李 齊 安子宜 董澤嵩 劉洪鳳 李 姝 畢鵬翔 霍楠楠 朱曉峰*

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院生化教研室，黑龍江 牡丹江，157011；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯，154000；3.開灤總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 唐山，063001；4.麗水市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 麗水 323000；5.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 牡丹江，157011）

酒精依賴綜合征，是現(xiàn)今最為常見的物質(zhì)依賴疾病之一。到目前為止，酒精依賴的患病人數(shù)僅次于尼古丁依賴綜合征，已經(jīng)成為全球第二大的成癮物質(zhì)，全球大約有4.9%（約2.4億）的人群受到影響。因?yàn)榫凭∷赖娜藬?shù)約占總病死人數(shù)的5.9%。根據(jù)2015年全球疾病研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)達(dá)國(guó)家的致殘致死的5個(gè)重要原因之一就是酒精依賴。中國(guó)流行病學(xué)研究顯示，我國(guó)酒精依賴和濫用問題也在日益增多，酒精依賴的研究也隨之增多?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)外最常使用的構(gòu)建酒精依賴大鼠模型的模式主要包括灌胃、自由飲、腹腔注射等方式。本研究通過大鼠自由飲方式，構(gòu)建了2種不同酒精濃度的酒精依賴大鼠模型，為酒精依賴綜合征的相關(guān)研究提供了科學(xué)模型方面的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取6周齡、體質(zhì)量180～200 g、SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，購(gòu)于牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房[SYXK（黑）2019-003]。動(dòng)物模型構(gòu)建及其相關(guān)檢測(cè)在牡丹江醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心鼠類實(shí)驗(yàn)室[SYXK（黑）2019-006]進(jìn)行。全部大鼠的飼養(yǎng)和使用都按《國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行操作，并且符合牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2 試劑及儀器

無水乙醇（生產(chǎn)企業(yè)：深圳邁瑞公司）；高架十字迷宮（生產(chǎn)企業(yè)：上海移數(shù)信息科技有限公司）；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（生產(chǎn)企業(yè)：成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 酒精依賴大鼠模型的構(gòu)建

將30只大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫維持在22～24 ℃，光照/黑暗周期為12 h/12 h，環(huán)境濕度55%左右。實(shí)驗(yàn)之前使用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為3組，每組10只，即對(duì)照組（a組），10%自由飲酒精依賴模型組（b組）和20%自由飲酒精依賴模型組（c組）。3組大鼠均每周更換墊料，并對(duì)其體質(zhì)量進(jìn)行稱量記錄。其中a組雙瓶蒸餾水自由飲喂養(yǎng)。b組在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始建模喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中飲食正常，飲水則是每個(gè)籠內(nèi)放置2個(gè)飲水瓶。2個(gè)水瓶分別是10%酒精溶液和蒸餾水，構(gòu)建模型期間，每天早上8：00分別測(cè)量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并記錄飲酒及飲水的數(shù)據(jù)。為了避免形成位置偏差，每天必須要交替更換酒瓶和水瓶的位置。所有蒸餾水和10%酒精溶液必須更新1次/d，持續(xù)造模4周，共28 d。c組同b組一樣，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始建模喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中飲食正常，飲水則是每個(gè)籠內(nèi)放置2個(gè)飲水瓶。第1天8：00雙瓶分別為20%酒精溶液和蒸餾水，第2天8：00分別測(cè)量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并且將裝20%酒精的水瓶替換為蒸餾水瓶，即第2 天大鼠飲用的是雙瓶蒸餾水，如此反復(fù)進(jìn)行交替。為了避免形成位置偏差，每次必須要交替更換水瓶和酒瓶的位置。所有蒸餾水和20%酒精溶液必須更新1次/d，持續(xù)造模4周，共28 d。

1.2.2 酒精偏好的測(cè)定

構(gòu)建模型成功后，計(jì)算b組和c組的酒精偏好。計(jì)算酒精偏好主要是為了掌握大鼠每天消耗的酒精量占了總液體（酒精+蒸餾水）的消耗量百分比，也就是酒精偏好（%）=酒精的消耗總量（mL）/（酒精的消耗總量+水的消耗總量）（mL）×100%。

1.2.3 高架十字迷宮檢測(cè)（Elevated plus maze，EPM）

在最后1次飲酒24 h后，把30只大鼠放置在室溫恒定（24 ℃）、室內(nèi)光線昏暗恒定的測(cè)試實(shí)驗(yàn)室中，全程保持安靜，對(duì)3組大鼠完成高架十字迷宮的測(cè)試。十字高架位于地面上方的65 cm處，由2條開放臂、2條閉合臂以及中央?yún)^(qū)共同組成。點(diǎn)擊EPM測(cè)試系統(tǒng)，設(shè)置本次測(cè)試實(shí)驗(yàn)的參數(shù)（包括開放臂和閉合壁進(jìn)入次數(shù)、開放臂和閉合壁滯留時(shí)間、動(dòng)物運(yùn)動(dòng)總距離等），完畢后，把大鼠放置在設(shè)備“十”字正中央位置，每只大鼠的測(cè)試時(shí)間為3 min。每次檢測(cè)完畢后，一定要使用乙醇棉球?qū)φ麄€(gè)設(shè)備擦拭，然后再繼續(xù)進(jìn)行下一只大鼠測(cè)試。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：開放臂進(jìn)入次數(shù)（OE，次）：即大鼠進(jìn)入到EPM任意一條開放臂的次數(shù)，每次活動(dòng)的開始是以該鼠的4個(gè)爪都進(jìn)入到開放臂內(nèi)或者大鼠軀體約有80%進(jìn)入臂內(nèi)開始，在實(shí)驗(yàn)中途有1個(gè)爪從該開放臂中完全撤出即認(rèn)為本次的進(jìn)入活動(dòng)結(jié)束；開放臂滯留時(shí)間（OT，s）：即大鼠進(jìn)入到開放臂中所停留的時(shí)間；總路程（cm）：即大鼠在十字高架中行動(dòng)的總距離。數(shù)據(jù)分析使用EPM自帶的動(dòng)物行為學(xué)軟件完成。大鼠進(jìn)入任意一條開放臂的次數(shù)越少，在開放臂里滯留的時(shí)間越短，則說明大鼠焦慮情況越加的嚴(yán)重。

1.2.4 水迷宮測(cè)試（Morris water Maze，MWM）

Morris水迷宮圓形的水池池壁，黑色的池底，在水池的四周掛避光的窗簾，對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域光線進(jìn)行遮擋。水池根據(jù)實(shí)驗(yàn)等分成為四個(gè)區(qū)域（即四個(gè)象限）。第一象限的中間放置一個(gè)水面以下0.5 cm 的平臺(tái)，平臺(tái)可以被拆除。每次實(shí)驗(yàn)都需要將大鼠移開，并用吹風(fēng)機(jī)將其吹干，放回籠內(nèi)。Morris水迷宮可以用來檢測(cè)酒精自由飲模型的學(xué)習(xí)與記憶能力（包括空間探索實(shí)驗(yàn)和定位航行實(shí)驗(yàn)）。定位航行實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)進(jìn)行4 d，固定時(shí)間段訓(xùn)練，2次/d，每次訓(xùn)練時(shí)間間隔15 min，游泳訓(xùn)練時(shí)間為60 s/次，每次訓(xùn)練要從池壁4個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池。如果大鼠在60 s內(nèi)能夠找到平臺(tái)，就讓它呆在平臺(tái)上30 s，加強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶；如果60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，就把它用工具引導(dǎo)到平臺(tái)上并且使其停留30 s。以大鼠每天每次到達(dá)路徑長(zhǎng)度（游泳距離）和平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）進(jìn)行測(cè)量，如果游泳距離和潛伏期越短，則說明其學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)是需要在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后24 h進(jìn)行，對(duì)動(dòng)物空間位置記憶的保持能力進(jìn)行測(cè)量，只需要進(jìn)行1次。定位航行實(shí)驗(yàn)和本次實(shí)驗(yàn)的差異在于要將水面高度調(diào)節(jié)到預(yù)定的高度之后需要移除平臺(tái)，大鼠在目標(biāo)象限的對(duì)側(cè)放出，游泳時(shí)間延長(zhǎng)為120 s。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，記錄大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)。穿越平臺(tái)次數(shù)越多，在平臺(tái)所在象限游泳停留時(shí)間越長(zhǎng)，就說明大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.2.4 酒精戒斷綜合征評(píng)分（scores of ethanol withdrawal syndrome，EWS）

根據(jù)Motaghine-jad M等的方法，在最后1次飲酒24 h后對(duì)3組大鼠進(jìn)行改良酒精戒斷行為學(xué)的觀測(cè)評(píng)分，30只大鼠都需要在同一環(huán)境下進(jìn)行評(píng)分觀測(cè)。觀測(cè)項(xiàng)目包括了5個(gè)項(xiàng)目和總評(píng)分，即刻板行為、激惹性、尾巴強(qiáng)直、異常姿勢(shì)和聽源性癲癇發(fā)作情況以及總評(píng)分，其中5個(gè)項(xiàng)目相加為總評(píng)分，每個(gè)項(xiàng)目的評(píng)分增高說明戒斷的癥狀在加重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 10%酒精依賴模型組和20%酒精依賴模型組的體質(zhì)量、飲酒量和飲酒偏好

2.1.1 3組大鼠體質(zhì)量比較

實(shí)驗(yàn)前，3組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.206，P=0.315）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，飲酒組（b組和c組）與對(duì)照組（a組）大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.905，P=0.416）。見圖 1。

圖1 3組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.1.2 建模期內(nèi)3組大鼠飲酒量、飲水量和酒精偏好

在雙瓶（酒精+蒸餾水）自由飲喂養(yǎng)模式下，b組在經(jīng)歷了連續(xù)28次雙瓶自由飲，在最后7 d的酒精攝入量（16.80±0.63）mL/24 h保持穩(wěn)定，飲水量（11.90±0.39）mL/24 h穩(wěn)定，酒精偏好穩(wěn)定在（57.74±1.83）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.762，P=0.121）。見圖2（A和B）。c組在經(jīng)歷了14次循環(huán)（28 d）間歇性雙瓶飲時(shí)，酒精的攝入量逐步增多，直至達(dá)到平臺(tái)期（16.65±1.31）mL/24 h，而飲水量伴隨著飲酒量的增多而減低，直至穩(wěn)定在了（10.30±0.98）mL/24 h，酒精偏好增加至（61.77±2.81）%。見圖3（C和D）。

圖2A b組大鼠最后7 d飲酒量、飲水量

圖2B b組大鼠最后7 d酒精偏好變化

圖3C c組大鼠飲酒量、飲水量

圖3D c組大鼠酒精偏好變化

2.2 高架十字迷宮測(cè)試（EPM）比較各組行為學(xué)變化

在b、c組最后1 d飲酒后24 h，對(duì)3組大鼠進(jìn)行EPM檢測(cè)。與a組比較，2組模型組在EPM測(cè)試中，其開放臂探索次數(shù)和時(shí)間均明顯減少，b組開放臂探索次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.946，P＜0.05），開放臂探索時(shí)間更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.021，P＜0.05）；c組開放臂探索次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.589，P＜0.01），開放臂探索時(shí)間更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.045，P＜0.05）。3組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離分別為（999.12±3.24）cm、（1 001.01±3.95） cm 和（999.98±3.67）cm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.680，P=0.515）。以上結(jié)果說明，酒精依賴大鼠在酒精戒斷后能夠出現(xiàn)焦慮行為，但酒精對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力無明顯的影響。高架十字迷宮的測(cè)試結(jié)果。見表1。

表1 3組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （）

2.3 3 組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 3 組大鼠游泳總距離和潛伏期比較

在定位航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，與a組相比，b組、c組大鼠記憶和學(xué)習(xí)能力明顯下降，其游泳總距離明顯變短，潛伏期也明顯縮短，其中實(shí)驗(yàn)第2天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.344，P＜0.05；t=-2.320，P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)第3天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.321，P＜0.05；t=-2.964，P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)第 4天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.090，P＜0.05；t=-4.117，P＜0.05）。見表 2、表 3。

表2 3組大鼠在4 d實(shí)驗(yàn)日潛伏期比較 （，s）

表3 3組大鼠在4 d實(shí)驗(yàn)日游泳總距離比較 （，cm）

2.3.2 3組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

實(shí)驗(yàn)第5天，MWM進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，與a組比較，b組、c組在目標(biāo)象限（即第一象限）滯留時(shí)間變少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.254，P＜0.05；t=4.011，P＜0.05）；與 a組比較，b組、c組平臺(tái)穿越次數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.517，P＜0.05；t=3.591，P＜0.05）。見表4。

表4 3組大鼠目標(biāo)象限滯留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)比較 （）

2.4 酒精戒斷評(píng)分對(duì)大鼠的戒酒癥狀的評(píng)價(jià)

b組、c組在飲酒期間很溫順，不容易被激惹，并很少會(huì)出現(xiàn)攻擊性行動(dòng)。與a組（2.50±0.71）分比較，b組（11.05±0.97）分、c組（12.10±0.99）分在戒酒24 h的戒斷總評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-23.681，P＜0.05；t=-24.878，P＜0.05）。見圖 4。

圖4 3組大鼠的酒精戒斷綜合征評(píng)分比較

3 討論

構(gòu)建成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是進(jìn)行科學(xué)研究的第一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟。國(guó)內(nèi)外在構(gòu)建酒精依賴模型的時(shí)候多會(huì)選用灌胃、腹腔注射以及自由飲的方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)分析，酒精依賴的大鼠模型假如用自由飲模式進(jìn)行模型的構(gòu)建，則會(huì)避免對(duì)大鼠腹腔連續(xù)注射酒精而引起的感染，以及灌胃大鼠致使的上消化道不適，從而降低了造模大鼠的死亡率。同時(shí)，自由飲構(gòu)建酒精依賴模型更符合人的飲酒方式，更適合做后續(xù)酒精依賴實(shí)驗(yàn)研究。但是自由飲模型也有缺陷，即動(dòng)物對(duì)酒精的喜好影響了模型的構(gòu)建。因此，本研究選擇雄性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在構(gòu)建模型后，對(duì)模型進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，篩選出已經(jīng)成功的模型。目前自由飲構(gòu)建模型的方法很多，本研究選用大鼠來制備10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組和20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組。結(jié)果表明，以上2種不同的制備模型方法都能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組在最后7 d的酒精攝入量保持穩(wěn)定，酒精偏好穩(wěn)定，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Sona Khan M等構(gòu)建動(dòng)物自由飲模型的結(jié)果接近；20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組在通過28 d間歇性酒精造模，其酒精攝入量在逐步增多，最后到達(dá)平臺(tái)期，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Hwa L S等構(gòu)建動(dòng)物自由飲模型的結(jié)果相類似。EPM中2組模型組與對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn)，在開放臂中探索時(shí)間與次數(shù)均明顯降低。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠記憶和學(xué)習(xí)能力明顯降低，即說明長(zhǎng)時(shí)間的飲酒，會(huì)導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)能力明顯下降。通過自愿飲酒量的增加，以及酒精偏好的增加，提示了本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功建立大鼠的酒精依賴模型，大鼠的行為學(xué)測(cè)試也說明自由飲的造模效果很好。

綜上所述，10%持續(xù)自由飲和20%間斷自由飲的建模方法均可以進(jìn)行酒精依賴的后續(xù)相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。