黃 潮，劉 婷

（萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，江西萍鄉(xiāng) 337000）

糕點(diǎn)的主要原料有谷類(lèi)、薯類(lèi)、豆類(lèi)、糖、蛋和油脂等，經(jīng)過(guò)一系列調(diào)制、烹制，這些原料最終成為美味的食物。為了獲得更好的口感，人們?cè)谑熘聘恻c(diǎn)前后還經(jīng)常向糕點(diǎn)中添加果醬、牛奶、可可與奶油等材料。

脫氫乙酸是當(dāng)下較為常見(jiàn)的一種食品防霉防腐保鮮劑。目前，該材料的安全性已經(jīng)被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織認(rèn)可。這種物質(zhì)能夠在水溶液中逐步降解，且在這一過(guò)程中產(chǎn)生抑制與延緩肝癌的作用。即便是人體皮膚長(zhǎng)期接觸這一物質(zhì)，也不會(huì)產(chǎn)生損傷。在實(shí)際應(yīng)用中，這一物質(zhì)并不會(huì)影響食物的口感，因此該物質(zhì)常常被應(yīng)用到糕點(diǎn)制作中[1]。脫氫乙酸以固態(tài)形式最為常見(jiàn)，呈無(wú)色結(jié)晶或淡黃色粉末，是一種低毒、高效的防腐、防霉劑。在酸、堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對(duì)霉菌的抑制作用最強(qiáng)，其化學(xué)名稱為3-乙?；?6-甲基-脫(2),4-脫(3)氫二酮，分子式為C8H8O4。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定糕點(diǎn)的脫氫乙酸最大使用量為0.5 g·kg-1（以脫氫乙酸計(jì)）。新國(guó)標(biāo)GB 5009.121—2016中指出應(yīng)用于食品領(lǐng)域的脫氫乙酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)于2017年3月1日代替《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB/T 5009.121—2003）規(guī)定脫氫乙酸檢測(cè)方法第一法為氣相色譜法，第二法為液相色譜法。本文采用第二法高效液相法測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量，利用氫氧化鈉溶液將試樣內(nèi)所含的脫氫乙酸提取出來(lái)，并采用脫脂與去蛋白的處理措施，過(guò)膜后借助紫外或二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀加以測(cè)定，根據(jù)色譜峰的留存時(shí)長(zhǎng)來(lái)定性，運(yùn)用外標(biāo)法來(lái)進(jìn)行定量。

由于脫氫乙酸的使用廣泛，檢測(cè)過(guò)程中遇到的問(wèn)題也越來(lái)越多。如果檢測(cè)結(jié)果接近國(guó)家規(guī)定限量值，會(huì)對(duì)判斷樣品的合格性帶來(lái)困擾。在這種狀況下，明確檢測(cè)結(jié)果的不確定度非常關(guān)鍵。不確定度是一種直接與測(cè)量結(jié)果相關(guān)的參數(shù)，能夠呈現(xiàn)出被測(cè)出量值的分散度。依據(jù)《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià) 檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》（RB/T 214—2017）內(nèi)的相關(guān)內(nèi)容可知，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)該構(gòu)建起數(shù)學(xué)模型，并給出與其自身檢驗(yàn)檢測(cè)能力相對(duì)等的評(píng)定測(cè)量不確定度案例[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市面上銷(xiāo)售的包裝寫(xiě)有脫氫乙酸的糕點(diǎn)12份，樣品編號(hào)為1—12；甲醇（CH4O），色譜純；乙酸銨（C2H6O2N），優(yōu)級(jí)純；氫氧化鈉（NaOH），分析純；正己烷（C6H14），分析純；甲酸（CH2O2），分析純；硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；分析天平（感量為0.1 mg和1 mg）；粉碎機(jī)；不銹鋼高速均質(zhì)器；超聲波清洗器（功率35 kW）；渦旋混合器；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速＞4 000 r·min-1）；pH計(jì)；C18固相萃取柱：500 mg，6 mL（使用前用5 mL甲醇、10 mL水活化，使柱子保持濕潤(rùn)狀態(tài)）。

1.3 檢測(cè)方法[3]

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量。樣品參照第二法液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[3]。

1.3.1 樣品制備

糕點(diǎn)用粉碎機(jī)制成粉末。

1.3.2 脫氫乙酸提取

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）第二法液相色譜法12.1.3面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料、復(fù)合調(diào)味料測(cè)定，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）脫氫乙酸（1.0 mg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品精密（精確至0.000 1 g）稱取0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用10 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解，用水定容。4 ℃保存，3個(gè)月有效。

（2）脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成濃度分別為 1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和 100.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存，1個(gè)月有效。

1.4 數(shù)學(xué)模型

脫氫乙酸含量的計(jì)算公式為

式中：x為試樣中脫氫乙酸的含量，g·kg-1；v為最終定容的體積，mL；c1為試樣溶液內(nèi)含脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；c0為空白試樣內(nèi)含脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；m為樣品質(zhì)量，g；f為過(guò)固相萃取柱換算系數(shù)（f=0.5）。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值標(biāo)識(shí)，計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析不確定度的來(lái)源

通過(guò)測(cè)量及建模分析可知，對(duì)脫氫乙酸含量測(cè)定的不確定度產(chǎn)生影響的因素主要有以下幾個(gè)方面[4]。①前期對(duì)影響因子進(jìn)行處理時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(f),如測(cè)量過(guò)程中儀器自身的不穩(wěn)定性、前期處理時(shí)或其他方面產(chǎn)生的影響。②實(shí)驗(yàn)人員標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c)，這是標(biāo)準(zhǔn)曲線的非線性造成的結(jié)果。③體積方面產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(v)。該方面主要包括量具本身的誤差、溫濕度與人員等方面的影響。④質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(m)。這一方面主要是由操作人員及天平在測(cè)量質(zhì)量的過(guò)程中造成的結(jié)果。⑤重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(R)。

2.2 計(jì)算不確定度分量

2.2.1 樣品稀釋移取過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(f)

（1）器具校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(f1)。25 mL B級(jí)容量瓶定容，該器具的允差應(yīng)控制在0.06 mL內(nèi)；10 mL A級(jí)單線移液管，該器具的允差應(yīng)控制在0.02 mL內(nèi)，由此可知因量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）樣品稀釋移取過(guò)程中人員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(f2)。實(shí)驗(yàn)移取過(guò)程中，按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當(dāng)實(shí)驗(yàn)操作員讀數(shù)允許約1%的不準(zhǔn)確性（即0.01v），那么每次相對(duì)不確定度為人員讀數(shù)使用玻璃量器兩次，由實(shí)驗(yàn)員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因此樣品稀釋移取過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c1)。根據(jù)查閱脫氫乙酸批號(hào)為7700800證書(shū)，脫氫乙酸不確定度為0.5%，按照矩形分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c2)。查閱電子天平檢定證書(shū)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）規(guī)定，稱取0.100 0 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的允差應(yīng)在0.000 5 g內(nèi)，考慮均勻分布：天平的重復(fù)性誤差應(yīng)控制在0.000 1 g內(nèi)5.77×10-5g，稱量而產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c2)=因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）工作曲線配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c3)

工作曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程根據(jù)表1玻璃量器的不確定度[5]均勻分布計(jì)算，移液器不確定度按照正態(tài)分布計(jì)算，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表1 玻璃量器引入的不確定度

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中人員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c4)。按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當(dāng)實(shí)驗(yàn)操作員讀數(shù)允許約1%的不準(zhǔn)確性（即0.01v），那么每次相對(duì)不確定度為共讀數(shù)6次，因此其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于上述標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的4個(gè)不確定度是單獨(dú)存在的，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(P)。以脫氫乙酸濃度（cμg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線=3.182 692×104×c-6.147 225×104，R2=0.999 7。對(duì)樣品重復(fù)測(cè)量?jī)纱危瑴y(cè)得脫氫乙酸的濃度為cx=20.33 μg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相關(guān)數(shù)據(jù)

代入上述數(shù)值，得u(P)=1.66。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(P)=0.012。

（6）樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(a)。依據(jù)質(zhì)管科waters高效液相色譜儀的近期檢定證書(shū)可知，其定量重復(fù)性是0.3%，依照三角分布可知，不確定度是由于ur(c)，ur(a)，ur(P)分別為各自不相關(guān)的量，因此由標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(m)

稱取樣品5.017 8 g，天平最大允差為0 g，天平重復(fù)性誤差為0 g，其不確定度分別為稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(m)=則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(m)=

2.2.4 定容體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(v)

樣品經(jīng)提取凈化后，用1 mL移液器取1 mL流動(dòng)相定容。

（1）定容量器引入的不確定度。1 mL移液器的最大允差為0.002 mL，按均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確度為

（2）定容量器讀數(shù)引入的不確定度。由上可知，由實(shí)驗(yàn)操作員定容產(chǎn)生的u(v2)=0.004 08 mL，因此相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(R)

（1）重現(xiàn)性的不確定度。對(duì)樣品進(jìn)行10次平行樣的重復(fù)上機(jī)測(cè)試，測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 糕點(diǎn)中脫氫乙酸含量測(cè)定值

測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)不確定度為

因此，由重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.24/256.5=0.004 8

（2）回收率的不確定度。樣品采取10次平行樣加標(biāo)回收測(cè)試，回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 樣品中脫氫乙酸甲標(biāo)回收率（單位：%）

由表4可知，其平均加標(biāo)回收率為86.03%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%。因此，回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是0.30/86.03=0.003 5。

因此，重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴(kuò)展

2.3.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表

將表5中各不確定度合成為

2.3.2 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

脫氫乙酸含量為256.5 mg·kg-1，則測(cè)量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc(x)=256.5×0.009 5=2.436 75 mg·kg-1。擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，包含因子k=2，可知糕點(diǎn)中脫氫乙酸測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為U=u（x）×k=4.873 5 mg·kg-1。

2.3.3 測(cè)量不確定度報(bào)告

樣品中脫氫乙酸含量的測(cè)定結(jié)果為（256.5±4.873 5）mg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本研究參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量，樣品參照第二法液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù)由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的《測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)與表示》（JJF 1059.1—2012），綜合檢驗(yàn)的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)與構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型，借助waters高效液相色譜儀對(duì)糕點(diǎn)中脫氫乙酸的結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，對(duì)不確定影響因素展開(kāi)研究，針對(duì)測(cè)量過(guò)程中多項(xiàng)影響因素帶來(lái)的不確定度展開(kāi)分析與評(píng)價(jià)。在本次研究中涉及的影響因素包括實(shí)驗(yàn)環(huán)境、常用器皿、人員操作、儀器的穩(wěn)定性與精密度等。其中，儀器不穩(wěn)定、前處理和其他因素影響以及稱量過(guò)程中人員和天平是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的主要方面。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品配制中的準(zhǔn)確性提出更高的要求，質(zhì)管科應(yīng)定期檢定儀器與設(shè)備的精密程度與穩(wěn)定性，以季度為周期核查好相關(guān)內(nèi)容，使儀器能滿足實(shí)驗(yàn)需要。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的一致性，在日常檢驗(yàn)過(guò)程中重視實(shí)驗(yàn)人員的操作能力與操作的規(guī)范性，降低人為操作不佳帶來(lái)的不利影響，從而使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。