王盼，牟榮，鄢必新，王婷婷，李敏，秦思蓮，徐云*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標準化關(guān)鍵工程技術(shù)重點實驗室，長春 130103；2.吉林省藥品審評中心,長春 130000；3.修正藥業(yè)集團股份有限公司，通化 134002）

隨著2020年《國家藥監(jiān)局關(guān)于促進中藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的的實施意見》、《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息考證原則》、《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7首方劑）》的公布及2021年《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）的頒布。經(jīng)典名方政策的落地，給經(jīng)典名方研究指明了方向。枳實薤白桂枝湯是2018年國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》的經(jīng)典名方之一，在與古籍記錄一致的前提下，結(jié)合現(xiàn)代研究手段對原方中未明確的參數(shù)進行考察，為后續(xù)顆粒劑研究提供參考依據(jù)。

枳實薤白桂枝湯，來源于漢·張仲景《金匱要略》[1]，由枳實、厚樸、薤白、桂枝、瓜蔞，共5味中藥組成，主治胸陽不振、痰濁阻滯的胸痹。用于冠心病、心絞痛、肋間神經(jīng)痛、非化膿性肋軟骨炎等癥。原書記載的煎煮工藝為枳實四枚、厚樸四兩、薤白半斤、桂枝一兩、瓜蔞實一枚（搗）。以水五升，先煮枳實、厚樸，取二升，去滓，內(nèi)諸藥，煮數(shù)沸，分三次溫服。煎煮是影響復(fù)方質(zhì)量的因素之一，本研究再結(jié)合實際生產(chǎn)應(yīng)用的前提下，參考《古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》及《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》以及相關(guān)文獻[2-3]，選取加不加蓋、浸泡時間、煎煮火候、煎煮時間、干燥方式五個因素，以柚皮苷、新橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚為指標性成分，采用綜合評分法進行工藝優(yōu)選，明確工藝參數(shù)，保證物質(zhì)基準的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀（美國戴安）；NS105DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB25-12DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SCIENTZ-30YG/A冷凍干燥機（寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；砂鍋（九陽牌）等。

1.2 材料

1.2.1 試藥

厚樸酚（純度：99.0%，批號：110729-202015）、和厚樸酚（純度：99.8%，批號：110730-201915），柚皮苷（純度：93.5%，批號：110722-202116）、新橙皮苷（純度：99.4%，批號：111857-201804）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純（美國天地高純?nèi)軇┯邢薰荆凰疄榧兓?/p>

1.2.3 飲片

枳實（2007001湖南）、薤白（2004001江蘇）、桂枝（2009001河北）、厚樸（2008002四川）、瓜蔞（2002001廣西）藥材購于河北新京源藥業(yè)有限公司（經(jīng)鑒定，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定）。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸酚、和厚樸酚含量的測定

2.1.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇-水溶液（75∶25）為流動相；流速為1.0mL/min；檢測波長294nm；柱溫35℃；進樣量10μL。在上述色譜條件下，基準樣品中的厚樸酚、和厚樸酚色譜峰的保留時間與對照品一致，分離度良好。詳見圖1。

圖1 基準樣品的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of the substance reference

2.1.2 對照品溶液的制備

對照品儲備液的制備：稱取厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，即得。

對照品溶液的制備：將厚樸酚、和厚樸酚各取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1mL含厚樸酚0.01004mg、和厚樸酚0.01008mg的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取供試品1g，精密稱定，精密加入甲醇10mL，稱定重量，超聲處理50min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取對照品儲備液1mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得（1）；精密吸取對照品儲備液1mL置于25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得（2）；精密吸取（1）1mL置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得（3）；精密吸?。?）1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得（4）；精密吸?。?）1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得（5）；將5個不同濃度的對照品溶液按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，進樣量均為10μl，測定峰面積。以進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標（X），以峰面積（A）為縱坐標（Y），以繪制標準曲線，求出回歸方程和r值?；貧w方程為和厚樸酚：Y=29.71x+0.0276（R2=0.9999），厚樸酚：Y=27.518x+0.0006（R2=0.9999）。試驗結(jié)果表明：厚樸酚在0.02008μg-0.502μg，和厚樸酚在0.02016μg～0.504μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度考察

取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積RSD，考察儀器的精密度。結(jié)果表明：和厚樸酚峰面積RSD值為0.20%、厚樸酚峰面積RSD值為0.18%，均小于3%，說明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察

取本品共6份，制備供試品溶液，按含量測定方法項下操作，測定樣品中厚樸酚、和厚樸酚含量，計算RSD值并考察重復(fù)性。結(jié)果表明：和厚樸酚含量RSD值為1.95%、厚樸酚含量RSD值為1.88%，均小于3%，方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、14、18、24 h按含量測定方法項下操作，計算峰面積值RSD。結(jié)果表明：厚樸酚峰面積RSD為0.82%，和厚樸酚峰面積RSD為1.16%，均小于3%，表明供試品溶液在24h穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率

取供試品0.5g，精密稱定，共6份，分別加混合對照品溶液（厚樸酚6.16μg/mL，和厚樸酚3.02μg/mL）10mL，制備加樣供試品溶液并按含量測定方法項下操作，計算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果表明：厚樸酚平均回收率為90.2%、RSD值0.77%，和厚樸酚平均回收率為92.1%、RSD值0.98%

2.2 柚皮苷、新橙皮苷含量的測定

2.2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以乙腈-水溶液（25∶75）為流動相；流速為1.0mL/min；檢測波長285nm；柱溫35℃；進樣量：對照品10μL；供試品5μL。在上述色譜條件下，基準樣品中的柚皮苷、新橙皮苷色譜峰的保留時間與對照品一致，分離度良好。詳見圖2。

圖2 基準樣品的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of the substance reference

2.2.2 對照品溶液的制備

稱取新橙皮苷、柚皮苷對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1ml含柚皮苷0.404mg、新橙皮苷0.437mg的溶液，即得相應(yīng)對照品儲備液。

分別精密量取對照品儲備液各1ml至同一5ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml含柚皮苷0.0808mg、新橙皮苷0.0874mg的混合溶液，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10ml，稱定重量，超聲處理20min，放冷再稱定重量，加70%甲醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，分別加甲醇制成1ml含柚皮苷0.516mg、新橙皮苷0.432mg的對照品溶液，作為對照品溶液（1）；將對照品溶液（1）各取2ml加甲醇稀釋并定容至5ml容量瓶中，搖勻，即得對照品溶液（2）；將對照品溶液（1）各取1ml加甲醇稀釋并定容至5ml容量瓶中，搖勻，即得對照品溶液（3）；將對照品溶液（1）各取1ml加甲醇稀釋并定容至10ml容量瓶中，搖勻，即得對照品溶液（4）；將對照品溶液（2）各取1ml加甲醇稀釋并定容至10ml容量瓶中，搖勻，即得對照品溶液（5）。分別精密吸取上述對照品溶液（1）～（5）各10μl，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，求出回歸方程和r值?；貧w方程為柚皮苷：y=28.045x+0.513，r=1；新橙皮苷：y=32.382x+0.2146，r=1。試驗結(jié)果表明：柚皮苷在0.2064～5.16μg范圍內(nèi)，新橙皮苷在0.1728～4.32μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度考察

取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積RSD，考察儀器的精密度。結(jié)果表明：柚皮苷峰面積RSD值為0.56%、新橙皮苷峰面積RSD值為0.54%，均小于3%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取樣品適量，研細，取約0.1g，精密稱定，共6份，按含量測定方法項下操作，測定樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量，計算RSD值并考察重復(fù)性。結(jié)果表明：柚皮苷含量RSD為0.13%；新橙皮苷含量RSD為0.28%，均小于3%，方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、14、18、24 h按含量測定方法項下操作，計算峰面積值RSD。結(jié)果表明：柚皮苷峰面積RSD為1.24%，新橙皮苷峰面積RSD為1.28%，均小于3%，表明供試品溶液在24h穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率

取供試品0.05g，精密稱定，共6份，分別加混合對照品溶液（柚皮苷0.191mg/mL，新橙皮苷0.148mg/mL）10mL，制備加樣供試品溶液并按含量測定方法項下操作，計算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果表明：柚皮苷平均回收率為101.87%、RSD值1.03%，新橙皮苷平均回收率為98.78%、RSD值0.84%

2.3 出膏率的測定

參照2020版《中國藥典》浸出物測定法。精密吸取25mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，于105℃干燥至恒重，并計算出膏率。（出膏率（%）=干膏重/生藥重×100%）

2.4 工藝參數(shù)的考察

2.4.1 提取工藝評價指標的建立

以新橙皮苷和柚皮苷的總量、厚樸酚和厚樸酚的總量以及出膏率為評價指標，計算綜合得分（Y），通過綜合評分法優(yōu)選物質(zhì)基準的提取工藝，其中柚皮苷與新橙皮苷總量、厚樸酚與和厚樸酚的總量為主要指標，分別賦予50%、30%的權(quán)重；在實際生產(chǎn)中，提取工藝的控制指標還包括出膏率，因此賦予20%的權(quán)重，得到最終評價指標[4]。公式如下：

2.4.2 加蓋與不加蓋煎煮考察

加蓋與不加蓋的煎煮時間上差異很大，煎煮時間的長短決定著工作進度及能源消耗的程度，煎煮條件詳見表1。因此考察不加蓋煎煮與加蓋煎煮對出膏率以及新橙皮苷與柚皮苷總量、厚樸酚與和厚樸酚的總量的綜合評分。結(jié)果見表2。

表1 煎煮條件Table 1 Decoction conditions

表2 加蓋與不加蓋的考察指標Table 2 Examination indicators of covered and uncovered

從表2可知，加蓋與不加蓋對綜合評分影響較大，加蓋煎煮的出膏率略大于不加蓋煎煮，綜合評分較高，因此選擇加蓋煎煮為最佳方式。

2.4.3 浸泡時間考察

待煎中藥應(yīng)根據(jù)其質(zhì)地先浸泡，時間一般不少于30min，但沒有上限。質(zhì)地疏松的中藥，如花、葉、細莖等，浸泡0.5h即可；堅硬的中藥，如塊根、根莖、種子、果實等，應(yīng)浸泡1h；礦物、動物、介殼類的藥材浸泡時間可適當(dāng)延長。注意藥材浸泡時間不宜過久，以防變質(zhì)，尤其在夏季[5]。

枳實為果實類藥材，厚樸為根皮類藥材，因此，將枳實、厚樸的浸泡時間考察參數(shù)定為：不浸泡、0.5h、1h、1.5h，詳見表3。通過對出膏率以及新橙皮苷與柚皮苷總量、厚樸酚與和厚樸酚的總量的綜合評分優(yōu)選最佳浸泡方式。結(jié)果見圖3。

表3 煎煮條件Table3 Decoction conditions

圖3 浸泡時間的考察指標Fig.3 Examination indicators of soaking time

從圖3可知，不浸泡煎煮所制備的基準樣品綜合評分最高，且相比較煎煮時間最短，因此將浸泡時間參數(shù)確定為不浸泡。

2.4.4 后下藥煎煮火候

煎藥的火力按大小有文火、武火之分。文火就是小火，武火就是大火、旺火。武火的火焰大，力道猛烈，可以使溫度急速上升，使藥液很快沸騰，但也容易燒焦；而文火的火焰較小，力道比較溫和，但煎煮時間過長。因此對煎藥的火候進行考察，考察全程武火，武火煮煮沸后改文火，全程文火對基準樣品的影響，詳見表4。對出膏率以及新橙皮苷與柚皮苷總量、厚樸酚與和厚樸酚的總量的綜合評分優(yōu)選最佳煎煮火候。結(jié)果詳見圖4。

表4 煎煮條件Table 4 Decoction conditions

圖4 后下藥煎煮火候的考察指標Fig.4 Examination indicators of the decoction fire of the latter drug

從圖4可知，后下藥的煎煮火候?qū)υu分影響較為明顯，其中選用武火煎煮后所得基準樣品中綜合評分最高，因此以武火煎煮作為最佳煎煮條件進行后續(xù)的考察。

2.4.5 后下藥煎煮時間的考察

“茶圣”陸羽在《茶經(jīng)》里說，烹茶有“沸”。一沸：如魚目，微有聲；二沸：緣邊如涌泉連珠；三沸：騰波鼓浪。根據(jù)此說法確定藥材應(yīng)該是煎煮至三沸，但并未明確三沸之后的煎煮時間，在前期實驗中得出武火煎煮至三沸大約需要1h，以此考察后下藥的煎煮時間，詳見表5。對比出膏率以及厚樸酚，和厚樸酚的含量優(yōu)選最佳煎煮時間。詳見圖5。

表5 煎煮條件Table 5 Decoction conditions

圖5 后下藥煎煮時間的考察指標Fig.5 Examination indexes of decoction time of posterior lower medicine

由圖5可知，后下藥煎煮時間在1h時綜合評分最高，在煎煮過程中發(fā)現(xiàn)，煎煮時間過長水分蒸發(fā)，容易使藥材糊鍋，這也可能是含量降低的原因；此外，“茶圣”陸羽稱，三沸后再煮的水不宜飲用，因此，后下藥的煎煮時間確定為1h，即煎煮至三沸即可。

2.4.6 干燥方式

現(xiàn)代提取物的干燥方式有很多，常用的有常壓干燥與冷凍干燥。常壓干燥法是應(yīng)用最廣泛，操作以及設(shè)備都很簡單，但是需要時間久。冷凍干燥具有能夠使樣品保持良好的穩(wěn)定性，熱量消耗低等特點，但費用較高。兩種干燥方式各有優(yōu)缺點，因此通過對比出膏率以及厚樸酚，和厚樸酚的含量優(yōu)選最佳干燥方式，煎煮條件見表6。結(jié)果見表7。

表6 煎煮條件Table 6 Decoction conditions

表7 干燥方式的考察指標Table 7 Drying method of examination of indicators

通過不同干燥方式的考察（見表7），可以看出，冷凍干燥技術(shù)在有效成分含量的保留以及干燥時間上都優(yōu)于常壓干燥，且常壓干燥在干燥過程中如保存不當(dāng)很容易造成樣品變質(zhì)；冷凍干燥技術(shù)在中藥行業(yè)的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，因此，優(yōu)選冷凍干燥技術(shù)作為基準樣品的干燥方式。

綜上所述，通過對工藝參數(shù)的考察，最終確定基準樣品制備工藝為：取枳實9g、厚樸12g，加水1000mL，加蓋煎煮，武火煮沸，文火煎至煎液體積為400mL，100目篩網(wǎng)過濾，煎液加入薤白24g、瓜蔞12g、桂枝3g，武火煮至3沸（1h），100目篩網(wǎng)過濾，得湯液約200mL，減壓濃縮至100mL，冷凍干燥，即得。

2.5 工藝驗證

按照優(yōu)選的工藝參數(shù)將同一批藥材制備成三批樣品，并對出膏率、厚樸酚與和厚樸酚的總量、柚皮苷與新橙皮苷的總量進行考察。詳見表8。

表8 三批樣品工藝驗證Table 8 Process validation of three batches of samples

從表8可以看出，三批工藝驗證與前期工藝篩選時所得出的結(jié)果基本一致，因此可以確定基準樣品制備工藝的穩(wěn)定可行。

3 討論

枳實薤白桂枝湯，來源于漢·張仲景《金匱要略》。根據(jù)漢代度量衡轉(zhuǎn)化可知，一升等于200mL，所以可以確定加水量為1000mL，煎煮后體積為400mL；按照“十三五”規(guī)劃教材《方劑學(xué)》，一斤等于50g，一兩等于3g；考慮到枳實和瓜蔞個體差異較大并結(jié)合現(xiàn)今臨床常用劑量，最終處方量可以確定為：枳實9g，厚樸12g，薤白24g，瓜蔞12g，桂枝3g。

中藥復(fù)方制劑含有的化學(xué)成分比較多，而且存在成分與成分之間的相互作用，因此選擇具有代表性的化學(xué)成分進行含量測定，能在一定程度上反映出中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量[6]。枳實薤白桂枝湯主治胸痹，胸滿而痛，甚或胸痛徹背，喘息咳唾，短氣，氣從脅下上搶心，舌苔白膩，脈沉弦或緊[7]。枳實善于降氣開痞，除胸脅痰癖；厚樸氣味厚而主降，溫而專于散，苦而專于泄，下氣除滿，與枳實相伍，善能瀉實滿，消痰下氣，為主藥。配薤白辛溫通陽，寬胸散結(jié)；瓜蔞滌痰散結(jié)，寬胸利膈。為治胸痹要藥，共為輔藥。佐以桂枝，既助薤白溫通胸陽，又能溫里而降沖氣。厚樸酚及和厚樸酚是厚樸中的主要有效成分[8]，臨床上常用于消除胸腹?jié)M悶，鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)等[9]，也是2020版《中國藥典》中設(shè)定的指標成分[10]；黃酮類化合物是枳實藥材的主要有效成分之一[11]，其中含量較高的為柚皮苷及新橙皮苷，這兩種成分具有治療胃腸道疾病[12]、抗炎[13]和治療癌癥[14]等作用，因此本文選擇厚樸酚及和厚樸酚，柚皮苷及新橙皮苷作為評價基準樣品的工藝參數(shù)的指標。

本文采用單因素分析對浸泡時間，煎煮火候、時間等參數(shù)進行優(yōu)選，得到最佳工藝。該工藝穩(wěn)定可行，對提高枳實薤白桂枝湯的質(zhì)量與臨床應(yīng)用具有一定參考價值。

經(jīng)典名方在我國歷史悠久，經(jīng)典名方基準樣品的研究不僅是經(jīng)典名方開發(fā)的關(guān)鍵，也是核心內(nèi)容[15]。本文依據(jù)古籍記載，對枳實薤白桂枝湯基準樣品制備工藝進行研究，將其轉(zhuǎn)化成現(xiàn)代化的提取工藝，以保證基準樣品的均一、穩(wěn)定，利于產(chǎn)品的質(zhì)量評價。