(guò)Peakfit 4.12軟件擬合可以得到蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。從圖6和圖7可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量明顯減少，而-轉(zhuǎn)角和-折疊相對(duì)含量總體有所增加，表明超聲波處理使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中部分無(wú)規(guī)卷曲向-轉(zhuǎn)角和-折疊轉(zhuǎn)化，這與Jiang Lianzhou等研究超聲波處理對(duì)黑豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致。-轉(zhuǎn)角是對(duì)蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分，經(jīng)過(guò)超聲之后其相對(duì)含量較對(duì)照組略有增加，而-螺旋相對(duì)含量的變化隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，這使得蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向于展開(kāi)，這與Yang Xue等研究300 W超聲波處理使大米蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋向-折疊轉(zhuǎn)化的結(jié)果相符。綜上，超聲處理可以使蝦蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從無(wú)規(guī)卷曲、-螺旋向-折疊和-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化。

圖6 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 6 FTIR spectra of shrimp proteins treated by ultrasound

圖7 超聲對(duì)對(duì)蝦蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 7 Influence of ultrasonic treatment on secondary structure of shrimp proteins

2.5 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉蛋白巰基含量的影響

巰基基團(tuán)屬于弱二級(jí)鍵，可以參與次級(jí)鍵的形成，起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，巰基含量和表面疏水性的變化在一定程度上可以揭示蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。從圖8可以看出，蝦肉中巰基含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，當(dāng)超聲處理35 min時(shí)，巰基含量從對(duì)照組的19.52 μmol/g顯著提高到25.81 μmol/g。巰基含量的增加可能是超聲產(chǎn)生的空化作用破壞了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨向于延伸和展開(kāi)，導(dǎo)致在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基等疏水基團(tuán)暴露；也可能是超聲波在液體介質(zhì)傳播中產(chǎn)生的剪切力和湍流作用導(dǎo)致蝦肉蛋白中二硫鍵斷裂，從而產(chǎn)生了新的巰基。

圖8 超聲處理對(duì)對(duì)蝦樣品巰基含量的影響Fig. 8 Influence of ultrasonic treatment on sulfhydryl content of shrimp samples

2.6 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品總抗氧化能力的影響

圖9反映了超聲波處理對(duì)對(duì)蝦蛋白抗氧化能力的影響。對(duì)蝦蛋白的總抗氧化能力隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，超聲35 min時(shí)，從（24.61±1.14）μmol/100 mg增加到（47.76±1.64）μmol/100 mg，表明長(zhǎng)時(shí)間的高強(qiáng)度超聲處理有利于增加蝦樣品的抗氧化能力。Abid等的研究結(jié)果表明超聲處理能顯著提高蘋(píng)果汁的自由基清除能力，超聲處理后蘋(píng)果汁總抗氧化能力顯著提高，這是由于超聲波的機(jī)械作用增加了果汁中抗壞血酸和多酚類(lèi)化合物的提取率和有效性。因此，推測(cè)超聲波處理也可能提高了蝦肌肉提取物中抗氧化活性物質(zhì)的提取率，導(dǎo)致對(duì)蝦樣品的總抗氧化能力提高；除此之外，Alicia等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熱超聲處理的黑莓汁與普通巴氏殺菌黑莓汁相比，抗氧化活性和滅酶能力顯著提高。由此推斷，在超聲波處理的過(guò)程中一些與氧化反應(yīng)相關(guān)的酶（如多酚氧化酶）由于超聲的空化作用引入自由基攻擊而失活，這也可能會(huì)增加樣品的總抗氧化能力。

圖9 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品總抗氧化能力的影響Fig. 9 Influence of ultrasonic treatment on total antioxidant capacity of shrimp samples

2.7 超聲對(duì)對(duì)蝦肌肉提取物游離氨基酸含量的影響

凡納濱對(duì)蝦具有較好的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，蝦肉中含有18 種氨基酸，其中必需氨基酸占比達(dá)到近40%。通過(guò)表1可以看出，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，部分游離氨基酸的含量明顯增加，這是超聲波的空化效應(yīng)及伴隨其產(chǎn)生的機(jī)械作用和瞬時(shí)高溫高壓破壞了蛋白質(zhì)肽鏈，以及對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞可能使更多酶作用位點(diǎn)暴露所致。其中甘氨酸、天冬氨酸等呈鮮味的氨基酸含量增加較多，脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸等和甘味相關(guān)的氨基酸含量也明顯提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些人體必需氨基酸如賴(lài)氨酸、甲硫氨酸的含量明顯增加，其在人體中可以起到抗氧化和增強(qiáng)免疫力的作用，精氨酸含量的增加對(duì)人體代謝具有積極的作用，它能催化鳥(niǎo)氨酸循環(huán)的進(jìn)行、促進(jìn)尿素的形成，從而使人體內(nèi)的氨變成無(wú)毒尿素，這些必需游離氨基酸含量的增加從理論上可以提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 超聲對(duì)對(duì)蝦樣品游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of ultrasonic treatment on the contents of free amino acids in shrimp samples mg/g

2.8 超聲對(duì)對(duì)蝦可溶性蛋白含量及體外消化率的影響

由表2可知，長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理降低了對(duì)蝦樣品的總可溶性蛋白含量，經(jīng)過(guò)超聲處理35 min后對(duì)蝦樣品的總可溶性蛋白含量從（331.83±7.75）mg/g顯著降低到（232.29±9.47）mg/g（＜0.05）。Kang Dacheng等發(fā)現(xiàn)20 kHz超聲波處理30～120 min后，牛肉的總可溶性蛋白含量會(huì)顯著降低，這可能與超聲波處理后超聲空化泡破裂產(chǎn)生的強(qiáng)微射流作用于蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其氫鍵和肽鏈斷裂有關(guān)，同時(shí)由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，埋藏在內(nèi)部的疏水性基團(tuán)更多暴露在表面，這也導(dǎo)致了可溶性蛋白含量的降低。經(jīng)過(guò)超聲處理5 min后的蝦肌肉提取物體外消化率與對(duì)照組相比有所提高，超聲15 min時(shí)顯著提高到78.13%，超聲35 min時(shí)消化率顯著提高到81.97%。根據(jù)Dong Xin等的研究，高強(qiáng)度超聲處理20 min能顯著增加蝦樣品的體外消化率，超聲波處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象展開(kāi)和平均粒徑降低，可以提高體外蛋白消化率；Jia Junqiang等也發(fā)現(xiàn)，在20 kHz、1 500 W、20 min超聲處理?xiàng)l件下脫脂小麥胚芽蛋白肽的酶解消化率提高到21.0%，這可能是超聲波的微射流和空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，使蛋白質(zhì)構(gòu)象從卷曲和緊密折疊到趨向于展開(kāi)，增加了和酶反應(yīng)的活性位點(diǎn)數(shù)量和空間，從而進(jìn)一步增加了消化率。

表2 超聲對(duì)對(duì)蝦可溶性蛋白含量和體外消化率的影響Table 2 Effect of ultrasonic treatment on solubility and in vitro digestibility of shrimp proteins

3 結(jié) 論

本研究以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，通過(guò)超聲波處理凡納濱對(duì)蝦肌肉全蛋白提取物，探究高強(qiáng)度超聲對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果表明，高強(qiáng)度的超聲波處理可以改變凡納濱對(duì)蝦的微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)顯著降低原肌球蛋白含量；經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量明顯減少，-螺旋相對(duì)含量略有降低，-折疊和-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加；高強(qiáng)度超聲還可以影響凡納濱對(duì)蝦的理化和功能特性，提高其抗氧化能力和游離氨基酸含量；同時(shí)蛋白平均粒徑也隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，體外蛋白消化率則會(huì)因?yàn)槌曁幚矶黾?，表明高?qiáng)度超聲處理產(chǎn)生的空化作用、剪切力和湍流力等作用對(duì)蝦肌肉蛋白產(chǎn)生影響，可以有效降低蝦蛋白的致敏性，改變蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性以及提高其潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。