于庚原，賈姍姍，張童畫，徐浩然，杜小偉，甕學(xué)智，孫毅坤*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2. 北京市藥品檢驗(yàn)研究所，北京 102206；3. 北京市豐臺(tái)區(qū)食品藥品安全監(jiān)測(cè)中心，北京 100071

藏龍蒿(Artemisiawaltonii)為菊科蒿屬植物，藏語中稱為“普爾芒那?！?，其地上部分可治療蟲病、炭疽、疫疽、皮膚病[1]，是常用的藏藥之一。藏龍蒿與同屬其他植物(如茵陳、艾葉等)，在外觀上極為相似，難以鑒別，易被混淆[2-3]。目前，藏龍蒿的相關(guān)研究較少，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍處于空白階段，亟待補(bǔ)充與完善。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，藏龍蒿中含有多種以咖啡?？鼘幩釣榻Y(jié)構(gòu)母核的有機(jī)酸類成分，主要包括新綠原酸(5-咖啡?？鼘幩?、綠原酸(3-咖啡?？鼘幩?、隱綠原酸(4-咖啡酰奎寧酸)、異綠原酸A(3,5-二咖啡酰奎寧酸)、1,5-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸C(4,5-二咖啡?？鼘幩?等，且在同屬其他植物中(如茵陳、艾葉等)其含量存在一定差異。研究發(fā)現(xiàn)，該類有機(jī)酸成分具有抗菌[4-6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、抗病毒[11]、免疫調(diào)節(jié)[7]、保肝[12-13]、抗腫瘤[14-15]、抗紫外線及抗輻射等多種藥理作用[16]。因此，本研究選取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C作為含量測(cè)定指標(biāo)，用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定上述6種有機(jī)酸類成分，以期建立快速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定可靠的含量測(cè)定方法，為藏龍蒿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀(Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2489紫外檢測(cè)器、Empower 3工作站，美國(guó)Waters公司)；CPA225D型十萬分之一天平、SQP型千分之一天平(德國(guó)Sartorius公司)；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品：綠原酸(批號(hào)110753-200413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，異綠原酸A(批號(hào)Z05M10X87215，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，異綠原酸C(批號(hào)Y03S10H95976，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，隱綠原酸(批號(hào)P16A10U95423，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，新綠原酸(批號(hào)P30N10L104575，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，1,5-二咖啡?？鼘幩?批號(hào)P26F9F54633，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；磷酸(分析純，北京化工廠)；水為超純水。藏龍蒿(河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，批號(hào)：2019092102、2019092301、2019092703)由北京市藥品檢驗(yàn)研究院常增榮主任藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

XBridge?C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5 mL·L-1磷酸水(B)，洗脫方式為梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～10 min，5%～10% A；10～15 min，10%～12% A；15～27 min，12%～16% A；27～45 min，16%～28% A；45～63 min，28% A；63～75 min，28%～40% A。流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.07、4.46、0.06、5.40、1.50、0.90 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于5 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取藏龍蒿藥材粗粉約1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇20 mL，稱定質(zhì)量。水浴加熱回流提取90 min，取出放冷，稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。色譜圖見圖1。

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.藏龍蒿供試品溶液；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.異綠原酸A；5.1,5-二咖啡酰奎寧酸；6.異綠原酸C。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照本實(shí)驗(yàn)的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜峰的峰面積，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行線性回歸，得到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 6種化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩帷惥G原酸C的峰面積，計(jì)算各成分的RSD值，結(jié)果分別為1.06%、0.99%、1.10%、0.96%、0.93%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的藏龍蒿藥材6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C的峰面積，計(jì)算各成分的RSD值，結(jié)果分別為0.89%、1.51%、1.75%、1.76%、1.65%、0.77%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸C的峰面積，計(jì)算各成分的RSD值，結(jié)果分別為1.52%、1.34%、1.40%、1.40%、1.48%、1.29%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取6種對(duì)照品適量，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.129 5、10.285 7、0.236 6、10.504 0、2.568 8、1.671 4 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。取已知各成分含量的藏龍蒿藥材粗粉約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入上述對(duì)照品溶液各1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩帷惥G原酸C的峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率，6種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為107.07%、93.95%、102.34%、99.54%、105.48%、101.71%，表明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性良好，見表2。

表2 6種化學(xué)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2(續(xù)) 6種化學(xué)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批次的藏龍蒿藥材，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C的峰面積，按照線性方程計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。6種成分的平均含量分別為0.03%、2.01%、0.05%、2.04%、0.47%、0.31%。

表3 6種成分的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

本研究考察了超聲法和加熱回流法提取方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加熱回流法效果較好，故用加熱回流法作為提取方法。本研究考察了以下實(shí)驗(yàn)條件：甲醇、體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇3種提取溶劑，30、60、90 min 3種提取時(shí)間，1∶10、1∶20、1∶30 3種藥材與溶劑體積比，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用藥材與溶劑體積比為1∶20、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇加熱回流提取90 min效果最佳，故用上述條件作為供試品溶液的制備方法。

本研究參考了部分咖啡?？鼘幩犷惓煞趾繙y(cè)定的色譜條件[17-19]，并在此基礎(chǔ)上考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水、甲醇-甲酸水、甲醇-磷酸水4種流動(dòng)相體系，同時(shí)比較了25 ℃和30 ℃ 2種色譜柱柱溫，發(fā)現(xiàn)以甲醇-磷酸水為流動(dòng)相、柱溫30 ℃時(shí)，色譜峰的分離度及峰形最佳，能夠滿足含量測(cè)定的要求。

通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)咖啡?？鼘幩犷惓煞衷?27 nm波長(zhǎng)附近存在最大吸收，但因具體實(shí)驗(yàn)條件影響，導(dǎo)致在不同研究中所測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)并不相同[20-22]。因此，本研究用配有二極管陣列檢測(cè)器(PDA)的液相色譜系統(tǒng)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以選取最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)6種化合物均在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但考慮到紫外檢測(cè)器的重復(fù)性、基線平穩(wěn)度優(yōu)于PDA檢測(cè)器，故本研究最終選擇配有紫外檢測(cè)器的液相色譜系統(tǒng)在327 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜法建立了藏龍蒿中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C 6種有機(jī)酸類成分的含量測(cè)定方法，該方法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒和參考。未來可以進(jìn)一步對(duì)蒿屬其他植物中有機(jī)酸類成分的含量進(jìn)行研究，揭示藏龍蒿與同屬其他植物有機(jī)酸類含量的差異，對(duì)其含量范圍作出相應(yīng)規(guī)定，以提高藏龍蒿的質(zhì)量及其可控性，更好地發(fā)揮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的本質(zhì)意義。