鄧卓雅 田昱瑩 楊鵬輝

（1）解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心肝膽胰外科醫(yī)學(xué)部，全軍肝膽外科研究所，北京 100853；2）解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；3）內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010110）

近年來(lái)，盡管腫瘤治療取得了顯著進(jìn)展，但惡性腫瘤仍然是世界第二大致死原因［1］。臨床上常規(guī)的腫瘤治療手段包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療和綜合治療等。此外，檢查點(diǎn)抑制劑（checkpoint inhibitor，CPI）對(duì)多種惡性腫瘤的有效治療啟發(fā)了人們對(duì)腫瘤免疫治療的新思路［2］。腫瘤免疫治療的目的是激活宿主的抗腫瘤免疫，改變抑制腫瘤的微環(huán)境，最終達(dá)到縮小腫瘤，提高患者總體生存率的目的。腫瘤疫苗是一種有潛力的抗腫瘤免疫治療手段。針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（tumorassociated antigen，TAA）或 腫 瘤 特 異 性 抗 原（tumor-specific antigens，TSA）的疫苗可以特異性地攻擊和摧毀高表達(dá)腫瘤抗原的惡性腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)免疫記憶而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的持續(xù)殺傷作用。因此，與其他免疫療法相比，腫瘤疫苗提供了特異、安全和可耐受的治療方法。盡管研究者在開(kāi)發(fā)腫瘤疫苗方面做出了相當(dāng)大的努力，但由于腫瘤抗原的高度多樣性和相對(duì)較低的免疫反應(yīng)，幾十年來(lái)將腫瘤疫苗轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療方法仍然具有挑戰(zhàn)性［3］。mRNA疫苗作為腫瘤疫苗的重要類(lèi)型，能夠編碼TAA、TSA及其相關(guān)的細(xì)胞因子，同時(shí)激發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，增加克服疫苗耐藥性的可能性，從而達(dá)到加強(qiáng)患者抗腫瘤免疫的效果，成為一種具有良好前景的治療方式。mRNA疫苗具有多種優(yōu)勢(shì)，如能夠產(chǎn)生強(qiáng)有力的保護(hù)性免疫反應(yīng)，mRNA的生產(chǎn)速度更快、更靈活、成本更低，可以用于精準(zhǔn)和個(gè)性化的治療。體外轉(zhuǎn)錄后再加帽加尾是mRNA腫瘤疫苗公認(rèn)的生產(chǎn)方法，它類(lèi)似于真核細(xì)胞胞漿中自然加工和成熟mRNA。當(dāng)接種疫苗部位的細(xì)胞吸收后，mRNA被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。接著，通過(guò)核糖體合成mRNA編碼的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行翻譯后修飾，產(chǎn)生正確折疊的功能蛋白質(zhì)。mRNA疫苗可以使其編碼的蛋白質(zhì)或肽瞬時(shí)表達(dá)，持續(xù)幾天或幾周，使得mRNA更容易控制。更為重要的是從安全性出發(fā)，與DNA疫苗相比，mRNA不會(huì)整合到宿主基因組中。

本文聚焦于mRNA疫苗目前在腫瘤治療方面的應(yīng)用，并總結(jié)了mRNA領(lǐng)域的發(fā)展和面臨的挑戰(zhàn)，將有助于更好地認(rèn)識(shí)和了解mRNA疫苗的免疫學(xué)機(jī)制和臨床研究進(jìn)展，為腫瘤治療提供新的研究策略。

1 mRNA制備策略

mRNA腫瘤疫苗的制備方法是體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription，IVT），它模擬真核細(xì)胞胞漿中自然加工和成熟mRNA（圖1）。體外轉(zhuǎn)錄是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的過(guò)程，但制造高質(zhì)量的、高度可翻譯的、不會(huì)引起嚴(yán)重炎癥的“治療性”mRNA一直是該領(lǐng)域的主要限制。最近炎癥和自身免疫得到了很大程度的解決，包括加帽加尾技術(shù)的改善、加入修飾性核苷［4］（特別是修飾的尿苷）、優(yōu)化編碼序列［5］、以及通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［6］嚴(yán) 格 純 化IVT mRNA以去除雙鏈RNA（dsRNA）污染物。這些技術(shù)將有助于減少外源mRNA的信號(hào)，從而降低炎癥反應(yīng)并改善mRNA的翻譯水平。

1.1 序列構(gòu)建

首先，mRNA疫苗需要設(shè)計(jì)一條DNA模板去進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。該DNA模板至少需要包含目的蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）、側(cè)翼的5′非翻譯區(qū)（5′untranslated region，5′UTR）和3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）。其次需要含有可用的RNA聚合酶（例如T7、T3或SP6噬菌體RNA聚合酶）［7］的引物結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)體外轉(zhuǎn)錄。

ORF本身編碼的目的蛋白質(zhì)會(huì)影響翻譯效率，有些稀有密碼子也會(huì)降低翻譯效率。而氨基酸可由幾個(gè)密碼子共同編碼，利用密碼子的兼并性可以優(yōu)化氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)而優(yōu)化翻譯過(guò)程［8］。但原始序列的操縱也可能導(dǎo)致不利結(jié)果，有研究表明即使是同義突變也會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［9］。

UTR具有重要的細(xì)胞功能，可以通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)影響mRNA降解速率和翻譯效率，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)［10］。5′UTR在翻譯的啟動(dòng)和啟動(dòng)前復(fù)合體的形成過(guò)程中起著重要的作用。5′UTR除了有助于啟動(dòng)翻譯和提高翻譯效率外，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性也很重要。3′UTR可以通過(guò)包含如來(lái)自α-或β-珠蛋白等序列［11］來(lái)提高翻譯效率；也可以增加miRNA的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)調(diào)控靶基因在不同組織的表達(dá)，例如增加miRNA-122結(jié)合位點(diǎn)來(lái)減少在正常肝組織表達(dá)從而降低肝毒性［12］。此外，較高的GC含量和較低的U含量有利于降低免疫原性，最大限度地提高IVT mRNA的穩(wěn)定性［13］。

1.2 體外轉(zhuǎn)錄

體外轉(zhuǎn)錄（IVT）是將設(shè)計(jì)好的模板DNA鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則轉(zhuǎn)錄生成RNA鏈的過(guò)程。RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子后轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，修飾的核苷酸可以用來(lái)進(jìn)一步穩(wěn)定RNA并降低免疫原性［14］。常見(jiàn)的替代有N6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、5-甲基尿嘧啶（m5U）、2-硫代尿嘧啶（s2U）或假尿嘧啶（ψ）等。特別是m5C和ψ，不僅被報(bào)道降低體外轉(zhuǎn)錄后RNA的免疫原性，甚至可以提高翻譯效率。

1.3 加帽

真核細(xì)胞中典型的5′帽結(jié)構(gòu)是一個(gè)倒置的7-甲基鳥(niǎo)苷（m7G），它通過(guò)5′-5′三磷酸橋與RNA的第一個(gè)核苷酸共轉(zhuǎn)錄。5′帽結(jié)構(gòu)的功能是增加體外轉(zhuǎn)錄后RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，并消除其免疫原性。正常核糖體的結(jié)合與啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需要5′帽子結(jié)構(gòu)的作用，5′UTR和5′帽子結(jié)構(gòu)的作用相關(guān)，在翻譯的啟動(dòng)和啟動(dòng)前復(fù)合體的形成過(guò)程中起著重要的作用。體外轉(zhuǎn)錄后RNA有一個(gè)高度免疫原性的5′三磷酸部分。三磷酸化的RNA在細(xì)胞質(zhì)中被模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別，并引起Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFNⅠ）反應(yīng)［15］。為了防止RNA被識(shí)別為外源物質(zhì)，必須去掉其三磷酸，并添加一個(gè)5′帽。有幾種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)［16］。加帽可以通過(guò)在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加一個(gè)帽子類(lèi)似物來(lái)進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄。添加一個(gè)帽子類(lèi)似物有可能會(huì)被錯(cuò)誤地結(jié)合，導(dǎo)致mRNA不具備翻譯能力，而抗反向帽類(lèi)似物（anti-reverse cap analog，ARCA）使聚合酶以正確的方向結(jié)合ARCA［17］。也可以通過(guò)用磷酸酶去除三磷酸腺苷和用2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶添加m7G來(lái)完成轉(zhuǎn)錄后的封頂。無(wú)論是轉(zhuǎn)錄中還是轉(zhuǎn)錄后加帽，都不能保證所有的RNA分子都會(huì)被修飾加帽，由于錯(cuò)誤封頂激活PRRs導(dǎo)致外源mRNA免疫原性的提高［18］。

1.4 加尾

Poly（A）尾可以使用Poly（A）聚合酶［19］在轉(zhuǎn)錄后添加，也可以構(gòu)建在模板中直接轉(zhuǎn)錄。Poly（A）尾可以減緩RNA免受RNA核酸外切酶的降解過(guò)程，提高RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。Poly（A）尾的長(zhǎng)度一般是100~250個(gè)核苷酸，但最佳長(zhǎng)度取決于靶細(xì)胞類(lèi)型。使用修飾的腺苷可以進(jìn)一步提高多聚（A）尾的穩(wěn)定性，使其不受細(xì)胞核糖核酸酶的降解［20］。在DNA模板中構(gòu)建Oligo（dT）來(lái)添加Poly（A）尾可以更好地控制尾巴的精確長(zhǎng)度，并使隨后的酶促反應(yīng)失效，但作為模板的一部分其長(zhǎng)度往往受到限制。

1.5 純化

體外轉(zhuǎn)錄后需要純化mRNA，并測(cè)定其濃度，排除異常、截?cái)嗪徒导?jí)產(chǎn)品。臨床上通過(guò)層析的技術(shù)純化mRNA，去除了由轉(zhuǎn)錄失敗而引起的較短模板片段或由自身互補(bǔ)3′延伸引起的dsRNA，這兩者都是造成雜質(zhì)的常見(jiàn)原因。為了從轉(zhuǎn)錄的mRNA中去除dsRNA，人們提出了一種基于對(duì)纖維素的吸附來(lái)純化mRNA的替代方法［21］。在IVT過(guò)程中，可以通過(guò)降低Mg2+濃度或在高溫下產(chǎn)生RNA來(lái)減少dsRNA種類(lèi)［22］。HPLC實(shí)現(xiàn)了dsRNA的更完整和更徹底的去除［23］。然而，HPLC純化mRNA的成本高、收率低（<50%）。最近，Baiersdorfer等［21］報(bào)道了一種快速、廉價(jià)的純化方法。該方法利用dsRNA與含有乙醇的緩沖液中的纖維素粉的選擇性結(jié)合，結(jié)合快速蛋白液相色譜（fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC），可去除高達(dá)90%的dsRNA。現(xiàn)經(jīng)證明，成功的mRNA翻譯和蛋白質(zhì)表達(dá)不需要使用任何修飾的核苷酸，更多地依賴于mRNA的純度和其單個(gè)部分的序列組成［24］。

2 mRNA遞送系統(tǒng)

除了構(gòu)建序列、生產(chǎn)mRNA，開(kāi)發(fā)高效、安全的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)也是mRNA疫苗技術(shù)的關(guān)鍵。已有的傳統(tǒng)方法，如體外負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、結(jié)內(nèi)輸送mRNA和機(jī)械方法（基因槍、電穿孔）來(lái)傳遞裸露的mRNA用于疫苗接種［25］，但這些方法要么復(fù)雜昂貴（體外負(fù)載DC），要么難以在人體內(nèi)使用（結(jié)內(nèi)輸送、電穿孔），因此，傳遞mRNA的理想方式是使用一種能夠保護(hù)mRNA不被降解，并促進(jìn)細(xì)胞有效攝取的材料。

2.1 多聚體納米顆粒

多聚體納米顆粒封裝mRNA可保護(hù)mRNA并使其免于降解，并且其特定的化學(xué)性質(zhì)可以幫助細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸。聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）是一種廣泛用于核酸輸送的陽(yáng)離子聚合物，商品化的線性PEI衍生物jetPEI?已被用于體內(nèi)和體外的mRNA轉(zhuǎn)染。脂肪鏈修飾的低分子PEI可以降低毒性［26-27］。聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM）或聚丙烯亞胺樹(shù)枝狀大分子是另一類(lèi)用于mRNA傳遞的陽(yáng)離子高分子材料。Khan等［27］開(kāi)發(fā)了脂肪鏈修飾的PAMAM樹(shù)枝狀大分子，用于系統(tǒng)地將siRNA輸送到肺內(nèi)皮細(xì)胞并遞送了抗原編碼的SAM。生物可降解聚合物的開(kāi)發(fā)是為了提高運(yùn)載工具的清除率，同時(shí)降低其荷電毒性。聚β-氨基酯（poly beta-amino esters，PBAEs）是一種用于siRNA/mRNA遞送的生物可降解聚合物。此外，Blakeny等［28］開(kāi)發(fā)的生物可還原聚CBA-co-4-氨基-1-丁醇（Pabol）被用于在小鼠體內(nèi)傳遞編碼血凝素（HA）的SAM。

2.2 蛋白質(zhì)-mRNA復(fù)合體

蛋白質(zhì)-mRNA復(fù)合體是指將魚(yú)精蛋白等蛋白質(zhì)直接綴合到RNA，該復(fù)合體通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)涉及Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR） 的 髓 系 分 化 標(biāo) 志 物88（myeloid differentiation marker 88，MyD88）依賴性途徑激活免疫系統(tǒng)。魚(yú)精蛋白是一種陽(yáng)離子多肽，通過(guò)靜電相互作用自發(fā)縮合mRNA，保護(hù)包裹的mRNA不被細(xì)胞外核糖核酸酶降解。魚(yú)精蛋白-mRNA復(fù)合物還可以作為佐劑，激活TLR7/8以誘導(dǎo)Th-1型免疫反應(yīng)［29-30］。RNActive?疫苗在Ⅰ/Ⅱ期患者中具有良好的耐受性和免疫原性，其中一些已經(jīng)顯示出中等的抗腫瘤效果。陽(yáng)離子細(xì)胞穿透肽（cellpenetrating peptides，CPPs）能 與RNA形 成 復(fù) 合物。研究人員推測(cè)CPPs可能促進(jìn)帶負(fù)電荷的糖胺聚糖在細(xì)胞表面聚集，并引發(fā)微胞吞噬［30］。

2.3 脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）

近幾年，高效核酸輸送材料的開(kāi)發(fā)取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）最初是為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）遞送而研發(fā)，現(xiàn)已成為目前使用最廣泛的體內(nèi)傳遞mRNA材料［31］。Pardi等［32］證實(shí)mRNA-LNPs可以在體內(nèi)表達(dá)后，多項(xiàng)腫瘤疫苗研究已經(jīng)使用了LNPs包裹的mRNA。此外，2021年，中國(guó)國(guó)家納米科學(xué)中心王海、聶廣軍團(tuán)隊(duì)［33］設(shè)計(jì)了一款水凝膠長(zhǎng)效穩(wěn)定RNA疫苗，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示將其皮下注射后，可以至少在30 d內(nèi)持續(xù)釋放RNA納米疫苗，進(jìn)入引流淋巴結(jié)內(nèi)部并且被抗原提呈細(xì)胞攝取，實(shí)現(xiàn)持久的抗腫瘤免疫治療效果。

3 mRNA激發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)

注射mRNA疫苗后，編碼的蛋白質(zhì)將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)。該過(guò)程類(lèi)似于RNA病毒感染的自然過(guò)程及其連續(xù)誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。外源mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后會(huì)發(fā)生與內(nèi)源性mRNA相似的反應(yīng)——mRNA在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)翻譯后修飾通過(guò)靶向序列或跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)入亞細(xì)胞間隔，比如分泌途徑、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體或過(guò)氧化物酶體［34］。因此，遞送外源mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)對(duì)于抗原的表達(dá)至關(guān)重要，但這個(gè)過(guò)程是通過(guò)胞內(nèi)體途徑還是通過(guò)質(zhì)膜直接進(jìn)入尚未研究透徹［35］。

3.1 mRNA腫瘤疫苗誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)

3.1.1 免疫細(xì)胞識(shí)別

外源性mRNA通常被認(rèn)為是具有免疫原性的，表現(xiàn)為類(lèi)似RNA病毒特性，通過(guò)TLR激活先天免疫細(xì)胞［7，36］。TLR屬于固有免疫反應(yīng)PRR的一組，作為病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的“感受 器”檢測(cè)PAMP。mRNA可被抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）識(shí)別，激活TLR，如TLR3、TLR7和TLR8［37］，一旦TLR感應(yīng)到PAMP，就會(huì)通過(guò)連續(xù)激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答來(lái)啟動(dòng)先天免疫應(yīng)答［38］，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），干 擾 素α（interferon-α，IFN-α），白介素-6（interleukin-6，IL-6），干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)蛋白10和APC（如DC）上的共刺激分子［39］。最終導(dǎo)致適應(yīng)性B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生［38］。TLR7由B細(xì)胞［40］、巨噬細(xì)胞和DC［41］表達(dá)，并且可以檢測(cè)單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）。因此，B細(xì)胞通過(guò)MYD88/TLR7依賴性信號(hào)通路快速激活，為調(diào)節(jié)mRNA疫苗誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答提供刺激。此外，TLR7信號(hào)傳導(dǎo)增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加抗原呈遞并改善記憶B細(xì)胞存活［35］。

3.1.2 非免疫細(xì)胞識(shí)別

在非免疫細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）樣 受 體（RIG-I like receptor，RLR）和黑色素瘤分化相關(guān)基因（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）感知外源mRNA并介導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生［19，40，42-43］，進(jìn)而招募先天免疫細(xì)胞，如DC和巨噬細(xì)胞到mRNA注射部位［42］。雖然早期誘導(dǎo)強(qiáng)大細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)提高疫苗效力來(lái)說(shuō)是有利的，但由于細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致自身免疫等嚴(yán)重的全身副作用，或削弱mRNA疫苗的免疫應(yīng)答使得腫瘤疫苗不能完全發(fā)揮抗腫瘤免疫作用（圖2）。有研究表明，在慢性感染發(fā)生時(shí)，IFN-Ⅰ應(yīng)答保持不變，產(chǎn)生的多種下游效應(yīng)與持續(xù)的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)和其他免疫調(diào)節(jié)機(jī)制（如共抑制受體、免疫抑制細(xì)胞因子的表達(dá)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的增加）相結(jié)合，這會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞反應(yīng)功能障礙，也稱為T(mén)細(xì)胞耗竭。因此人們?cè)趍RNA疫苗技術(shù)中尋求用不同的方法來(lái)將IFNⅠ等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)降至最低。例如，Miao等［15］提出，加入不飽和脂質(zhì)尾部、二氫咪唑接頭和環(huán)胺頭部基團(tuán)的mRNA，可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)干擾素基因（stimulator of interferon genes，STING）途徑而不是TLR途徑激活A(yù)PC，從而減少細(xì)胞因子的表達(dá)，降低由于細(xì)胞因子引起的自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的副作用，提高抗腫瘤效果。

綜上所述，對(duì)于外源mRNA的先天感應(yīng)可能導(dǎo)致mRNA翻譯停滯、mRNA降解以及連續(xù)的次要抗原特異性免疫反應(yīng)［43］，這些表明在mRNA接種后先天免疫和獲得性免疫之間存在密切聯(lián)系。

3.2 mRNA腫瘤疫苗誘導(dǎo)獲得性免疫

3.2.1 抗原呈遞

在注射mRNA疫苗后，其編碼的蛋白質(zhì)將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)，并激發(fā)獲得性免疫。mRNA編碼的蛋白質(zhì)被翻譯后通過(guò)微吞飲、內(nèi)吞或吞噬作用被APC（如DC）攝?。?4］，可能形成含有抗原蛋白的吞噬小體或內(nèi)小體［45］，通過(guò)DC上的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHC-Ⅰ）和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHC-Ⅱ）提呈。APC可以將外源抗原通過(guò)MHC-II呈遞給CD4+T細(xì)胞，并在MHCI上交叉呈遞給CD8+T細(xì)胞。由此產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)稱為交叉激發(fā)。CD4+T細(xì)胞為B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞提供幫助。最后，抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增導(dǎo)致靶細(xì)胞消除。此外，所有有核細(xì)胞都有能力去處理mRNA并在MHC-Ⅰ上呈遞翻譯的蛋白質(zhì)或多肽，但只有APC能夠在MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ上呈遞，進(jìn)而誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)（圖3）。此外，DC可以內(nèi)化活細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜物質(zhì)來(lái)啟動(dòng)T細(xì)胞反應(yīng)［46］。

3.2.2抗原分類(lèi)

為了誘導(dǎo)獲得性免疫，需要將特定的抗原提呈給免疫細(xì)胞。mRNA腫瘤疫苗通常編碼TAA，這些抗原在癌細(xì)胞上優(yōu)先表達(dá)。對(duì)這些腫瘤來(lái)源的抗原進(jìn)行分類(lèi)，可以細(xì)分為：a.組織分化抗原如人類(lèi)癌胚抗原（human carcinoembryonic antigen，CEA）或MART-1，也可在健康組織上表達(dá)；b.腫瘤種系（睪丸癌）抗原（例如NY-ESO-1或MAGE-3）；c.腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）；d.病毒蛋白（如EBV、HPV）；e.腫瘤特 異 性 突 變 抗 原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）［47-48］?；虍惓Ｊ悄[瘤發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素［49］。體細(xì)胞突變可能產(chǎn)生新抗原表位，這些表位是腫瘤衍生的肽并且可以與MHC結(jié)合［50］并被T細(xì)胞識(shí)別，因此編碼新抗原的mRNA疫苗被認(rèn)為是最佳的腫瘤疫苗候選［49］。同樣，識(shí)別這些抗原的T細(xì)胞在過(guò)繼轉(zhuǎn)移或免疫檢查點(diǎn)抑制后介導(dǎo)臨床反應(yīng)［51］。且有研究表明含有較高新抗原表位負(fù)荷的腫瘤，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和錯(cuò)配修復(fù)缺陷的結(jié)直腸癌，都對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑有較好的反應(yīng)［52］。

3.2.3 免疫效應(yīng)

基于多肽的疫苗受到MHC限制，而mRNA疫苗允許組合編碼不同抗原的mRNA。mRNA電穿孔的樹(shù)突狀細(xì)胞具有多種MHC-I和MHC-II限制性多肽，并能誘導(dǎo)多克隆的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。CD4+輔助T細(xì)胞對(duì)于有效誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和B細(xì)胞應(yīng)答非常重要［53］，并且mRNA疫苗在存在輔助表位時(shí)可以進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答。將mRNA導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞后，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)是由自噬介導(dǎo)的［54］。最后，疫苗組合物中可以包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的mRNA，可以進(jìn)一步提高其效力。綜上所述，編碼兩個(gè)或更多蛋白質(zhì)或長(zhǎng)肽的mRNA疫苗可以實(shí)現(xiàn)廣泛的多克隆免疫反應(yīng)，避免了對(duì)某些MHC分子的限制和由于抗原丟失而導(dǎo)致的免疫逃逸風(fēng)險(xiǎn)。

應(yīng)用編碼突變抗原表位的mRNA可產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗原特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)和有效持久的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤消退。Kreiter等［55-56］證明，大多數(shù)腫瘤特異性突變是由CD4+T細(xì)胞識(shí)別的，這種細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。CD4+T細(xì)胞應(yīng)答主要由一種以Th1為主的免疫應(yīng)答以及由CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ組成。對(duì)于這種強(qiáng)烈的Th1反應(yīng)，不同的研究試圖利用mRNA疫苗作為工具來(lái)調(diào)節(jié)Th分化。例如，對(duì)于Ⅱ型免疫反應(yīng)（其特征是分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13和過(guò)敏原特異性IgE），應(yīng)用了mRNA疫苗從而減少了過(guò)敏性輔助T細(xì)胞（T helper 2，Th2）反應(yīng)。

除了誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫外，mRNA疫苗還誘導(dǎo)中和抗體。T濾泡輔助細(xì)胞（T follicular helper，Tfh）不僅對(duì)生發(fā)中心（germinal center，GC）的發(fā)生至關(guān)重要，還驅(qū)動(dòng)免疫球蛋白類(lèi)的轉(zhuǎn)換、親和力成熟和持久的B細(xì)胞記憶反應(yīng)。盡管Tfh的確切機(jī)制尚未清楚，但這種細(xì)胞會(huì)被mRNA疫苗激活，然后產(chǎn)生足夠數(shù)量、有效和持久的中和抗體［57］。Pardi等［58］將脂質(zhì)納米顆粒包裹的mRNA疫苗用于皮下注射，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生抗原特異性CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞反應(yīng)以及高效的中和抗體。疫苗的接種方式?jīng)Q定了抗原表達(dá)的持續(xù)時(shí)間（肌肉注射較皮內(nèi)注射表達(dá)的時(shí)間長(zhǎng)），持續(xù)的抗原表達(dá)導(dǎo)致高抗體滴度以及生發(fā)中心B細(xì)胞和Tfh反應(yīng)［59］。

4 mRNA疫苗的抗腫瘤免疫應(yīng)答策略

多種技術(shù)可以改善mRNA的傳遞、組成、免疫原性或可譯性。然而，大多數(shù)腫瘤疫苗試驗(yàn)很難在晚期或難治性腫瘤患者中發(fā)揮作用，其中，主要原因是無(wú)法高效誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)。TAA是一種非突變自身抗原，通常能誘導(dǎo)中樞T細(xì)胞耐受［60］。所以針對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)需要考慮幾個(gè)具體的因素：疫苗應(yīng)用的最佳時(shí)機(jī)、靶抗原的選擇、與免疫佐劑的聯(lián)用、對(duì)腫瘤微環(huán)境的改變以及與其他腫瘤治療結(jié)合（圖4）。這些策略可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同甚至相加的抗腫瘤效果。

4.1 疫苗應(yīng)用時(shí)機(jī)

腫瘤疫苗通常在腫瘤達(dá)到一定大小或已經(jīng)轉(zhuǎn)移時(shí)使用。這時(shí)癌細(xì)胞與免疫系統(tǒng)進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的“互動(dòng)”，可能已經(jīng)形成了逃離免疫系統(tǒng)的機(jī)制，并削弱了疫苗誘導(dǎo)的抗癌免疫的治療效果［61］。因此，為提高mRNA疫苗治療效果，應(yīng)在疾病的早期階段（如輔助治療期間）應(yīng)用。如在一項(xiàng)隨機(jī)的II期臨床試驗(yàn)中，招募黑色素瘤術(shù)后且無(wú)復(fù)發(fā)的患者，進(jìn)行自體DC遞送編碼TriMix的mRNA和編碼4種TAA（MAGE-A3、MAGE-C2、酪 氨 酸 酶 或gp100）之一的mRNA共電穿孔治療并與HLA II類(lèi)靶向信號(hào)相關(guān)的療效［62-63］。這種治療耐受性良好，提高了患者1年無(wú)病存活率。研究者提出，與CPI聯(lián)合治療或靶向治療可能會(huì)進(jìn)一步提高高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者的存活率［63］。

4.2 靶抗原選擇

腫瘤患者個(gè)體間的異質(zhì)性會(huì)阻礙有效的免疫誘導(dǎo)，使產(chǎn)生的腫瘤免疫反應(yīng)明顯不同。腫瘤累積了數(shù)以千計(jì)的基因組突變，其中一小部分會(huì)產(chǎn)生新的抗原表位，這些表位可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別，并抑制腫瘤生長(zhǎng)。下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的進(jìn)步可破譯腫瘤患者的基因組、外顯子組和轉(zhuǎn)錄組，從而針對(duì)腫瘤患者的個(gè)體免疫原性突變構(gòu)建個(gè)性化mRNA疫苗，并實(shí)現(xiàn)快速大量生產(chǎn)，極大地推動(dòng)了個(gè)性化腫瘤治療的進(jìn)展［64-65］。

4.3 免疫佐劑聯(lián)用

在mRNA疫苗系統(tǒng)中添加免疫佐劑可以增強(qiáng)mRNA疫苗的免疫原性。如用諾華公司生產(chǎn)的佐劑MF59和陽(yáng)離子納米乳劑（cationic nanoemulsion，CNE）配制的自擴(kuò)增RNA疫苗，在各種動(dòng)物模型中被證明可以增強(qiáng)mRNA疫苗的免疫原性和有效性［7，66］。某些免疫調(diào)節(jié)分子也具有佐劑活性。TriMix是布魯塞爾大學(xué)開(kāi)發(fā)的一種新的佐劑策略，由編碼三種免疫激活蛋白的mRNA組成CD70、CD40配 體（CD40L）和TLR4［30，62，67］。TriMix mRNA可以增加裸露的、未修飾的、未純化的mRNA的免疫原性，它還與增強(qiáng)DCs的成熟度和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)［67］。2018年，Leal等［68］采用TriMix裸體mRNA策略治療獲得性免疫缺陷綜合征 （acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者。使用大劑量TriMix mRNA的治療表明，可以刺激和檢測(cè)到高的人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）特異性T細(xì)胞反應(yīng)。這項(xiàng)研究已經(jīng)證明了這種策略的高度安全性和耐受性。CureVac公司還開(kāi)發(fā)了具有所謂自佐劑活性的RNActive?疫苗。它們只包含有體外轉(zhuǎn)錄的mRNA和魚(yú)精蛋白復(fù)合的絡(luò)合物［69-70］。這種遞送的mRNA尤其增強(qiáng)了B和T細(xì)胞反應(yīng)，包括T細(xì)胞效應(yīng)和記憶反應(yīng)，以及Th1和Th2細(xì)胞和GC B細(xì)胞等亞群的擴(kuò)張［42，69］。在臨床前模型中，RNActive?疫苗可有效預(yù)防不同的流感病毒株，并顯示出抗腫瘤效果［42，70-72］。疫苗可有效預(yù)防不同的流感病毒株，并顯示出抗腫瘤效果［72-73］。

4.4 改變腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中存在的幾個(gè)免疫細(xì)胞是免疫抑制環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生以及血管生成和轉(zhuǎn)移［74］。其中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）可被認(rèn)為是在TME中發(fā)現(xiàn)的最豐富的非腫瘤細(xì)胞且TAMs對(duì)環(huán)境刺激有顯著的反應(yīng)潛力，許多研究表明，TAMs的調(diào)節(jié)可以誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)［75-78］。已有研究表明，使用IVT mRNA編碼TAMs［79］，通過(guò)CAR-T納米顆粒技術(shù)將其送入腫瘤內(nèi)，可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)DCs（tumor-associated DCs，TADC）的局部調(diào)節(jié)［80］。TME中腫瘤細(xì)胞與各種免疫組分的相互作用可以顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)免疫抑制蛋白如程序性死亡配體1（PD-L1）、產(chǎn)生免疫抑制因子如IL-10和趨化因子、招募免疫抑制細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞來(lái)進(jìn)行免疫逃逸，這種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境導(dǎo)致T細(xì)胞的無(wú)能和耗盡，從而延長(zhǎng)了腫瘤細(xì)胞的存活期［61，81］。因此，理想的腫瘤疫苗可以改善局部免疫細(xì)胞組成，恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)視。免疫檢查點(diǎn)已被證明能影響腫瘤微環(huán)境的結(jié)構(gòu)，并且有重新激活和擴(kuò)大原有T細(xì)胞或誘導(dǎo)新的抗癌免疫反應(yīng)的潛力［82］。免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠維持一次誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并防止T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物的上調(diào)，這使它們成為mRNA疫苗的有效伴侶［83］。例如，免疫檢查點(diǎn)抑制劑與編碼Trp2的mRNA疫苗相結(jié)合，在C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤模型中誘導(dǎo)了強(qiáng)大的TAA特異性免疫反應(yīng)，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)［83］。在這個(gè)模型中，PD-L1 siRNA和mRNA疫苗的聯(lián)合傳遞下調(diào)了抗原呈遞DC中PD-L1的表達(dá)，從而增加了T細(xì)胞的激活和增殖［83］。

5 mRNA腫瘤疫苗臨床研究進(jìn)展

mRNA經(jīng)DC遞送的疫苗是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的mRNA治療性腫瘤疫苗［30］。目前基于IVT mRNA的疫苗主要分為3部分，mRNA編碼免疫刺激劑、TAA和TSA。在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中，mRNA腫瘤疫苗已被應(yīng)用于治療侵襲性、難治性和轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤，并進(jìn)一步與檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑或細(xì)胞因子結(jié)合以增強(qiáng)抗腫瘤效果。這一部分綜述了mRNA編碼的免疫刺激劑、腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異性抗原腫瘤疫苗在臨床的應(yīng)用，以及討論個(gè)性化疫苗和帶有檢查點(diǎn)阻斷調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合免疫療法的優(yōu)勢(shì)。

mRNA編碼的免疫刺激劑通常是細(xì)胞因子或趨化因子，它們誘導(dǎo)APC成熟和并激活A(yù)PC，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，并調(diào)節(jié)功能失調(diào)的免疫腫瘤微環(huán)境。已經(jīng)被用來(lái)編碼免疫刺激劑的mRNA，目前大多數(shù)評(píng)估處于I/II階段，并評(píng)估單一治療或與其他藥物（包括PD-1/PD-L1抗體或腫瘤疫苗）聯(lián)合治療的耐受性（表1）。

抗原選擇是開(kāi)發(fā)有效的腫瘤疫苗的基礎(chǔ)。腫瘤疫苗可以被設(shè)計(jì)成針對(duì)在惡性腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的TAA。例如，酪氨酸酶、gp100、MAGE-A3、MAGE-C2已被確定為黑色素瘤的TAA。在多項(xiàng)臨床研究中，編碼所有TAA的mRNA疫苗已經(jīng)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（表2）。

多種因素限制了TAA疫苗的廣泛應(yīng)用，如：a.僅在某些實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)有限的TAA，從而限制了其應(yīng)用；b.TAA具有廣泛的變異性，導(dǎo)致免疫效應(yīng)逃逸和產(chǎn)生耐藥性；c.正常組織中也存在TAA。針對(duì)TAA的疫苗可能會(huì)引發(fā)中樞和外周免疫耐受反應(yīng)，從而降低疫苗接種效率。腫瘤特異性抗原，又稱為新抗原，是目前mRNA疫苗的核心靶點(diǎn)。新抗原來(lái)源于腫瘤細(xì)胞中的隨機(jī)體細(xì)胞突變，而正常細(xì)胞中不存在。新抗原可以被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別為一個(gè)“非我”組分，因此是腫瘤疫苗的一個(gè)顯著靶點(diǎn)［84］。開(kāi)發(fā)個(gè)性化新抗原疫苗最關(guān)鍵的的一步是鑒定和確認(rèn)患者腫瘤中表達(dá)的特異性免疫原性非同義體細(xì)胞突變。首先進(jìn)行腫瘤組織活檢。腫瘤組織的活檢是為了進(jìn)行完整的外顯子組、RNA或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?？梢酝ㄟ^(guò)比較腫瘤和匹配的健康組織的序列來(lái)識(shí)別腫瘤中的非同義體細(xì)胞突變，如點(diǎn)突變和插入缺失。接著使用MHC-Ⅰ類(lèi)表位預(yù)測(cè)算法篩選、分析和鑒定具有最高免疫原性的突變。進(jìn)一步確認(rèn)候選抗原的排序列表?；谛驴乖膫€(gè)性化疫苗可以針對(duì)各種類(lèi)型的變異突變［84］（表3）。

Table 1 Clinical trials of mRNA encoding an immunostimulant表1編碼免疫刺激劑的mRNA的臨床試驗(yàn)

Table 2 Clinical trials of mRNA encoding TAAs表2編碼TAAs的mRNA的臨床試驗(yàn)

Table 3 Clinical trials of mRNA encoding neo-antigen(Neo-Ag)表3編碼新抗原（Neo-Ag）mRNA的臨床試驗(yàn)

續(xù)表3

6 安全與挑戰(zhàn)

直到2020年，世界上還沒(méi)有批準(zhǔn)單一的mRNA疫苗治療方案。自新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情爆發(fā)以來(lái)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的不同mRNA疫苗，證明mRNA疫苗針對(duì)新出現(xiàn)的傳染病大流行具有快速有效的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。然而，與傳染病類(lèi)疫苗針對(duì)明確抗原的預(yù)防性接種不同，大多數(shù)腫瘤靶標(biāo)抗原表現(xiàn)出高度的個(gè)體間異質(zhì)性，且數(shù)量有限、特征不明顯，mRNA腫瘤疫苗安全性、有效性問(wèn)題顯得尤為突出。開(kāi)發(fā)腫瘤疫苗的另一挑戰(zhàn)在于抗癌治療性疫苗需要激活MHC-Ⅰ介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，這進(jìn)一步增加了有效抗腫瘤免疫的難度。作為一種治療性腫瘤疫苗，需要較大用藥劑量、且多次重復(fù)給藥。治療性腫瘤疫苗需要對(duì)mRNA的生產(chǎn)有更高的安全性標(biāo)準(zhǔn)［85］。

mRNA疫苗的安全性體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。a.mRNA腫瘤疫苗可以同時(shí)編碼多種抗原，具有非整合性、高度可降解性、無(wú)插入誘變潛力等特點(diǎn)。b.IVT產(chǎn)生的mRNA不含細(xì)胞和致病病毒成分，沒(méi)有感染的可能性，在正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中測(cè)試的大多數(shù)mRNA疫苗通常耐受性良好，很少出現(xiàn)注射部位免疫反應(yīng)［86］。全身性炎癥也可以通過(guò)去除dsRNA等污染物或改變給藥途徑等方式將先天免疫反應(yīng)限制在局部注射部位。由于I型干擾素反應(yīng)的激活可能與自身免疫有關(guān)，所以在mRNA疫苗接種之前必須評(píng)估個(gè)體自身免疫反應(yīng)增加的風(fēng)險(xiǎn)［25］。c.mRNA腫瘤疫苗的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)速度快。成熟的mRNA制造技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出新型疫苗。最近新抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定促進(jìn)了個(gè)性化疫苗治療的發(fā)展。mRNA疫苗先驅(qū)BioNTech和Moderna領(lǐng)導(dǎo)的治療實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)展示了個(gè)性化疫苗強(qiáng)大的抗腫瘤免疫功能［87］，開(kāi)啟了治療性腫瘤疫苗的新紀(jì)元。為了進(jìn)一步提高mRNA疫苗的抗癌效力，應(yīng)當(dāng)聯(lián)合使用特定佐劑、CPIs、T細(xì)胞激活單克隆抗體、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（如細(xì)胞因子）或聯(lián)合放射治療或化療，以克服免疫逃逸機(jī)制以提高疫苗效力。目前有多項(xiàng)以評(píng)估m(xù)RNA疫苗與其他腫瘤療法的聯(lián)合應(yīng)用療效的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。這些臨床試驗(yàn)有助于發(fā)現(xiàn)更安全、更高效的抗腫瘤療法，以提高腫瘤患者的生存質(zhì)量。

綜上所述，mRNA是一種功能強(qiáng)大、用途廣泛的腫瘤疫苗治療方式，有望顯著提高腫瘤臨床治療效果。未來(lái)的研究應(yīng)集中（但不限于）解決mRNA矛盾的免疫原性、設(shè)計(jì)先進(jìn)和可耐受的遞送系統(tǒng)，來(lái)提高抗原表達(dá)和提呈的效率，以及優(yōu)化mRNA的結(jié)構(gòu)以達(dá)到延長(zhǎng)和控制表達(dá)持續(xù)時(shí)間的目的。此外，應(yīng)繼續(xù)發(fā)展腫瘤個(gè)性化疫苗，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。