趙澤豐，年 夢，姬曉彤，楊曉航，喬海法*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽 712046；2. 陜西省針藥結(jié)合重點實驗室，咸陽 712046；3.咸陽市神經(jīng)生物學(xué)(針灸)重點實驗室，咸陽 712046

在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)諸多的發(fā)病原因假說中，有學(xué)者提出β淀粉樣蛋白(Aβ)是AD發(fā)生的重要始動因素[1]，并且在AD發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。Aβ通過多種機制損傷神經(jīng)元，擾亂突觸功能，最終導(dǎo)致AD相關(guān)的認知功能障礙。Aβ是由36～43個氨基酸殘基組成的多肽，其主要成分為Aβ40和Aβ42，由β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)先后經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解生成，其中在細胞中Aβ40產(chǎn)生的量是Aβ42的9倍，較長的Aβ42更易發(fā)生聚集，具有較強的神經(jīng)細胞毒性[3]。β位淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶1(BACE1，又稱β-分泌酶)是一種天冬氨酸蛋白酶，它在腔隙中精準切割A(yù)PP的β位點，該步驟被認為是決定Aβ生成的限速步驟。BACE1抑制劑具有多種優(yōu)勢，能對APP的初步水解進行限制，在早期預(yù)防Aβ的生成。

目前，已有多種針對BACE1靶點的抑制劑進入上市前的臨床研究，包括處于臨床二期階段的阿斯利康的AZD3293、臨床三期的默克MK-8931、衛(wèi)材臨床三期的E2609等[4]。多種天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑近年來也被各課題組廣泛報道，本文將根據(jù)抑制劑的結(jié)構(gòu)類型對其進行分類，并對抑制劑的來源植物、有效劑量等方面進行總結(jié)，以期為該類天然產(chǎn)物的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 BACE1的結(jié)構(gòu)特征

隨著包括冷凍電鏡在內(nèi)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段的進步，目前，BACE1蛋白的三維結(jié)構(gòu)被解析并用于其抑制劑的篩選中[5-6]，處于臨床研究或臨床前研究的抑制劑與BACE1的共晶結(jié)構(gòu)均被報道[7]。結(jié)構(gòu)上，BACE1與同源度較高蛋白B位淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶2(BACE-2)等具有相似性，其催化活性位點空間較大，包含氨基酸殘基及10S loop區(qū)等，故設(shè)計與開發(fā)尺寸合適的小分子配體占據(jù)該活性位點具有一定挑戰(zhàn)性。BACE1屬于Ⅰ型跨膜天冬氨酸蛋白酶家族，由501個氨基酸組成(見圖1)。它有一個N端、一個C端和一個連接N端和C端結(jié)構(gòu)域的間結(jié)構(gòu)域。BACE1位于酸性細胞內(nèi)室，包括反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)和核內(nèi)體裂解底物，促進Aβ蛋白片段的形成。目前研究表明，在酸性條件下，BACE1的酶活力處于最佳狀態(tài)，BACE1抑制劑在結(jié)構(gòu)上一般需要具有堿性基團裸露，酸度系數(shù)pKa在6.0以上往往表現(xiàn)出更好的親和力。位于配體結(jié)合位點的催化二聯(lián)體Asp32和Asp228(見圖1)對酶的蛋白水解活性至關(guān)重要。配體與2種氨基酸結(jié)合會增強結(jié)合親和力。

注：A.BACE1的蛋白結(jié)構(gòu)；B.BACE1與配體的結(jié)合口袋。

根據(jù)BACE1的結(jié)構(gòu)，目前已有多種抑制劑設(shè)計的研究被報道。早期設(shè)計的BACE1抑制劑以其底物類似物為主，主要是肽類和擬肽類抑制劑。肽類抑制劑針對BACE1在APP切割位置周圍的氨基酸序列而設(shè)計，此類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)上都有羥基的存在，可以與天冬氨酸蛋白酶的活性殘基以氫鍵結(jié)合從而達到抑制BACE1活性的目的[8]。但由于多肽抑制劑的口服生物利用度低、體內(nèi)易水解、相對分子質(zhì)量大、氫鍵供體及氫鍵受體數(shù)量較多等特征使得它們難以滲透，特別是難以通過血腦屏障，嚴重限制了其進一步在臨床應(yīng)用。此后，在肽類抑制劑的研究基礎(chǔ)上，通過生物電子排體等藥物設(shè)計手段，研究者又設(shè)計了具有較小相對分子質(zhì)量的擬肽類抑制劑及非肽類抑制劑等小分子抑制劑[9]，為BACE1的小分子抑制劑探索與開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2 天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑

在我國，已有多種基于包括中藥在內(nèi)的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)開發(fā)的成藥上市，其中包括抗AD藥物石杉堿甲[10]、抗卒中藥物丁苯酞[11-12]等。與合成藥物相比，天然化合物具有較高的安全性及多樣的分子骨架。目前，包括黃酮、三萜及甾體、香豆素、蒽醌、鞣質(zhì)多酚及生物堿在內(nèi)的多種成分已被報道具有BACE1抑制活性，本文將根據(jù)結(jié)構(gòu)類型進行分類，對天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑進行總結(jié)，并通過表格直觀總結(jié)各抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源植物及有效劑量，見表1。

表1 天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑

表1(續(xù)) 天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑

表1(續(xù)) 天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑

表1(續(xù)) 天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑

2.1 黃酮類BACE1抑制劑

在開發(fā)天然產(chǎn)物BACE1抑制劑的過程中，許多研究者將目光投向了藥用植物中富含的黃酮類化合物。黑姜(Kaempferiaparviflora)中提取的多甲氧基黃酮主要由3種成分組成：5,7-二甲氧基黃酮(DMF)，5,7,4′-三甲氧基黃酮(TMF)和3,5,7,3′,4′-五甲氧基黃酮(PMF)，以上3個多甲氧基黃酮類化合物均被報道具有較強的BACE1抑制活性，而對α-分泌酶和其他絲氨酸蛋白酶的影響不顯著，具有較強的選擇性。KUMJU YOUN等[13]針對BACE1靶點抑制的多甲氧基黃酮開展了深入研究，結(jié)果表明，黑姜多甲氧基黃酮具有較強的BACE1抑制活性，其中TMF(化合物1，見表1)對BACE1的抑制效果最強，半數(shù)抑制濃度(IC50)為36.9 μmol·L-1，其次分別為DMF(化合物2，IC50為49.5 μmol·L-1)和PMF(化合物3，IC50為59.8 μmol·L-1)。構(gòu)效關(guān)系研究表明，黃酮A環(huán)上C-5和C-7處的甲氧基及B環(huán)C-4′處的甲氧基提升了BACE1抑制活性(TMF>DMF>PMF)，C-3處和C-3′位置上的甲氧基降低了BACE1的抑制活性。酶動力學(xué)實驗證明這些化合物是通過結(jié)合異構(gòu)位點與酶相互作用，因此是非競爭性BACE1抑制劑，其抑制機制與直接和活性部位結(jié)合的人工合成的多肽類化合物作為競爭性抑制劑不同[14]。

此外，KUMJU YOUN等[15]對鷹嘴豆素(4)的BACE1抑制活性進行了探究。鷹嘴豆素為廣泛存在于中藥與功能食品中的一種異黃酮，研究表明，該化合物對BACE1的IC50為20 μmol·L-1，其抑制特征為非競爭性抑制。2017年KUMJU YOUN等[16]還從橘皮中提取得到了多種BACE1抑制活性成分，其結(jié)構(gòu)均為多甲氧基黃酮類似物，典型化合物包括川陳皮素(5)、桔皮素(6)及5,6,7,3′,4′-五甲氧基黃酮(7)，其抑制BACE1的IC50分別為59、49、63 μmol·L-1。

ZHENXING ZOU等[17]從深綠卷柏(Selaginelladoederleinii)中分離得到的黃酮三聚體化合物，被證實對BACE1有較好的抑制作用。在分離出的多種黃酮三聚體類化合物中，化合物8表現(xiàn)出較強的BACE1抑制潛力，體外熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測結(jié)果表明，其抑制BACE1的IC50為0.75 μmol·L-1，其結(jié)構(gòu)單元為柚皮素。

MD YOUSOF ALI等[18]報道了3種黃酮苷類化合物香風(fēng)草苷(9)、枸橘苷(10)和柚皮素-7-O-葡萄糖苷(11)具有BACE1抑制活性(IC50分別為 2.3、4.0、13.4 μmol·L-1)。酶動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，這3種化合物均為BACE1混合型抑制劑，并且能夠減少Aβ在淀粉樣蛋白生成途徑中的聚集。進一步研究表明，這些黃酮苷類化合物對BACE1的抑制活性優(yōu)于黃酮苷元槲皮素(IC50為21.7 μmol·L-1)。

QING-XIA XU等[19]從補骨脂(Cullencorylifolium)中分離得到4種異戊烯基黃酮類化合物，并測定了其多靶點抗AD活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種化合物均具有一定的BACE1抑制活性，其中補骨脂查爾酮(12)表現(xiàn)出較顯著的BACE1抑制活性，其100 μmol·L-1抑制率為63%，進一步研究表明，該化合物也具有較強的抗Aβ42聚集活性，適宜作為先導(dǎo)物進行進一步開發(fā)。

JIAYI TAO等[20]從筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)中分離得到了多種二氫查爾酮及二氫黃酮類化合物并測定了其BACE1抑制活性，結(jié)果表明，化合物3,4,2′,6′-tetrahydroxydihydroflavone-4′-O-β-D-glucopyranose(13)具有較顯著的BACE1抑制活性，其100 μmol·L-1抑制率為21.4%，其他分離得到的化合物同劑量抑制率在5.3%～18%之間。

JINGQIU DAI等[21]從垂葉榕(Ficusbenjamina)的黃色果實中分離得到了多種單體，其中異黃酮類化合物5,7,2′,4′-tetrahydroxy-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl) isoflavone(14)與lupiwighteone(15)表現(xiàn)出明顯的BACE1抑制活性，其IC50分別為45、27 μmol·L-1，較其他類型化合物表現(xiàn)出了更強的開發(fā)潛力。

JUNG KEUN CHO等[22]從桑樹(Moruslhou)莖皮提取物中發(fā)現(xiàn)甲醇提取部位具有BACE1抑制作用，其IC50值為78.4 μg·mL-1，進一步采用活性導(dǎo)向分離的方法得到多種具有BACE1抑制作用的黃酮類化合物，其中優(yōu)效化合物為kuwanon C(16，IC50為3.4 μmol·L-1)，初步構(gòu)效關(guān)系研究表明，異戊烯基取代黃酮的BACE1抑制活性優(yōu)于閉環(huán)的吡喃類黃酮。

2.2 三萜及甾體類BACE1抑制劑

三萜及甾體類成分同樣被報道具有BACE1抑制活性。S M ZAHID HOSEN等[23]對印度民間抗痙攣止瀉藥物火筒樹(Leeaindica)中抑制BACE1活性成分進行了深入研究，通過植物化學(xué)方法從該植物中先后分離出40種單體，隨后結(jié)合分子模擬對接技術(shù)，鑒定出熊果酸(17)和羽扇豆醇(18)這2個具有較高BACE1親和力的三萜類化合物，后續(xù)研究表明，羽扇豆醇抑制BACE1的IC50值為5.12 μmol·L-1。構(gòu)效關(guān)系研究表明，這些三萜結(jié)合與BACE1結(jié)合的活性位點是由熊果酸與Asn233和Thr232殘基之間形成氫鍵驅(qū)動的，而羽扇豆醇則通過氫鍵與Gly11殘基相互作用，并與活性位點形成更強的疏水作用。雖然這2種化合物都能與瓣區(qū)Tyr71殘基形成疏水性相互作用，但卻不能與天冬氨酸殘基(Asp32和Asp228)相互作用。藥代動力學(xué)參數(shù)計算結(jié)果表明，羽扇豆醇比熊果酸能更有效地穿過血腦屏障。

CLAUDIA SCHINKE等[24]從單環(huán)刺螠中分離出2種具有抗AD作用的甾體化合物。利用熒光共振能量傳遞法對這些化合物進行BACE1的半有效濃度(EC50)值測試，鑒定出海柯吉寧(19)的EC50值為116.3 μmol·L-1，而4-膽甾烯-3-酮(20)的IC50值為390.6 μmol·L-1。與人工合成BACE1抑制劑相比，天然產(chǎn)物來源的?？录獙幣c4-膽甾烯-3-酮的相對分子質(zhì)量更低，可有效穿透血腦屏障。

ADITI WAGLE等[25]報道了甘草酸(21)及其代謝產(chǎn)物甘草次酸的BACE1抑制活性，結(jié)果顯示，甘草酸的BACE1抑制IC50值為20.1 μmol·L-1，而甘草次酸的抑制活性則受到C-18位構(gòu)型的明顯影響，18-α型甘草次酸(22)IC50值為104.4 μmol·L-1，而18-β型甘草次酸(23)的IC50值僅為8.9 μmol·L-1，進一步酶動力學(xué)研究表明，甘草酸為非競爭性BACE1抑制劑，而甘草次酸則為競爭性BACE1抑制劑。

VAN THU NGUYEN等[26]從Lycopodiellacernua中分離純化了4種單體并測定了其BACE1抑制活性，結(jié)果表明，化合物21β-hydroxyserrat-14-en-3,16-dione(24)表現(xiàn)出了強于其他化合物的BACE1抑制活性(IC50值為0.2 μmol·L-1)，初步構(gòu)效關(guān)系分析可知，這類化合物的母核結(jié)構(gòu)為甾體時，活性強于皂苷類衍生物。

2.3 香豆素類BACE1抑制劑

目前，從天然產(chǎn)物中提取分離的多種香豆素類成分也被報道具有BACE1抑制活性。SU HUI SEONG等[27]從桑樹的根皮中分離了多種單體并考察了桑辛素類似物的BACE1抑制活性，研究結(jié)果表明，化合物moracin S(25)表現(xiàn)出了較顯著的BACE1抑制活性，其IC50值為3.1 μmol·L-1，且呈競爭性抑制特點。

SHINSUKE MARUMOTO等[28]從白芷提取物中發(fā)現(xiàn)氯仿提取部位表現(xiàn)出了較強的BACE1抑制活性，其IC50值為3.1 μg·mL-1，進一步根據(jù)活性導(dǎo)向分離得到多種單體，其中活性最強的化合物是歐前胡素(26)，其IC50值為91.8 μmol·L-1。此外，該課題組還揭示了其他香豆素抑制BACE1的構(gòu)效關(guān)系[29]，篩選得到活性最強的單體5-geranyloxy-8-methoxypsoralen(27，IC50值為9.9 μmol·L-1)，其活性遠強于其他化合物，動力學(xué)研究表明，該化合物呈混合型抑制特征。

2.4 蒽醌類BACE1抑制劑

SHENG-NAN WANG等[30]從山竹果(Garciniamangostana)中提取得到了7種蒽醌類單體成分，對其進行BACE1抑制活性測定發(fā)現(xiàn)，α-倒棯子素(28)的抑制活性較明顯，100 μmol·L-1抑制率為62.7%，進一步研究發(fā)現(xiàn)，該化合物還具有抗Aβ42蛋白自發(fā)聚集活性。對于該化合物，LAN-XUE ZHAO等[31]做了進一步探索，發(fā)現(xiàn)其抑制BACE1的IC50值僅為13.2 nmol·L-1，且能減少Aβ42及Aβ42蛋白在小鼠皮層神經(jīng)元中的沉積，且不影響非淀粉樣和淀粉樣途徑或淀粉樣前體蛋白成熟相關(guān)酶的表達。

2.5 鞣質(zhì)多酚類BACE1抑制劑

鞣質(zhì)多酚類成分一般在天然產(chǎn)物開發(fā)過程中作為副產(chǎn)物存在，而目前部分研究揭示了其作為潛在BACE1抑制劑進行開發(fā)的可能。HIMANSHU KUMAR BHAKTA等[32]從山茱萸(Cornusofficinalis)中得到了與山茱萸新苷結(jié)構(gòu)類似的多種鞣質(zhì)類成分，其中化合物1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose(29)表現(xiàn)出了明顯的BACE1抑制活性，其抑制BACE1的IC50值為20.2 μmol·L-1，且呈非競爭性抑制特征。其活性優(yōu)于同時測定的特里馬素Ⅱ等化合物。

KUMJU YOUN等[33]報道老鶴草(Geraniumthunbergii)的乙酸乙酯提取部位具有較強的BACE1抑制活性，其50 μg·mL-1抑制率為69.39%，多酚化合物老鶴草素(30)及鞣云實素(31)被鑒定為主要活性成分，其中老鶴草素的活性較強，其抑制BACE1的IC50值為4.0 μmol·L-1，約為鞣云實素的9倍。

2.6 生物堿類BACE1抑制劑

生物堿類成分同樣被認為具有BACE1抑制活性，根據(jù)BACE1結(jié)構(gòu)特征，含有裸露堿性基團的抑制劑更有可能與BACE1發(fā)生親和作用，因此，生物堿類成分作為BACE1抑制劑進行進一步開發(fā)有其自身的合理性。作為從中藥千層塔(Huperziaserrata)中分離的主要成分石杉堿甲(32)的抗AD活性已被廣泛證實，而其BACE1抑制活性近年來亦被報道[34]。石杉堿甲被認為能夠通過激活腦內(nèi)Wnt信號，以減少AD動物腦內(nèi)淀粉樣病變，石杉堿甲處理的小鼠大腦中BACE1和APP695蛋白水平降低，隨后Aβ水平和Aβ負荷降低，這表明石杉堿甲增強了非淀粉樣變性APP分裂途徑。進一步研究結(jié)果表明，石杉堿甲抑制GSK3α/β活性、提高腦內(nèi)β-catenin水平、激活腦內(nèi)Wnt信號以發(fā)揮抗AD作用。后續(xù)有研究表明[35]，石杉堿甲還可能通過調(diào)節(jié)BACE1的過度跨膜轉(zhuǎn)運以改善Aβ蛋白沉積。

JAKUB CHLEBEK等[36]從紫堇科植物Corydaliscava中分離得到了多種生物堿類成分，對其進行活性評價發(fā)現(xiàn)，化合物(-)-corycavamine(33)與(+)-corynoline(34)呈現(xiàn)出明顯的BACE1抑制活性，其5 μmol·L-1抑制率分別為41.16%、33.59%，進一步研究表明，這2種化合物具有一定的血腦屏障透過能力，在抗AD多靶點研究層面，化合物33具有潛在的AChE/BChE抑制能力，而化合物34則具有一定的脯氨酰寡肽酶抑制能力。

3 總結(jié)與展望

BACE1抑制劑在治療AD方面的作用目前已在諸多研究中得到證實，目前已有多種天然產(chǎn)物活性成分被報道具有BACE1抑制活性?？傮w而言，該類天然產(chǎn)物的進一步開發(fā)仍面臨以下問題：(1)相較于基于BACE1靶標結(jié)構(gòu)設(shè)計合成的抑制劑，天然產(chǎn)物對于BACE1的抑制活性總體較弱；(2)目前研究對天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑仍以體外研究為主，藥代動力學(xué)等方面特征考察較少，成藥性尚不明確；(3)BACE1抑制劑目前尚無成藥上市，臨床研究多以失敗告終，對天然產(chǎn)物來源的BACE1抑制劑的進一步開發(fā)更是任務(wù)艱巨。盡管困難重重，從業(yè)者對于BACE1抑制劑的開發(fā)卻從未停下腳步，相信在未來，隨著免疫神經(jīng)學(xué)、表觀遺傳學(xué)、微生物組學(xué)、計算機輔助藥物設(shè)計[37-38]等新興技術(shù)的發(fā)展，基于天然產(chǎn)物的BACE1抑制劑的開發(fā)研究終將為AD患者帶來福音。