方正圓，謝佩耘，郭云,，韓勖，何躍軍

(1.貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州民族大學 生態(tài)環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550025)

由碳酸鹽巖發(fā)育形成的喀斯特生態(tài)系統(tǒng)在我國南方廣泛分布[1]。碳酸鹽巖主要化學成分是碳酸鈣，碳酸鈣離解后形成高濃度的Ca2+導致土壤鈣含量高，形成鈣質(zhì)土壤[2]。研究發(fā)現(xiàn)高濃度鈣能增加土壤磷的固定，但降低磷有效性[3]。因此，土壤碳酸鈣含量的高低可能影響土壤團聚體機械組成并進一步影響植物生長。有研究發(fā)現(xiàn)碳酸鈣離解后形成的碳酸氫根離子可被植物根系吸收轉(zhuǎn)運并存儲至植物葉片細胞補償植物的光合碳[4-6]，這一過程可能由土壤微生物介導完成。叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae,AM)真菌是自然界普遍存在的一種功能微生物，可與近85%的植物根系形成菌根共生體[7]。AM真菌在調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[8]，如AM能吸收各種簡單形態(tài)的氮[9]，分解有機物促進養(yǎng)分釋放[10]，增加植物根系分泌的磷酸酶增進土壤磷的有效性[11]，并通過菌絲體吸收土壤有效磷影響植物生長發(fā)育[12]。這一過程主要通過AM菌絲體在土壤根際共生界面完成。

根際(rhizosphere)是指植物根系周圍與土界面不足一毫米至幾毫米的微區(qū)土壤范圍[13]，超過此范圍應視為非根際(non-rhizosphere)土壤。根際土壤養(yǎng)分是最能被植物根系吸收利用的，受植物根系活動影響，根際土壤與非根際土壤理化性質(zhì)如磷酸酶活性具有明顯差異[14]。已有研究者對根際和非根際土壤開展過一些研究工作，主要集中在根際與非根際土壤養(yǎng)分、土壤理化性質(zhì)、微生物多樣性差異研究[15-21]。土壤團聚體是土壤質(zhì)量評價的重要指標之一，養(yǎng)分在不同團聚體的含量存在顯著差異[22]。AM共生體主要是AM真菌通過菌絲體侵染根系皮層細胞后形成，根系外延菌絲體往往超過根際土壤范圍，并將遠距離的非根際土壤養(yǎng)分吸收轉(zhuǎn)移供給宿主植物利用，在非根際土壤中代替植物根的功能[23]。因此，非根際土壤質(zhì)量對AM菌絲體促進宿主植物養(yǎng)分利用也可能產(chǎn)生重要影響，特別是退化貧瘠的土壤中植物根系外延AM菌絲體更加可能扮演著重要角色。

高鈣的喀斯特土壤中，AM真菌是如何通過根系外延菌絲體與碳酸鈣交互作用影響非根際土壤團聚體養(yǎng)分變化的問題尚不清楚。研究這一問題將有助于深入探索高鈣喀斯特生境中AM真菌對植物生長和土壤的功能機制，并可為喀斯特地區(qū)采用叢枝菌根技術(shù)改良土壤、促進植被修復提供理論依據(jù)。因此，本研究通過2個連體隔室(根際土壤隔室和非根際土壤隔室)組成的裝置，對根際土壤隔室進行接種叢枝菌根真菌處理，對非根際土壤隔室進行施加以及不施加碳酸鈣處理，最終將收獲的非根際土壤隔室的土壤分為<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm共4個土壤粒徑進行研究分析，以期為喀斯特地區(qū)AM真菌的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

為研究AM菌絲體和碳酸鈣對非根際土壤養(yǎng)分和植物生長的影響，本研究設(shè)計根際隔室(rhizosphere soil compartment，R)和非根際隔室(non-rhizosphere soil compartment，N)連體組成的微生態(tài)系(Microcosm)。R隔室和N隔室間用厚度1 mm的隔板隔離兩側(cè)土壤，隔板兩側(cè)用孔徑為20 μm或0.45 μm尼龍網(wǎng)張附，隔板兩側(cè)形成1 mm的空氣隔層(Air gap)。R隔室中種植樟樹(Cirtnamomumcamphora)幼苗，并接種AM真菌幼套球囊霉(Glomusetunicatum)，N隔室土壤中施加4 g碳酸鈣粉末。每個隔室由聚乙烯材料制成(長×寬×高 = 110 mm×110 mm×118 mm)，隔板沿對角線鉆5個直徑10 mm的圓孔，中心孔與其余4個孔間距為30 mm。隔室底部開鑿6個0.5 cm直徑的圓孔防止土壤積水。

1.2 試驗處理

試驗采用AM菌絲體處理和施加外源碳酸鈣處理。M+處理：在R隔室和N隔室之間用20 μm尼龍網(wǎng)，菌絲體可從R隔室穿透尼龍網(wǎng)向N隔室內(nèi)生長，但阻隔R中植物根系的生長；M-處理：在R隔室和N隔室之間用0.45 μm尼龍網(wǎng)隔離，用以阻隔R中的菌絲體和根系向N中生長。C+處理：在N隔室中施加外源碳酸鈣粉末；C-處理：在N隔室中不施加外源碳酸鈣粉末。實驗開始前，每個R隔室中先放入1 100 g滅菌土壤基質(zhì)(石灰土+河沙按3︰1比例混勻，基質(zhì)理化性質(zhì)為：pH值6.92，全氮2 160 mg/kg，堿解氮137.43 mg/kg，全磷170 mg/kg，和有效磷19.58 mg/kg；石灰土采集于貴陽市花溪區(qū)典型喀斯特地段)，再放入50 g 幼套球囊霉菌劑(菌種購于北京農(nóng)林科學院營養(yǎng)資源研究所，BGA0046，用三葉草(Trifoliumrepens)在石灰土基質(zhì)上擴繁4個月后，收獲土壤基質(zhì)作為菌劑，孢子密度≥10個/g)，播入6粒樟樹種子(種子采集于貴陽市花溪區(qū)典型喀斯特地段，低溫保存1個月后用0.1%高錳酸鉀溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次)，再添加350 g滅菌基質(zhì)覆蓋表層。N隔室中直接放入1 450 g滅菌土壤基質(zhì)。處理完畢后澆足水分放置在貴州大學南校區(qū)溫室大棚中培養(yǎng)1個月，樟樹苗木出土后間苗，每個R隔室留3株生長一致的幼苗，苗木生長5周后在每個N隔室放入4 g的CaCO3粉末，碳酸鈣處理8周后收獲所有N隔室土壤，經(jīng)自然風干后過篩分成<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm共4個粒徑土樣裝入錫箔紙，并進行指標測定。

圖1 試驗設(shè)計示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental design

1.3 指標測定與數(shù)據(jù)分析

N含量測定采用凱氏定氮法[24](用瑞士BüCHI公司生產(chǎn)的Distillation Unit B-324全自動凱氏定氮儀測定)；P素測定采用鉬銻抗比色法[25]。采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，通過Three-way ANOVAs三因素方差分析非根際土壤中不同土壤粒徑(<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm)、AM菌絲體(M+，M-)和碳酸鈣(C+，C-)及他們的交互作用對土壤氮磷養(yǎng)分的影響，并用Origin 2018完成制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 非根際土壤AM菌絲體和碳酸鈣對不同粒徑土壤團聚體全氮含量的影響

如表1所示，AM菌絲體、碳酸鈣和土壤粒徑對非根際土壤全氮含量均具有極顯著影響(P<0.01)；菌絲體×粒徑、碳酸鈣×粒徑的交互作用對土壤全氮含量具有極顯著影響(P<0.01)，菌絲體×碳酸鈣以及菌絲體×碳酸鈣×粒徑的交互作用對土壤全氮沒有顯著影響。

表1 非根際土壤菌絲體和碳酸鈣以及土壤粒徑對土壤全氮含量影響的三因素方差分析Tab.1 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the total nitrogen

圖2 非根際土壤中不同粒徑土壤全氮含量(平均值±標準誤)Fig.2 The total nitrogen(TN)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

如圖2所示，比較C+與C-處理間差異，在粒徑<0.25 mm土壤全氮含量均表現(xiàn)為C+顯著高于C-處理；同樣，在>2.00 mm的土壤中全氮含量表現(xiàn)為C+極顯著高于C-處理；但在0.25～1.00 mm和1.00～2.00 mm粒徑土壤中C+與C-處理之間沒有顯著差異。

比較M+與M-處理間差異，在<0.20 mm和>2.00 mm土壤中全氮含量無論是C+還是C-中均表現(xiàn)為M+顯著高于M-處理；0.25～1.00 mm粒徑土壤中無論C+或是C-處理下，M+處理均高于M-處理，但差異不顯著；1.00～2.00 mm粒徑中M+與M-差異均不顯著。

以上結(jié)果表明非根際土壤隔室中的AM菌絲體和施加的外源碳酸鈣對土壤全氮含量產(chǎn)生影響，主要的影響為提高<0.25 mm和>2.00 mm土壤全氮含量，對中粒徑土壤則影響不顯著。

2.2 非根際土壤AM菌絲體和碳酸鈣對不同粒徑土壤堿解氮含量的影響

如表2所示，AM菌絲體對堿解氮含量沒有顯著影響(P>0.05)，而施加碳酸鈣處理顯著影響了堿解氮含量(P=0.027)，菌絲體×碳酸鈣、菌絲體×粒徑、碳酸鈣×粒徑以及菌絲體×碳酸鈣×粒徑交互作用對非根際土壤的堿解氮含量均沒有顯著影響。

表2 非根際土壤菌絲體和碳酸鈣以及土壤粒徑對土壤堿解氮含量影響的三因素方差分析Tab.2 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the alkaline nitrogen

圖3 非根際土壤中不同粒徑土壤堿解氮含量(平均值±標準誤)Fig.3 The alkaline nitrogen(AN)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

如圖3所示，比較C+與C-處理間差異，在土壤粒徑>2.00 mm的M+與M-處理中，土壤堿解氮含量C+顯著高于C-處理，其余處理差異不顯著；比較M+與M-處理，無論C+還是C-處理，M+與M-之間的土壤堿解氮差異均不顯著。該結(jié)果表明非根際土壤中碳酸鈣能夠顯著提高較大粒徑土壤中堿解氮的含量，但菌絲體對土壤堿解氮的效應不明顯。

2.3 非根際土壤AM菌絲體和碳酸鈣對不同粒徑土壤全磷含量的影響

如表3所示，土壤粒徑對全磷含量具有極顯著影響(P<0.001)，菌絲體和碳酸鈣處理對全磷含量沒有顯著影響，僅有菌絲體×粒徑交互作用對土壤全磷含量具有顯著影響，其余交互作用無顯著效應。

如圖4所示，比較C+與C-處理間差異，僅有>2.00 mm的M-處理下C+顯著低于C-，M+處理下C+也略低于C-，但差異不顯著，其余M+與M-處理的C+與C-處理全磷含量差異也均不顯著；比較M+與M-處理差異，在>2.00 mm的C-處理下M+顯著高于M-，其余粒徑無論是C+還是C-處理下的M+與M-差異均不顯著。

表3 非根際土壤菌絲體和碳酸鈣以及土壤粒徑對土壤全磷含量影響的三因素方差分析Tab.3 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the total phosphorus

圖4 非根際土壤中不同粒徑土壤全磷含量(平均值±標準誤)Fig.4 The total phosphorus(TP)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

2.4 非根際土壤AM菌絲體和碳酸鈣對不同粒徑土壤有效磷含量的影響

如表4所示，AM菌絲體顯著影響非根際土壤的有效磷含量(P=0.002)，土壤粒徑對非根際土壤的有效磷含量有極顯著影響(P<0.001)。交互作用菌絲體×碳酸鈣、碳酸鈣×粒徑以及菌絲體×碳酸鈣×粒徑對非根際土壤的有效磷含量影響不顯著；菌絲體×粒徑則對有效磷含量具有顯著影響(P<0.05)。

如圖5所示，比較C+與C-處理間有效磷含量的差異，無論M+還是M-中的C+與C-處理之間土壤有效磷含量均無顯著差異；比較M+與M-，在>2 mm粒徑土壤的C+和C-中，M+處理的有效磷含量顯著高于M-處理，其余條件土壤的M+與M-之間有效磷含量差異均不顯著。該結(jié)果表明，非根際土壤中AM菌絲體對較大粒徑如>2 mm土壤的有效磷含量具有調(diào)節(jié)作用。

表4 非根際土壤菌絲體和碳酸鈣以及土壤粒徑對土壤有效磷含量影響的三因素方差分析Tab.4 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the available phosphorus

圖5 非根際土壤中不同粒徑土壤有效磷含量(平均值±標準誤)Fig.5 The available phosphorus(AP)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

根際是附著于植物根系表面和根系周圍的微域環(huán)境，對植物的生長活動起到至關(guān)重要的作用[26]。叢枝菌根共生影響根際土壤微生物及生物酶的分泌，并通過AM菌絲改變根際土壤性狀[27]，同時生物酶的分泌可促進根際養(yǎng)分元素轉(zhuǎn)化并調(diào)節(jié)改良根際土壤[28]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)AM菌絲體顯著提高小粒徑(<0.25 mm)與大粒徑(>2.00 mm)的土壤團聚體全氮含量。研究發(fā)現(xiàn)AM菌絲體所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物球囊霉素相關(guān)蛋白(Glomalin related soil protein，GRSP)與土壤全氮極顯著正相關(guān)，是土壤氮的重要來源[29]。因此，非根際土壤中AM菌絲體提高團聚體氮含量可能與其產(chǎn)生的GRSP有關(guān)。這也說明非根際土壤中的AM菌絲體對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程有重要調(diào)節(jié)功能。

由于喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中碳酸鹽巖的主要成分是碳酸鈣，離解后可形成高濃度的Ca2+，同時也有研究表明高濃度的Ca2+可使AM菌絲頂端鈣離子梯度增加，促進AM菌絲的極性生長[30]。李少朋等[31]向AM真菌接種的土壤中施加外源鈣后，土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，非根際土壤中AM菌絲體和碳酸鈣共同作用下提高土壤氮含量和磷含量是在較小粒徑(<0.25 mm)和較大粒徑(>2.00 mm)條件下。這與郭雪姣等[32]研究發(fā)現(xiàn)土壤氮主要分布在土壤較大和較小粒徑中結(jié)果一致。土壤外源碳酸鈣添加，碳酸鈣離解后形成的鈣離子與有機碳可結(jié)合形成穩(wěn)定的鈣鍵復合體[33]。因此，本研究增加的外源碳酸鈣在AM菌絲體作用也可能促進土壤鈣鍵復合體形成，并改變土壤團粒結(jié)構(gòu)。一方面，AM菌絲在土壤中的周轉(zhuǎn)速率大約5～6 d[34]，AM菌絲體在2～3周后自溶釋放出無機養(yǎng)分[35]，小粒徑團聚體中附著更多的菌絲體自溶氮，且小粒徑團聚體具有更小的比表面積，吸附能力較強[36]。因此，小粒徑團聚體具有較大的土壤顆粒比表面積進而導致更大的養(yǎng)分含量。另一方面，大粒徑土壤團聚體是由微團聚體在有機質(zhì)及真菌菌絲體等的膠結(jié)作用下形成[37]；即便其土壤顆粒比表面積較小，但碳酸鈣的添加形成穩(wěn)定的鈣鍵復合體可增加土壤的膠黏性[38]，而AM菌絲體纏繞或由于其代謝產(chǎn)物的膠結(jié)作用也可導致較大粒徑團聚體形成[39]，進一步地通過菌絲體自溶作用釋放養(yǎng)分提高了大粒徑團聚體氮含量。有研究表明，適量添加碳酸鈣可改變土壤氮素的循環(huán)過程[40]，本研究結(jié)果也顯示，碳酸鈣對土壤氮具有顯著影響。雖然本研究發(fā)現(xiàn)AM菌絲體和外源碳酸鈣添加可促進較大和較小粒徑土壤團聚體養(yǎng)分含量，但其作用機制仍需進一步深入探索。因此，通過同位素示蹤并結(jié)合分子生物學技術(shù)，研究AM菌絲體與碳酸鈣互作調(diào)控影響根際與非根際土壤團聚體形成與養(yǎng)分變化過程及其作用機制是未來值得探索的研究方向。

3.2 結(jié)論

AM菌絲體能夠顯著影響非根際土壤全氮和有效磷含量，外源碳酸鈣增加顯著影響全氮和堿解氮含量，不同粒徑團聚體大小對全氮、全磷和有效磷具有顯著影響。AM菌絲體與土壤團聚體粒徑交互影響土壤全氮、全磷和有效磷含量，而碳酸鈣添加與粒徑的交互作用僅顯著影響土壤全氮含量。非根際土壤中AM菌絲體和碳酸鈣互作能改善提高較大粒徑和較小粒徑土壤團聚體氮、磷含量。