洪翩翩 陳玉萍 鄭楠 劉沐桑

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所，南京 210042；2.南京大學醫(yī)學院，南京 210093)

煙曲霉是一種在環(huán)境中普遍存在的腐生霉菌，可以在免疫缺陷人群中引起侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)等機會性感染疾病。IPA是造血干細胞移植和實體器官移植受者中最常見的侵襲性真菌感染[1]，進展迅速，治療困難且病死率高[2]。唑類化合物由于其強大的抗真菌活性以及低毒性，現(xiàn)已成為治療IPA的一線抗真菌劑，目前常用的唑類抗真菌劑有伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑等[3]。然而，長期使用唑類藥物會增加耐藥性的產(chǎn)生[4]。自1997年美國報道首例伊曲康唑耐藥的煙曲霉以來[5]，世界各地均有耐唑類煙曲霉的報道[6]，中國孫毅等[7]也陸續(xù)報道了煙曲霉伊曲康唑耐藥和聯(lián)合耐藥。因此，煙曲霉耐藥已經(jīng)成為嚴重的臨床問題，需要進一步重視與研究。

甾醇14α-去甲基化酶(sterol 14α-demethylase，CYP51)是真菌質膜的主要成分麥角甾醇生物合成路徑中必不可少的酶，其主要功能是催化羊毛甾醇14-α位脫甲基。唑類藥物通過與CYP51蛋白鑲接，阻止其與底物羊毛甾醇的結合，選擇性地抑制真菌的CYP51，引起產(chǎn)物麥角固醇的缺失，從而發(fā)揮抗真菌作用。CYP51A由cyp51A基因編碼，屬于細胞色素P450超家族，是煙曲霉麥角固醇合成途徑中的關鍵酶。煙曲霉唑類耐藥主要與cyp51A等靶位基因突變相關。cyp51A基因的點突變使CYP51A蛋白與唑類藥物結合力降低或靶酶基因的上調導致CYP51A過度表達均為唑類耐藥重要機制[8]。目前，臨床上觀測到唑類耐藥株大多數(shù)為影響藥物結合的cyp51A突變株[9]，其中單獨的點突變導致 G54、G138、M220、G432 和 G448 位點的氨基酸取代，cyp51A上游啟動子區(qū)域可能同時出現(xiàn)一定長度的串聯(lián)重復序列(tandem repeat, TR)，后者包括TR34/L98H 和 TR46/Y121F/T289A 等突變[6]。2011年一項煙曲霉耐藥性分子流行病學調查項目(ARTEMIS)[10]從我國浙江杭州分離出了8株具有 TR34/L98H 突變的耐唑煙曲霉。2015年我院研究人員以最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)同時達到伏立康唑、伊曲康唑/泊沙康唑的耐藥濃度為耐唑株標準，從72株臨床煙曲霉中，分離鑒定出4株耐唑類藥物突變株，其中1株為TR34/L98H突變，1株為G432A突變[6]。這些研究提示TR34/L98H突變可能是我國煙曲霉耐藥的主要機制。不同突變型的耐藥機制與藥敏譜均有差異，因此，建立cyp51A基因數(shù)據(jù)庫有利于準確鑒定臨床耐藥株，快速獲取耐藥信息，是一項有意義的研究。

基礎局部比對搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)是美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)開發(fā)的核酸或蛋白序列比對工具，能快速找到兩段序列之間的同源序列并對比對區(qū)域進行打分以確定同源性的高低。目前BLAST已實現(xiàn)本地化，可由研究者自行構建本地目標序列數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)精準快速的雙序列比對。

本研究中，我們對本課題組收集的143株耐藥與非耐藥臨床煙曲霉進行了cyp51A基因測序，基于測序結果與對應的菌種信息，構建了煙曲霉cyp51A基因序列BLAST本地數(shù)據(jù)庫，其中包括TR34/L98H突變、G432A突變等。該數(shù)據(jù)庫可實現(xiàn)待查煙曲霉菌株cyp51A序列與已知耐藥/非耐藥序列的快速比較，從而快速判定待查菌株的cyp51A基因型，有利于從分子水平鑒定耐藥株，輔助煙曲霉相關臨床與科研工作的開展。

1 材料與方法

1.1 菌株與藥敏試驗

2011年至2018年期間，我們從南京、上海、福州等城市的煙曲霉肺部感染者身上收集了143株煙曲霉的臨床標本。根據(jù)EUCAST方案E.DEF9.1[11]，用微量肉湯稀釋法測定菌株對唑類藥物的敏感性。藥敏試驗判讀折點為：對于伊曲康唑、伏立康唑，MIC≤ 1 mg/L、MIC=2 mg/L、MIC>2 mg/L分別為敏感、中介、耐藥；對于泊沙康唑，MIC≤ 0.125 mg/L、MIC=0.25 mg/L、MIC>0.25 mg/L分別為敏感、中介、耐藥。由于大多數(shù)泊沙康唑耐藥株對于伊曲康唑的敏感性也降低，因此本研究以伊曲康唑和伏立康唑為中心藥物篩選耐藥株，只有待測菌株對伊曲康唑耐藥時，才補充測定泊沙康唑的MIC。

1.2 試劑與儀器

DNA提取使用Fast DNA?SPIN試劑盒(美國MP Bio公司)。PCR實驗用TaKaRa Taq TM聚合酶、dNTP、PCR緩沖液、100 bp電泳分子量Marker均來源于寶生物工程(大連)有限公司。PCR和測序所用引物由上海生工公司合成。核酸提取使用Fast DNA SPIN試劑盒及其配套的Bio 101 Fastprep-24核酸提取儀都是購自美國MP Bio公司。培養(yǎng)基為實驗室自行配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.3 DNA提取和純化

樣品真菌接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10 d，收取上層真菌約100 mg放置到5 mL玻璃組織研磨器中進行研磨，并按照Fast DNA SPIN試劑盒說明書進行真菌DNA的提取。詳細如下：先加入1 mL CYS-L緩沖液振蕩混勻，然后在室溫下孵育20 min，放到Fastprep核酸提取儀上以5.0/s的速度振蕩30 s，再孵育30 min，然后用1400 r/min離心5 min，上清移至新管中，加入600 μL Binding matrix混勻后進行5 min孵育，然后在12 000 r/min離心1 min，取沉淀加入500 μL SEAS-M吹打混勻，再次離心取沉淀干燥30 min，加入100 μL DES吹打混勻，12 000 r/min過柱離心洗脫1 min，洗脫下來的核酸放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與測序

使用表1中列出的引物對整個cyp51A基因及其啟動子區(qū)域進行擴增和測序。PCR反應體系如下：2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 × 緩沖液5 μL，10 mmol/L MgCl23 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，Taq DNA聚合酶2 U，模板DNA 2 μL，雙蒸水將余下體積補至總體積50 μL。反應條件：預變性95℃ 5 min；變性 95℃ 45 s；退火 53℃ 45 s；延伸 72℃ 75 s，共30個循環(huán)，最末延伸 72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司純化并測序。測序結果使用SeqMan 軟件(DNA Star 軟件包)進行拼裝，并根據(jù)測序峰圖對序列進行手工核對，形成完整或部分cyp51A基因序列，存為FASTA格式文本文件。

表1 cyp51A PCR擴增和測序中使用的引物

1.5 整合BLAST檢索服務數(shù)據(jù)庫的構建

在我單位工作站計算機上安裝美國國家生物信息中心(NCBI)提供的BLAST-2.2.29軟件工具包。首先將143株耐藥與非耐藥煙曲霉的cyp51A核酸序列存為單一的FASTA格式文件CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51A_1.fas，然后使用BLAST-2.2.29工具包的makeblastdb命令對上述序列文件進行數(shù)據(jù)格式化和索引化(參數(shù)：-in CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51A_1.fas-db type nucl)形成可供BLAST檢索的本地數(shù)據(jù)庫。

1.6 數(shù)據(jù)庫的檢索使用

取我中心保藏的經(jīng)過鑒定的煙曲霉臨床TR34/L98H突變耐藥株與野生型非耐藥株，按1.3中描述方法提取純化DNA，使用上游引物P450-A1和下游引物P450-A2兩條引物擴增cyp51A部分序列(partial sequence)并使用引物P450-A1進行單側測序，提交檢索序列為P450-A1下游305-385位，正好是Sanger法測序儀測序信號最清晰的區(qū)域。耐藥株與非耐藥株測序結果分別保存為input21.txt、input22.txt文件，使用本地數(shù)據(jù)庫的blastn命令將待檢索測序結果對數(shù)據(jù)庫進行檢索(參數(shù)分別為：-query input21.txt-db CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51A_1.fas-out result21.txt、-query input22.txt-db CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51A_1.fas-out result22.txt)，對比結果分別存于result21.txt與result22.txt文件。檢索基因序列為cyp51A基因的第323-403位(CCTGG…GAC)，序列定位以煙曲霉標準株AF293的cyp51A基因(Genbank accession number: AF338659.1)為準。

2 結 果

2.1 煙曲霉臨床株cyp51A序列

所得143株煙曲霉臨床株cyp51A序列中，耐藥株共11株(見表2)，其中測得完整序列耐藥株有4株：s42b、h18、n2176、s40，部分序列耐藥株有7株：2419、2441、2442、2500、2512、4134、4172，除菌株h48為G432A突變株外，其他10株耐藥株均為TR34/L98H突變株。非耐藥株共132株，其中測得完整序列非耐藥株有55株，部分序列非耐藥株有77株。對比cyp51A靶位基因突變與煙曲霉臨床分離株中觀察到的唑類耐藥表型發(fā)現(xiàn)，TR34/L98H突變株的患者臨床上主要表現(xiàn)為對伊曲康唑耐藥，G432A突變株標本則來源于一接受氟康唑經(jīng)驗性抗真菌治療的嚴重肺部感染患者。

表2 11株煙曲霉耐藥株基本信息

2.2 BLAST本地數(shù)據(jù)庫的建立

cyp51A完整序列或部分序列數(shù)據(jù)經(jīng)BLAST工具包格式化后生成數(shù)據(jù)庫由以下七個文件構成：CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.nhr、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.nin、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.nsq、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.ndb、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.not、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.ntf、CYP51A_chen0802_1_aac2014cyp51a_1.fas.nto，共同構成完整數(shù)據(jù)庫。其中，nhr、nin、nsq文件分別是數(shù)據(jù)庫的庫索引(indices)，序列(sequences)和頭(headers)文件，根據(jù)makeblastdb命令運行結果判斷數(shù)據(jù)庫構建成功。數(shù)據(jù)庫包含共143條cyp51A序列，總容量270 162字節(jié)。

2.3 數(shù)據(jù)庫的檢索應用實例

按照1.6所示方法使用blastn命令將待測TR34/L98H突變耐藥株與野生型非耐藥株標本cyp51A部分序列測序結果分別對數(shù)據(jù)庫進行Blast檢索，耐藥株檢索結果見圖1、2，非耐藥株檢索結果見圖3、4。Blast檢索的相似顯著性E值(E-Value)的閾值默認為10-10。對于TR34/L98H突變耐藥株標本，數(shù)據(jù)庫中檢索到序列完全相同的煙曲霉菌株共有10條(見圖1)，分別是4172、4134、2512、2500、2442、2441、2419、s40、n2176、s42b，均為TR34/L98H突變株，其相似度打分均為150，相似顯著性E值均為7×10-39。圖2為提交的TR34/L98H突變耐藥株標本cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的比對結果，提交序列與數(shù)據(jù)庫中存儲的煙曲霉菌株序列正向匹配(Strand=Plus/Plus)。以數(shù)據(jù)庫中的s42b耐藥株為例，存儲的TR34/L98H突變耐藥株與提交的TR34/L98H突變耐藥株cyp51A基因的第323～403位序列完全相同(Identities=100%)，而對于存儲的非耐藥株，以2558菌株為例，數(shù)據(jù)庫顯示有一個核苷酸不匹配(Identities=99%)，這個核苷酸就是導致TR34/L98H突變的核苷酸，即cyp51A基因第364位的T>A突變，導致其密碼子由CUC變?yōu)镃AC，從而引起了蛋白質水平的亮氨酸(Leu)>組氨酸(His)變異。

圖1 TR34/98H突變耐藥株標本的cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的檢索結果(部分) 圖2 TR34/98H突變耐藥株標本的cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的比對結果(部分) 圖3 野生型非耐藥株標本的cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的檢索結果(部分)

對于野生型非耐藥株標本，數(shù)據(jù)庫中檢索到序列完全相同的煙曲霉菌株共有129條，除h48為G432A突變株外(G432A突變位點位于檢索的部分序列之外)，其余均為非耐藥株。相似度打分均為150，相似顯著性E值均為7×10-39。圖4為提交的野生型非耐藥株標本cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的比對結果。以數(shù)據(jù)庫中的s1非耐藥株為例，存儲的非耐藥株與提交的非耐藥株標本的cyp51A基因的第323～403位序列完全相同(Identities=100%)，而對于存儲的TR34/L98H突變耐藥株，以4172突變株為例，數(shù)據(jù)庫顯示有一個核苷酸不匹配(Identities=99%)，即上述導致TR34/L98H突變的第364位核苷酸。

圖4 野生型非耐藥株標本的cyp51A部分序列對本數(shù)據(jù)庫的比對結果(部分)

以上TR34/L98H突變耐藥株與野生型非耐藥株標本cyp51A部分序列對此數(shù)據(jù)庫進行檢索和比對的結果顯示，我們的煙曲霉cyp51A基因序列BLAST數(shù)據(jù)庫成功建立，并成功用于cyp51A耐藥突變的檢索與比對。

3 討 論

由于唑類耐藥性與曲霉病治療失敗息息相關，許多研究集中在與此類耐藥性相關的流行病學、分子機制和診斷方法上。既往研究提示，cyp51A靶位基因突變與煙曲霉臨床分離株中觀察到的唑類耐藥表型之間具有強大的關聯(lián)性，可以作為分子診斷的理想目標。因此，建立煙曲霉耐藥基因數(shù)據(jù)庫尤其是cyp51A基因數(shù)據(jù)庫，在分子層面快速、精準識別突變信息，對于研究耐藥突變的發(fā)生機制和新型抗真菌劑的開發(fā)等方面都具有重要意義。

傳統(tǒng)的抗真菌藥敏試驗通過表型分析進行，例如臨床和和實驗室標準研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)和歐盟抗微生物藥敏試驗委員會(European Union Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)制定的微量肉湯稀釋法、瓊脂擴散法、E-test法等，這些方法通過檢測MIC鑒定耐藥真菌，具有不少局限性：培養(yǎng)所需純度較高，無法檢測培養(yǎng)陰性的真菌；耐藥臨床折點規(guī)定不一；實驗室間存在差異等[14]。隨著DNA測序技術的發(fā)展，唑類耐藥相關基因突變的檢測也日漸成熟。目前，煙曲霉對唑類藥物耐藥的分子診斷方法主要是檢測cyp51A基因中的突變。既往PCR的模板DNA多來源于臨床菌株培養(yǎng)后收集、提取的基因組DNA。但Spiess等[15]利用改良的巢式PCR，可直接將送檢標本中提取的DNA作為模板，對目的基因進行擴增，檢測cyp51A中的突變熱點及啟動子區(qū)插入的重復序列。這種改良PCR能快速、敏感地檢測臨床培養(yǎng)陰性的標本，包括肺泡灌洗液、腦脊液、血液等。這有助于提高早期IPA的診斷率，從而提高IPA易感人群的生存率。本實驗DNA樣本均來自于臨床培養(yǎng)陽性的標本，尚未嘗試直接檢驗臨床血液、體液等標本，但是，基于這些已有的臨床標本DNA測序數(shù)據(jù)，整合分子流行病學資料，建立相應的耐藥基因數(shù)據(jù)庫，結合上述改良PCR，基于數(shù)據(jù)庫檢索對比進行核酸分子診斷，特別適用于微量真菌的快速檢測與耐藥機制的評估，結合既往突變型對應的藥敏試驗可以同時獲取檢測真菌對于多種藥物的耐藥信息。以上我們的數(shù)據(jù)庫檢索對比結果顯示，此法檢索靈敏度很高，可以精準識別單個核苷酸突變，且與傳統(tǒng)表型檢測相比，所需樣本量很少，操作簡便，速度快，可以為煙曲霉臨床感染提供快速的耐藥診斷，輔助臨床決策，并為煙曲霉耐藥流行病學研究提供有力工具。

當然，對于檢測煙曲霉唑類耐藥而言，此數(shù)據(jù)庫仍具有一定的局限性。實際上，cyp51A基因突變僅僅是煙曲霉耐唑的其中一種機制。已報道的耐藥菌株中存在的突變除本數(shù)據(jù)庫中的TR34/L98H與G432A外，尚包括G54R,-W,-E,-K、Y121F、G138C,-S、P216L、F219I,-C,-S、M220V,-K,-T,-I、A284T、Y431C,-S、G432S、G434C、G448S、TR46/Y121F/T289A、TR53[16]。并且，外排泵基因過表達使藥物外排泵作用增強，細胞內唑類藥物含量減少，也會導致耐藥。煙曲霉藥物外排泵主要有兩類：ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)蛋白與主要協(xié)助轉運蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)[16]。據(jù)報道，破壞ABC蛋白 cdr1B(abcA)有助于提高煙曲霉耐唑性。對于這些非cyp51A突變耐唑株，此BLAST數(shù)據(jù)庫檢索比對可能會造成漏診或誤檢。

另外，由于目前BLAST工具包尚不支持漢化，所以我們在標注煙曲霉菌株信息時使用的還是拉丁學名與英文，而本地blast命令行又對操作人員有一定的生信能力要求，給此數(shù)據(jù)庫在醫(yī)院的內部使用增加了難度。并且，由于目前煙曲霉臨床耐藥株獲取困難，即使經(jīng)過幾年多方收集菌株與測序匯總，目前的數(shù)據(jù)庫規(guī)模仍然有限，且囊括的cyp51A突變型較為單一，TR34/L98H、G432A是儲存的主要突變型，其余均為非耐藥株。在今后的工作中，我們將繼續(xù)收集煙曲霉臨床耐藥株，以納入更多耐藥相關突變型，以便在相關臨床與科研中進一步推廣和應用。