蘇吉利，曲丹菊，周 倩，王廣科

1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，洛陽 471003；2.河南省人民醫(yī)院耳鼻喉科，鄭州 450003

分泌性中耳炎(otitis media with effusion，OME)是一種中耳非化膿性炎性疾病，常發(fā)生于兒童，其主要的病理特征是中耳積液和聽力下降[1]。桑白皮總黃酮對高脂血癥合并高尿酸血癥大鼠有腎臟保護作用[2]。臨床研究表明，慢性阻塞性肺病急性加重期用桑白皮可降低患者血清炎癥標志物[3]。自噬是細胞發(fā)生的一種程序性死亡方式，正常情況下，自噬可調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2型分化，發(fā)揮抗炎作用，但是當機體發(fā)生感染或受到外界刺激時，過度的自噬會造成巨噬細胞應(yīng)激性死亡，失去向M2型巨噬細胞分化的功能，加重炎癥反應(yīng)[4]。羅永鋒等[5]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧激活視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬水平，從而促進細胞分泌炎癥因子。UMEYAMA L等[6]研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮通過激活Toll樣受體抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠耳組織炎癥反應(yīng)及耳水腫。本研究通過建立OME大鼠模型，用桑白皮總黃酮灌胃治療探討桑白皮對OME的改善狀況及抑炎作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試藥

桑白皮總黃酮提?。荷０灼し勰?00 g，加乙醚500 mL，攪拌混勻后，浸泡4 h，收集浸液，濾渣中重新加入乙醚500 mL，重復(fù)操作2次，回收乙醚。再在濾渣中加入體積分數(shù)為50%的乙醇600 mL，50 ℃超聲萃取30 min，過濾，再次加入體積分數(shù)為50%的乙醇600 mL超聲萃取，過濾，重復(fù)操作2次，收集所有濾液，95 ℃水浴蒸干，得桑白皮總黃酮，存儲于冰箱中待用。實驗時桑白皮總黃酮中加入數(shù)滴吐溫-80，用生理鹽水調(diào)整至實驗所需質(zhì)量濃度。

卵清蛋白購自北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TUNEL試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司；HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA試劑盒均購自美國ABclonal公司；Beclin1、p62、LC3 Ⅱ和LC3 Ⅰ抗體均購自美國Abcam公司；HRP標記的二抗購自武漢博士德生物公司。

1.3 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠40只，8 周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0001。

2 方法

2.1 造模與分組

OME大鼠模型制備[7]：第1天，按照隨機數(shù)字表法選取30只大鼠，腹腔注射卵清蛋白0.3 mg與氫氧化鋁溶液(1.28 g氫氧化鋁溶于PBS 0.15 mL)，以達全身致敏階段；第7天，用相同的方式和劑量再進行腹腔注射。第14天，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，手術(shù)顯微鏡輔助下，微量進樣器經(jīng)鼓膜將卵清蛋白0.1 mg溶于 PBS 35 μL中注入大鼠中耳腔。第15天，腹腔再次麻醉，耳內(nèi)鏡觀察鼓膜情況，并進行卵清蛋白第二次注射，此階段為耳內(nèi)激發(fā)階段，48 h后，電耳鏡觀察大鼠鼓膜情況，以鼓膜出現(xiàn)凹陷、紅斑、可見液平面及氣泡形成則為造模成功。

將造模成功的26只大鼠隨機分為模型組和治療組，每組13只，另取10只作為正常組。模型制備成功后第2天起，治療組大鼠灌胃桑白皮總黃酮25 mg·kg-1，正常組和模型組大鼠灌胃等劑量生理鹽水，1 日1次，連續(xù)給藥2周。

2.2 檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達

末次給藥結(jié)束后，主動脈采血，室溫靜置30 min，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑8 cm，收集上清液為待測樣品。根據(jù)說明書將對照品稀釋至所需質(zhì)量濃度，酶標板設(shè)置空白孔、標準孔和待測樣品孔，每個標準孔中加入50 μL對照品。待測樣品孔中首先加入樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，空白孔加入50 μL PBS，封板后37 ℃孵育30 min，每孔加入100 μL洗滌液洗滌30 s，重復(fù)5次，拍干板子。除空白孔外，其余孔加入酶標試劑50 μL，封板后37 ℃孵育30 min，洗滌5次，拍干板子，先加入顯色劑A液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min，加入50 μL終止液，在酶標儀上于450 nm波長處測定吸光度(A值)。

2.3 HE染色觀察中耳組織病理學(xué)變化

采血結(jié)束后，頸椎脫臼法處死大鼠，并迅速分離中耳組織，剪取一部分中耳組織置于100 g·L-1多聚甲醛中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切成片厚4 μm的組織切片，60 ℃烘片2 h，脫蠟至水，進行HE染色。伊紅染液染色5 min，蒸餾水沖洗，分化液分化10 min，蘇木素染液染色3 min，蒸餾水沖洗，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡

取石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS浸洗切片5 min，3次；組織上滴加蛋白酶K工作液100 μL，37 ℃搖床中反應(yīng)30 min，PBS清洗5 min，3次；每個組織上滴加TdT酶反應(yīng)液50 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，PBS清洗5 min，3次；滴加TUNEL反應(yīng)混合液50 μL，37 ℃避光反應(yīng)1 h，PBS清洗5 min，3次；避光條件下滴加DAPI染液，室溫反應(yīng)10 min，PBS清洗5 min，3次；滴加熒光封片液，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 蛋白印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白表達量

取部分中耳組織，液氮中研磨，RIPA裂解液裂解30 min，在4 ℃ 以12 000 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，吸取上清液至EP管，BCA試劑盒測蛋白質(zhì)量濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液和RIPA裂解液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度，100 ℃煮沸10 min，使蛋白變性穩(wěn)定。濃縮膠的每孔中加入蛋白樣品20 μL，80 V電泳30 min使蛋白運動至分離膠，120 V電泳1.5 h至分離膠底部，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜5 min，3次；室溫封閉1 h，Beclin1、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和p62、GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜5 min，3次；二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min，3次；ECL法發(fā)光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ELISA檢測結(jié)果

TNF-α、IL-6和IL-1β含量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低(P<0.05)。見表1。

表1 血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較

3.2 HE染色結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠耳黏膜細胞腫脹、黏膜厚度增加、炎癥細胞浸潤、可見多處細胞脫落；與模型組比較，治療組耳黏膜細胞腫脹情況好轉(zhuǎn)，少量黏膜細胞脫落，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

3.3 TUNEL染色結(jié)果

細胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較，模型組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組細胞凋亡率降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組細胞凋亡率比較

注：A.正常組；B.模型組；C.治療組。

3.4 蛋白印跡法檢測結(jié)果

Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較，模型組Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量升高、p62蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量降低、p62蛋白相對表達量升高(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 中耳組織Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白相對表達量比較

注：A.正常組；B.模型組；C.治療組。

4 討論

OME受咽鼓管阻塞和功能障礙、局部感染、免疫功能異常等因素的影響，據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)14歲以下兒童OME的發(fā)病率約為70%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[8]。部分患者具有自愈傾向，但是大多數(shù)患者呈復(fù)發(fā)性病情，延誤治療容易引起聽力損失、中耳粘連、鼓室硬化及鼓室萎縮等并發(fā)癥[9]。

桑白皮其味甘、性寒、歸肺經(jīng)，臨床上常用于治療呼吸系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)感染或糖尿病。桑白皮的主要活性成分是黃酮類，近年由于桑白皮廣泛的藥理學(xué)活性而受到國內(nèi)外學(xué)者對桑白皮的研究。YU JS，LEYVA-JIMéNEZ FJ等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮對脂多糖處理的巨噬細胞及高脂高糖飼養(yǎng)的小鼠均具有抗炎和抗氧化作用。PARK S等[12]研究報道，桑白根皮水浸提液可減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)，緩解大鼠的病理癥狀。周寧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮可改善腎源性水腫大鼠腎功能。由以上研究可推測，桑白皮具有良好的抗炎作用。IL-6、IL-β和TNF-α是常見的炎癥因子，腦缺血大鼠腦組織炎癥反應(yīng)增強，表現(xiàn)為IL-6、IL-β和TNF-α表達升高[14]。研究發(fā)現(xiàn)，愈瘍膠囊可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的中耳炎大鼠炎癥反應(yīng)，降低IL-6、IL-β和TNF-α表達水平[15]。因此，本實驗通過建立OME大鼠，灌胃桑白皮進行治療，結(jié)果顯示，OME大鼠耳黏膜細胞腫脹、黏膜厚度增加、炎癥細胞浸潤，并可見多處細胞脫落；OME大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-β和TNF-α表達升高，TUNEL染色結(jié)果表明，OME大鼠耳黏膜細胞凋亡率升高。桑白皮治療后大鼠耳黏膜細胞腫脹情況好轉(zhuǎn)，少量黏膜細胞脫落，炎癥細胞浸潤減少，血清炎癥因子表達降低，細胞凋亡率降低。結(jié)果表明，桑白皮總黃酮可改善OME大鼠耳黏膜水腫，并抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

自噬是一種依賴于溶酶體的生物降解過程，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)各種應(yīng)激狀態(tài)中具有重要作用。細胞自噬包括3個過程，首先細胞質(zhì)成分(細胞器、蛋白等)被雙層膜囊泡包裹形成自噬泡，自噬泡之間邊緣融合形成自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，將吞噬掉的異常蛋白、損傷的細胞器等進行酶消化[16]。既往研究表明，自噬與炎癥反應(yīng)之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，陸夢茹等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4小干擾RNA可抑制TLR4誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞自噬，減輕自噬引起的腦出血后炎癥損傷。易凱等[18]研究報道，腎小管上皮細胞在高鈣離子環(huán)境中自噬被激活，抑制自噬可降低炎癥因子的分泌。Beclin-1參與前期自噬泡的形成，是自噬啟動階段重要的修飾物，LC3含量與自噬泡形成數(shù)量成正比，貫穿自噬體形成過程，p62是一種多功能基因，在細胞自噬過程中p62被不斷消耗，因此LC3、Beclin-1和p62被廣泛用于檢測細胞自噬[19-20]。本實驗中，OME大鼠中耳組織中Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白相對表達量增多，p62蛋白相對表達量降低，桑白皮治療后Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白相對表達量降低，p62蛋白相對表達量升高。實驗結(jié)果表明，OME大鼠中耳組織上皮細胞自噬水平升高，桑白皮總黃酮可抑制細胞自噬水平。

綜上所述，桑白皮總黃酮可改善OME大鼠中耳組織水腫并減輕炎癥反應(yīng)，其可能是通過抑制細胞自噬發(fā)生調(diào)控作用，為臨床治療OME提供理論依據(jù)。