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        HPLC法同時(shí)測(cè)定藏龍蒿中6種有機(jī)酸類成分的含量

        2022-10-27 05:41:20于庚原賈姍姍張童畫徐浩然杜小偉甕學(xué)智孫毅坤
        西北藥學(xué)雜志 2022年6期

        于庚原,賈姍姍,張童畫,徐浩然,杜小偉,甕學(xué)智,孫毅坤*

        1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488;2. 北京市藥品檢驗(yàn)研究所,北京 102206;3. 北京市豐臺(tái)區(qū)食品藥品安全監(jiān)測(cè)中心,北京 100071

        藏龍蒿(Artemisiawaltonii)為菊科蒿屬植物,藏語中稱為“普爾芒那?!?,其地上部分可治療蟲病、炭疽、疫疽、皮膚病[1],是常用的藏藥之一。藏龍蒿與同屬其他植物(如茵陳、艾葉等),在外觀上極為相似,難以鑒別,易被混淆[2-3]。目前,藏龍蒿的相關(guān)研究較少,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍處于空白階段,亟待補(bǔ)充與完善。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),藏龍蒿中含有多種以咖啡??鼘幩釣榻Y(jié)構(gòu)母核的有機(jī)酸類成分,主要包括新綠原酸(5-咖啡??鼘幩?、綠原酸(3-咖啡??鼘幩?、隱綠原酸(4-咖啡酰奎寧酸)、異綠原酸A(3,5-二咖啡酰奎寧酸)、1,5-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸C(4,5-二咖啡??鼘幩?等,且在同屬其他植物中(如茵陳、艾葉等)其含量存在一定差異。研究發(fā)現(xiàn),該類有機(jī)酸成分具有抗菌[4-6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、抗病毒[11]、免疫調(diào)節(jié)[7]、保肝[12-13]、抗腫瘤[14-15]、抗紫外線及抗輻射等多種藥理作用[16]。因此,本研究選取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C作為含量測(cè)定指標(biāo),用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定上述6種有機(jī)酸類成分,以期建立快速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定可靠的含量測(cè)定方法,為藏龍蒿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒和參考。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Waters 1525型高效液相色譜儀(Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2489紫外檢測(cè)器、Empower 3工作站,美國(guó)Waters公司);CPA225D型十萬分之一天平、SQP型千分之一天平(德國(guó)Sartorius公司);Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

        1.2 試藥

        對(duì)照品:綠原酸(批號(hào)110753-200413,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%,中國(guó)食品藥品檢定研究院),異綠原酸A(批號(hào)Z05M10X87215,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),異綠原酸C(批號(hào)Y03S10H95976,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),隱綠原酸(批號(hào)P16A10U95423,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),新綠原酸(批號(hào)P30N10L104575,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),1,5-二咖啡??鼘幩?批號(hào)P26F9F54633,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);磷酸(分析純,北京化工廠);水為超純水。藏龍蒿(河北安國(guó)藥材市場(chǎng),批號(hào):2019092102、2019092301、2019092703)由北京市藥品檢驗(yàn)研究院常增榮主任藥師鑒定。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        XBridge?C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5 mL·L-1磷酸水(B),洗脫方式為梯度洗脫:0~5 min,5% A;5~10 min,5%~10% A;10~15 min,10%~12% A;15~27 min,12%~16% A;27~45 min,16%~28% A;45~63 min,28% A;63~75 min,28%~40% A。流速為1.0 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;進(jìn)樣量為5 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C對(duì)照品適量,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度分別為0.07、4.46、0.06、5.40、1.50、0.90 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液,4 ℃保存?zhèn)溆?。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL,置于5 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2供試品溶液的制備 取藏龍蒿藥材粗粉約1 g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇20 mL,稱定質(zhì)量。水浴加熱回流提取90 min,取出放冷,稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,0.45 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。色譜圖見圖1。

        注:A.混合對(duì)照品溶液;B.藏龍蒿供試品溶液;1.新綠原酸;2.綠原酸;3.隱綠原酸;4.異綠原酸A;5.1,5-二咖啡酰奎寧酸;6.異綠原酸C。

        2.3 方法學(xué)考察

        2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,稀釋得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照本實(shí)驗(yàn)的色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰的峰面積,以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行線性回歸,得到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程,結(jié)果見表1。

        表1 6種化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍

        2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,分別記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩帷惥G原酸C的峰面積,計(jì)算各成分的RSD值,結(jié)果分別為1.06%、0.99%、1.10%、0.96%、0.93%、0.94%,表明儀器精密度良好。

        2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的藏龍蒿藥材6份,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C的峰面積,計(jì)算各成分的RSD值,結(jié)果分別為0.89%、1.51%、1.75%、1.76%、1.65%、0.77%,表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

        2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液,分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸C的峰面積,計(jì)算各成分的RSD值,結(jié)果分別為1.52%、1.34%、1.40%、1.40%、1.48%、1.29%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取6種對(duì)照品適量,分別置于5 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為0.129 5、10.285 7、0.236 6、10.504 0、2.568 8、1.671 4 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,備用。取已知各成分含量的藏龍蒿藥材粗粉約0.5 g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入上述對(duì)照品溶液各1 mL,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩帷惥G原酸C的峰面積,計(jì)算各成分的加樣回收率,6種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為107.07%、93.95%、102.34%、99.54%、105.48%、101.71%,表明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性良好,見表2。

        表2 6種化學(xué)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

        表2(續(xù)) 6種化學(xué)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

        2.4 樣品含量測(cè)定

        取不同批次的藏龍蒿藥材,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C的峰面積,按照線性方程計(jì)算各成分的含量,結(jié)果見表3。6種成分的平均含量分別為0.03%、2.01%、0.05%、2.04%、0.47%、0.31%。

        表3 6種成分的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

        3 討論

        本研究考察了超聲法和加熱回流法提取方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加熱回流法效果較好,故用加熱回流法作為提取方法。本研究考察了以下實(shí)驗(yàn)條件:甲醇、體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇3種提取溶劑,30、60、90 min 3種提取時(shí)間,1∶10、1∶20、1∶30 3種藥材與溶劑體積比,通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用藥材與溶劑體積比為1∶20、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇加熱回流提取90 min效果最佳,故用上述條件作為供試品溶液的制備方法。

        本研究參考了部分咖啡??鼘幩犷惓煞趾繙y(cè)定的色譜條件[17-19],并在此基礎(chǔ)上考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水、甲醇-甲酸水、甲醇-磷酸水4種流動(dòng)相體系,同時(shí)比較了25 ℃和30 ℃ 2種色譜柱柱溫,發(fā)現(xiàn)以甲醇-磷酸水為流動(dòng)相、柱溫30 ℃時(shí),色譜峰的分離度及峰形最佳,能夠滿足含量測(cè)定的要求。

        通過查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)咖啡??鼘幩犷惓煞衷?27 nm波長(zhǎng)附近存在最大吸收,但因具體實(shí)驗(yàn)條件影響,導(dǎo)致在不同研究中所測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)并不相同[20-22]。因此,本研究用配有二極管陣列檢測(cè)器(PDA)的液相色譜系統(tǒng)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,以選取最佳檢測(cè)波長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)6種化合物均在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,但考慮到紫外檢測(cè)器的重復(fù)性、基線平穩(wěn)度優(yōu)于PDA檢測(cè)器,故本研究最終選擇配有紫外檢測(cè)器的液相色譜系統(tǒng)在327 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜法建立了藏龍蒿中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、1,5-二咖啡??鼘幩?、異綠原酸C 6種有機(jī)酸類成分的含量測(cè)定方法,該方法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠,可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒和參考。未來可以進(jìn)一步對(duì)蒿屬其他植物中有機(jī)酸類成分的含量進(jìn)行研究,揭示藏龍蒿與同屬其他植物有機(jī)酸類含量的差異,對(duì)其含量范圍作出相應(yīng)規(guī)定,以提高藏龍蒿的質(zhì)量及其可控性,更好地發(fā)揮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的本質(zhì)意義。

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