劉 蕾 ，李海濤 ，鄭華月 ，陳 瓊

1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院兒科，南陽 473000；2.鄭州兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，鄭州 450053

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢，多見于兒童或青少年，且具有不可治愈性，給患者家庭及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。臨床以胰島素或二甲雙胍等降糖藥控制糖尿病患者的血糖水平，而在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)低血糖、體質(zhì)量增加、過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)可影響治療進展，探尋不良反應(yīng)小的藥物是臨床研究重點[3-4]。中藥提取物具有毒性與不良反應(yīng)小、作用溫和等優(yōu)點，如茯苓具有利水滲濕、健脾寧心之效，其化學(xué)成分具有抗氧、降血脂、抗衰老等多種藥理作用[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)[6]，或可通過改變腸道菌群組成來防治T1DM，而有學(xué)者在研究茯苓三萜類化合物對腸上皮完整性中發(fā)現(xiàn)，其可改善腸道屏障功能[7]?；诖耍狙芯拷1DM小鼠模型，用茯苓提取物(poria cocos extract，PCE)等灌胃干預(yù)，探討其降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群的作用機制，為臨床新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技有限公司，Attune NxT)；德國Applied Biosystems 2720熱循環(huán)儀。

1.2 試藥

PCE(CAS：65637-98-1)購自上海昕凱醫(yī)藥科技有限公司；二甲雙胍(國藥準(zhǔn)字H20174087)購自鄭州泰豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素(CAS：18883-66-4)購自Sigma-Aldrich(上海)公司；胰島素(insulin，INS)與胰高血糖素(glucagon，GC)試劑盒均購自廣州市進德生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)ELISA試劑盒與CD4、CD25、FOXP3、IL-17A抗體均購自Abcam公司。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠60只，雄性，SPF級，6周齡，體質(zhì)量17～22 g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0010，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由采食進水，保持溫度23 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h交替光-暗飼養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1 配制鏈脲佐菌素溶液

將鏈脲佐菌素在預(yù)冷0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH環(huán)境4.2～4.5)中溶解，配成20 g·L-1的鏈脲佐菌素溶液，用濾菌器過濾除菌，避光保存，保證30 min內(nèi)注射完成。

2.2 建立T1DM小鼠模型[8]

取48只小鼠造模，小鼠禁食不禁水12 h，現(xiàn)配鏈脲佐菌素溶液腹腔注射，200 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)3 d，注射完成后，小鼠自由飲水?dāng)z食，觀察造模小鼠飲水、攝食、排尿等情況。5 d后，采集小鼠尾靜脈血，用血糖儀檢測小鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，F(xiàn)PG范圍在11.1～25.0 mmol·L-1為T1DM造模成功，棄去未成模小鼠。

2.3 分組與干預(yù)方法

剩余12只小鼠作為對照組，造模成功43只小鼠隨機分為模型組(11只)、PCE低劑量組(11只)、PCE高劑量組(11只)及二甲雙胍組(10只)。造模成功后第2天，PCE低劑量組、高劑量組對應(yīng)予以PCE 3.0、12.0 g·kg-1灌胃，二甲雙胍組予以0.2 g·kg-1二甲雙胍灌胃，對照組與模型組均予以5 mL·kg-1雙蒸水灌胃，各組干預(yù)均為每日1次，連續(xù)灌胃28 d。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1血糖檢測儀測定小鼠FPG水平 末次干預(yù)后，禁食12 h，固定小鼠，摘除眼球法采血，用血糖儀與醫(yī)用血糖試紙檢測各組小鼠FPG水平。

2.4.2ELISA法檢測血清INS、GC水平 采集全血進行離心處理，以3 000 r·min-1，離心5 min，-70 ℃保存，ELISA法檢測，加入樣品、對照品后37 ℃反應(yīng)(30 min)，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37 ℃反應(yīng)(30 min)，再次洗板，加入顯色液，37 ℃顯色10 min，加入終止液，15 min讀取A值，計算小鼠血清INS、GC水平。

2.4.3HE染色觀察小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué) 采血完畢，脫頸處死小鼠，分離出胰腺組織、結(jié)腸組織等。甲醛固定胰腺組織，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明、包埋，切片機切片(4 μm)，蘇木精染色10 s，自來水沖洗3 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化20 s，自來水沖洗15 min，伊紅染色5 s；乙醇中脫水，二甲苯透明，中性樹膠固片，光學(xué)顯微鏡觀察胰腺病理學(xué)變化。

2.4.4ELISA法檢測結(jié)腸組織勻漿炎性因子水平 取結(jié)腸組織，每50 mg組織加PBS溶液1 mL，剪刀剪碎，進行超聲勻漿，4 ℃以3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，-80 ℃保存，ELISA法檢測，進行包被洗滌、上樣孵育、加酶標(biāo)二抗孵育洗滌、加底物液顯色、加終止反應(yīng)液終止反應(yīng)、450 nm酶標(biāo)儀測定吸光度值，計算結(jié)腸組織IL-10、IL-17質(zhì)量濃度。

2.4.5流式細(xì)胞儀測定結(jié)腸組織Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例 取結(jié)腸組織，剪成1 mm3的組織塊，置于15 mL離心管中，200目過濾網(wǎng)過濾，以3 000 r·min-1離心5 min，洗滌2次，加裂解液稀釋，加PBS溶液，以3 000 r·min-1離心5 min，洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個·mL-1，將細(xì)胞放置于流式管中，以3 000 r·min-1離心5 min，洗滌，PBS重懸，加破膜固定液，室溫靜置1 h后取熒光抗體加入細(xì)胞懸液，避光孵育(4 ℃，30 min)，以3 000 r·min-1離心5 min，反復(fù)洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例。

2.4.6測定結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群豐度 取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物50 mg，提取DNA，NanoDrop Lite超微量分光光度計檢測質(zhì)量濃度，檢測結(jié)果為一級樣本，滿足建庫要求，選擇腸道菌群16 s區(qū)域V 4區(qū)(基因組)，作為擴增區(qū)域，用KAPA公司Hi Fi PCR試劑盒、熱循環(huán)儀擴增，Bioanalyzer 2100生物分析儀系統(tǒng)建庫，數(shù)據(jù)用Trimmomatic V0.32分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 PCE對T1DM小鼠FPG的影響

5組小鼠FPG水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平均高于對照組(P<0.05)；PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平低于模型組(P<0.05)；PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平低于PCE低劑量組(P<0.05)；PCE高劑量組和二甲雙胍組2組FPG水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PCE對T1DM小鼠FPG的影響

3.2 PCE對T1DM小鼠血清INS及GC的影響

5組小鼠血清GC和INS水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較顯示，模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平均高于對照組，血清INS水平低于對照組(P<0.05)；PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平低于模型組，血清INS水平高于模型組(P<0.05)；PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平低于PCE低劑量組，血清INS水平高于PCE低劑量組(P<0.05)；PCE高劑量組和二甲雙胍組2組血清GC及INS水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PCE對T1DM小鼠血清INS及GC的影響

3.3 PCE對T1DM小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響

對照組小鼠胰腺組織形態(tài)規(guī)則，胰島細(xì)胞大小均勻、排列緊密，細(xì)胞質(zhì)無空泡化；模型組胰腺組織形態(tài)不完整，胰島細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯；PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組胰腺組織損傷程度有不同程度減輕，胰島細(xì)胞排列相對緊密，空泡逐漸減少，其中PCE高劑量組、二甲雙胍組空泡減少更明顯。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.PCE低劑量組；D.PCE高劑量組；E.二甲雙胍組。

3.4 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸組織IL-10和IL-17的影響

5組小鼠結(jié)腸組織IL-10、IL-17質(zhì)量濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組結(jié)腸組織IL-10質(zhì)量濃度低于對照組，IL-17質(zhì)量濃度高于對照組(P<0.05)；PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組結(jié)腸組織IL-10質(zhì)量濃度高于模型組，IL-17質(zhì)量濃度低于模型組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組FPG水平結(jié)腸組織IL-10質(zhì)量濃度高于PCE低劑量組，IL-17質(zhì)量濃度低于PCE低劑量組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組2組結(jié)腸組織IL-10、IL-17質(zhì)量濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸組織IL-10和IL-17的影響

3.5 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的影響

5組小鼠結(jié)腸Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細(xì)胞比例高于對照組，Treg細(xì)胞比例低于對照組(P<0.05)；PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細(xì)胞比例低于模型組，Treg細(xì)胞比例高于模型組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細(xì)胞比例低于PCE低劑量組，Treg細(xì)胞比例高于PCE低劑量組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組2組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的影響

3.6 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

5組小鼠腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科、擬桿菌門比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示，模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例低于對照組，擬桿菌門比例高于對照組(P<0.05)；PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例高于模型組，擬桿菌門比例低于模型組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例高于PCE低劑量組，擬桿菌門比例低于PCE低劑量組(P<0.05)；PCE高劑量組、二甲雙胍組2組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科、擬桿菌門比例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 PCE對T1DM小鼠結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

4 討論

目前認(rèn)為T1DM是免疫代謝紊亂疾病，由于自身免疫系統(tǒng)紊亂、單核淋巴細(xì)胞浸潤胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡、INS分泌嚴(yán)重不足、血糖升高，機體處于高糖水平，破壞正常生理環(huán)境，引發(fā)酮癥酸中毒、急性感染等嚴(yán)重并發(fā)癥[9]。但近年研究認(rèn)為有未知因素觸發(fā)T1DM，不良飲食是觸發(fā)糖尿病的重要因素[10]，而腸道菌群或許是觸發(fā)橋梁[11]，以此為突破點，或可探尋治療新契機。

T1DM治療需注重延緩胰腺組織損傷程度，控制血糖、INS等水平，目前使用藥物雖可有效降低血糖水平，但不容忽視其副作用。

而近年中藥學(xué)快速發(fā)展，臨床發(fā)現(xiàn)多種中藥有效成分可控制糖尿病病情，如青稞多糖[12]和茯苓、丹參[13]等，且來源廣泛，安全性高。其中茯苓作為藥食同源藥材，藥性補而不峻、利而不猛，其提取物包含三萜、多糖及脂肪酸類成分，目前已研究證明[14-15]，茯苓具有抗糖尿病、抗氧化及抗炎等活性。本研究構(gòu)建T1DM小鼠模型后予以不同干預(yù)方式，結(jié)果顯示，PCE低劑量組、PCE高劑量組FPG和血清GC水平有不同程度降低，血清INS水平有所升高，提示PCE能提高INS分泌，減少GC質(zhì)量濃度，相應(yīng)改善機體高血糖狀態(tài)；且本研究發(fā)現(xiàn)，PCE高劑量組小鼠上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于低劑量組，并與二甲雙胍組無明顯差異，說明PCE具有劑量依賴性，高劑量PCE能達到與二甲雙胍相當(dāng)?shù)难钦{(diào)節(jié)效果；本研究進一步通過HE染色結(jié)果證實PCE可減輕小鼠胰腺組織損傷程度，綜合上述結(jié)果分析，PCE中茯苓多糖能促進HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗，發(fā)揮降血糖效果，且三萜類化合物茯苓酸可誘導(dǎo)胰島素樣生長因子1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，延緩小鼠細(xì)胞衰老，激發(fā)胰島細(xì)胞分泌胰島素，發(fā)揮降血糖效用。

通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與T1DM關(guān)系密切，腸道菌群可代謝飲食難以消化的物質(zhì)，代謝產(chǎn)物方可被機體吸收，若腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，可影響腸道穩(wěn)態(tài)[16-18]；而腸道組織相對于其他器官，具有高密度免疫細(xì)胞，而T1DM機體中Treg細(xì)胞可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，延緩T1DM進展，主要依賴IL-10抗炎，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17促炎[19-20]，調(diào)節(jié)免疫炎癥與腸道微生物平衡，二者可共同構(gòu)建腸道屏障，控制T1DM疾病進展。本研究統(tǒng)計與分析免疫炎癥與腸道菌群指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，建模后Treg細(xì)胞比例、結(jié)腸組織IL-10與腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例降低，Th17細(xì)胞比例、結(jié)腸組織IL-17與擬桿菌門比例升高，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，免疫炎癥紊亂，而相應(yīng)干預(yù)后，PCE低劑量組、PCE高劑量組及二甲雙胍組上述指標(biāo)均有所改善，且相較于PCE低劑量組，PCE高劑量組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)及免疫炎癥調(diào)節(jié)水平較佳，可達到與二甲雙胍相似的效果，表明高劑量PCE治療T1DM小鼠，能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)增加有益菌數(shù)量，修復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)平衡，利于腸道免疫細(xì)胞功能恢復(fù)，以增強免疫調(diào)節(jié)，抑制腸道炎癥發(fā)展，從而緩解病情進展。

綜上，PCE可減輕T1DM小鼠胰腺組織損傷、誘導(dǎo)INS釋放和降低血糖水平，可能與PCE調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和改善免疫炎癥狀態(tài)有關(guān)，以此來控制病情進展，降低血糖水平，為臨床藥物研制提供實驗依據(jù)。