劉 櫻 熊忠華 夏斌元 陳 珊

（中國工程物理研究院材料研究所，綿陽 621907）

在真核生物中，脫氧核糖核酸（DNA）與組蛋白結(jié)合形成核小體，構(gòu)成染色質(zhì)的功能單位，而DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，DSB）是電離輻射引起DNA損傷的主要形式。當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生斷裂時(shí)，在斷裂位點(diǎn)將出現(xiàn)組蛋白H2AX在39位絲氨酸（γ-H2AX）的磷酸化。磷酸化的γ-H2AX在DSB位點(diǎn)累積，同時(shí)募集多種參與DNA損傷修復(fù)的分子，形成修復(fù)灶，共同參與早期DNA損傷修復(fù)。利用抗磷酸化γ-H2AX的抗體檢測，可建立電離輻射與磷酸化γ-H2AX焦點(diǎn)之間的關(guān)系［1-2］。1998年，Rogakou等［3］首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了γ-H2AX可作為細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的快速又敏感的信號分子，隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量在電離輻射發(fā)生大約30 min后達(dá)到峰值，在24 h內(nèi)迅速下降并在幾天內(nèi)下降到基線水平，具體時(shí)間取決于相應(yīng)的輻射劑量，焦點(diǎn)數(shù)量也與輻射劑量相關(guān)［4-5］。采用γ-H2AX焦點(diǎn)法進(jìn)行劑量估算需在放射后1~2 d內(nèi)進(jìn)行，這也使其成為目前時(shí)效性最高的輻射生物標(biāo)志物之一。因此，近年來，γ-H2AX檢測技術(shù)在快速輻射劑量估算、輻射應(yīng)急分診等方面的應(yīng)用價(jià)值被國內(nèi)外廣泛重視，尤其在精準(zhǔn)化、小型化、高通量化等方面開展了諸多研究工作。

1 γ-H2AX常用檢測技術(shù)

目前，γ-H2AX的檢測方法主要包括免疫熒光法（熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)）、酶聯(lián)免疫吸附測定法和免疫印跡法等，以上方法均基于免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，其原理為用標(biāo)記的抗磷酸化γ-H2AX的抗體對目標(biāo)細(xì)胞的磷酸化γ-H2AX進(jìn)行定性、定位或定量檢測。

1.1 免疫熒光法

免疫熒光法主要利用γ-H2AX單克隆抗體作為一抗，與細(xì)胞內(nèi)DSB位點(diǎn)處的γ-H2AX特異性結(jié)合，再加入標(biāo)記有熒光素的二抗，與一抗形成夾心結(jié)構(gòu)，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)采集熒光信號，即可分析目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX含量（圖1）。熒光顯微鏡觀察是最直觀且最便捷的檢測技術(shù)，既可以對細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)計(jì)數(shù)，又可定性獲得其熒光強(qiáng)度大小，從而比較不同劑量下細(xì)胞內(nèi)的γ-H2AX含量，但該方法存在主觀誤差，使得其準(zhǔn)確度不高，目前已開發(fā)有多種圖像分析軟件對獲得的熒光圖像進(jìn)行分析，可減少人為誤差并節(jié)約時(shí)間，提高準(zhǔn)確性。而流式細(xì)胞術(shù)可實(shí)現(xiàn)大批量樣本中γ-H2AX的測定。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。用于檢測γ-H2AX的主要原理是以γ-H2AX的單克隆抗體作為γ-H2AX捕獲抗體，組裝在固相載體（如聚苯乙烯微量反應(yīng)板）上，當(dāng)含γ-H2AX的標(biāo)本被捕獲后，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的檢測抗體，形成夾心結(jié)構(gòu)。再加入酶標(biāo)底物（即TMB溶液）和終止液即可通過在450 nm波長處測吸光度（A）值獲得標(biāo)本中γ-H2AX的含量（圖2）。無論在定量分析精確度上，還是標(biāo)本處理流程上，ELISA都較熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)更具優(yōu)勢，且可采用酶標(biāo)儀和96孔板進(jìn)行高通量測定，因此，近年來也被廣泛用于γ-H2AX的測定。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法

蛋白質(zhì)免疫印跡是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）上形成印跡膜，印跡膜上的目標(biāo)蛋白可以被特異性抗體識別并捕獲。同時(shí)，利用酶或同位素標(biāo)記的二抗作為信標(biāo)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影可對被捕獲的目標(biāo)蛋白進(jìn)行信號示蹤（圖3）。

2 γ-H2AX檢測技術(shù)進(jìn)展

γ-H2AX的檢測結(jié)果可反映出DSB損傷修復(fù)情況，其具有檢測周期短、特異性與靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)，可滿足輻射劑量估算和輻射應(yīng)急分診的應(yīng)用需求。目前，改進(jìn)γ-H2AX檢測技術(shù)，主要涉及減少采樣量和檢測時(shí)間、借助新型顯微鏡技術(shù)、傳統(tǒng)技術(shù)改進(jìn)、檢測自動(dòng)化以及其他增強(qiáng)檢測效果的方法等，目的均為盡可能在更短時(shí)間、更少樣品量和更高通量的情況下獲得更清晰的檢測結(jié)果。

2.1 樣品量

輻射事故后，為盡早對受照人群進(jìn)行初步劑量估計(jì)和早期分診，需要在同一時(shí)間內(nèi)對盡可能多的樣本進(jìn)行快速評估，因此檢測時(shí)所需的樣品量及其處理時(shí)間十分關(guān)鍵。常規(guī)檢測方法需要從裝有若干毫升體積血液樣品的肝素管中，通過Ficoll密度梯度離心法獲得足夠多的淋巴細(xì)胞，再進(jìn)行隨后的洗滌、分離和固定步驟。Sowa等［6］比較了經(jīng)靜脈穿刺和Ficoll密度梯度離心獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和指尖毛細(xì)管血中分離的單個(gè)核細(xì)胞（capillary blood mononuclear cells，CBMCs），同時(shí)利用間接免疫熒光法分析γ-H2AX焦點(diǎn)情況，發(fā)現(xiàn)CBMCs可替代PBMCs用于DSB分析。而Wojewodzka等［7］通過改變樣品處理參數(shù)來評估其對γ-H2AX焦點(diǎn)的影響，并優(yōu)化出一種理論上可應(yīng)用于指尖血的微量測定方案。Moquet等［8］已開發(fā)出一種檢測方法，只需少于0.1 ml的血液樣品，在理論上也可以實(shí)現(xiàn)手指穿刺取樣。該方法可將96個(gè)樣品的處理時(shí)間從常規(guī)方法的15 h減少為約4 h。但是需要犧牲細(xì)胞數(shù)和焦點(diǎn)清晰度。Heylmann和Kaina［9］則通過將指尖血注入肝素化的微量紅細(xì)胞壓積玻璃毛細(xì)管中，然后將其涂抹于玻片上，即可實(shí)現(xiàn)分析一滴血液中的γ-H2AX焦點(diǎn)來檢測DNA損傷，該方法簡單、快速、廉價(jià)，允許大量的血液采樣和長期存儲(chǔ)，適用于人類和動(dòng)物群體中遺傳損傷的快速和大規(guī)模篩選。Johnston等［10］開發(fā)了一種不需要對血液樣品進(jìn)行過濾、富集或純化的全血免疫分析方法，分析結(jié)果在0~5 Gy的劑量范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，理論上可以將這種分析從實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到野外。

2.2 超分辨顯微鏡技術(shù)

通過光學(xué)檢測在單細(xì)胞水平上評估電離輻射暴露后的DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)動(dòng)力學(xué)，是γ-H2AX檢測技術(shù)中常用的方法之一。近年來，借助新型超分辨顯微鏡技術(shù)，可以在納米尺度上研究電離輻射在單細(xì)胞中的分子效應(yīng)［11］。在生物標(biāo)本中，納米標(biāo)記的分子結(jié)構(gòu)可以精確到10 nm（可見光波長的1/50），這屬于單個(gè)核小體、抗體、受體等的范圍。而單分子定位顯微鏡（single molecule localization microscopy，SMLM）是目前最流行的超分辨技術(shù)之一。大多數(shù)單分子定位顯微鏡方法依賴于單個(gè)熒光團(tuán)分子的隨機(jī)光譜調(diào)制，如光活化定位顯微鏡（photo-activated localization microscopy，PALM）、熒光PALM（fluorescence PALM，F(xiàn)PALM）、隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）、直 接STORM（direct STORM，dSTORM）、基態(tài)耗盡顯微鏡（ground state depletion microscopy followed by individual molecule return，GSDIM）等。最近的大多數(shù)研究主要集中在對暴露于不同劑量γ射線輻射并在輻射暴露后不同時(shí)間點(diǎn)固定的細(xì)胞中，γ-H2AX特異性抗體進(jìn)行SMLM研究［12-16］。

2.3 圖像分析軟件

提高光學(xué)檢測水平可以更深入地對DNA損傷機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)科學(xué)研究，但這些超分辨顯微鏡的使用會(huì)不同程度增加檢測成本和時(shí)間，并不適用于現(xiàn)場和快速檢測。而對獲得的熒光圖像進(jìn)行準(zhǔn)確地自動(dòng)圖像分析則不僅可以縮短分析時(shí)間，也可減少人為誤差。使用圖像處理和分析的自動(dòng)γ-H2AX分析已被證明比人工分析的準(zhǔn)確度和平行性高，因?yàn)槿斯し治霾荒芴峁┲T如核的大小或焦點(diǎn)的強(qiáng)度等額外信息［17-18］。焦點(diǎn)的量化和表征理論上需要統(tǒng)計(jì)大量的細(xì)胞來確保結(jié)果的可信度，因此這需要利用合適的圖像分析軟件，例如包含有圖像預(yù)處理和轉(zhuǎn)換、有效信息的提取，以便進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析［18］。目前，已開發(fā)有多種基于顯微鏡圖像的開源或閉源的自動(dòng)分析軟件，包括ImageJ［19-20］、DeepFoci［21］、CellProfiler［22-24］、FociCounter［25］、FoCo［26］、FocAn［27］等，均能對基于γ-H2AX的細(xì)胞圖像進(jìn)行分析。開源軟件相較閉源軟件，因其具有可訪問的源代碼，使得用戶可根據(jù)特定的需求對參數(shù)進(jìn)行修改；分析過程透明可視化；免費(fèi)提供給科研工作者使用等優(yōu)點(diǎn)，成為許多科研工作中優(yōu)先考慮使用的軟件。表1比較了幾種常用圖像分析軟件所具備的功能，ImageJ和CellProfiler可提供多種插件，進(jìn)行批量處理，同時(shí)可獲得逐步分析的結(jié)果；DeepFoci和FocAn可分析共聚焦顯微鏡獲得的3D多通道數(shù)據(jù)，從而分析三維立體結(jié)構(gòu)下的焦點(diǎn)分布情況；FociCounter僅可獲得焦點(diǎn)及焦點(diǎn)強(qiáng)度等簡單數(shù)據(jù)，但軟件分析操作較為直觀簡潔。基于圖像分析軟件獲得的結(jié)果會(huì)因參數(shù)設(shè)置的不同而存在明顯差異，后續(xù)研究中需要建立統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)。

Table 1 Comparison of image analysis software functions表1圖像分析軟件功能比較

2.4 檢測新技術(shù)

成像流式細(xì)胞術(shù)（imaging flow cytometry，IFC）將光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合，使研究人員在快速分析大量細(xì)胞的同時(shí)，可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果輔證分析結(jié)果。Lee等［28］開發(fā)出一種基于成像流式細(xì)胞術(shù)的快速、高通量γ-H2AX檢測方法，用于評估電離輻射暴露后人外周血細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)動(dòng)力學(xué)，結(jié)果分析與已有文獻(xiàn)的理論曲線相符［5］?；诔上窳魇郊?xì)胞術(shù)建立的γ-H2AX檢測方法可以提供一個(gè)高通量的實(shí)用平臺(tái)，通過預(yù)測個(gè)體放射敏感性和與放療相關(guān)的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療。

對于像磷酸化組蛋白γ-H2AX這類特定蛋白質(zhì)的相對定量分析，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡法都需要先將細(xì)胞裂解后提取總蛋白質(zhì)方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附法（cell enzyme-linked immunosorbent assay，cell-ELISA）和細(xì)胞內(nèi)免疫印跡法（in cell Western，ICW）則無需裂解細(xì)胞，而是在細(xì)胞原位檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)，相較于傳統(tǒng)方法，省略了前期細(xì)胞裂解物的制備、制膠、電泳以及轉(zhuǎn)膜等費(fèi)時(shí)又易出錯(cuò)的步驟，也極大減少了因裂解細(xì)胞獲取總蛋白質(zhì)時(shí)造成的損失，具有特異、靈敏及操作簡便等特點(diǎn)。Matsuzaki等［29］和Tronnet等［30］分別利用這兩種方法對檢測γ-H2AX進(jìn)行了嘗試，并建立了一套靈敏便捷的檢測方法。

近年來，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（high liquid chroma-tography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對γ-H2AX磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行定量檢測，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX定量分析，該方法于2015年由Matsuda等［31］建立，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所謝劍煒研究員課題組［32］亦建立和評估了γ-H2AX質(zhì)譜定量檢測技術(shù)在細(xì)胞基因毒性方面的應(yīng)用，并獲得了DNA損傷及修復(fù)動(dòng)力學(xué)曲線，在化合物的基因毒性測試中顯示了可行性及優(yōu)越性。

3 自動(dòng)化/便攜式設(shè)備研制

改進(jìn)生物劑量估算方法的檢測速度和效率，有助于在出現(xiàn)放射性事故時(shí)提高救援速率，保存有限醫(yī)療資源，遏制大規(guī)模的恐慌。因此需要研制出可快速自動(dòng)甚至便攜式的生物劑量估算系統(tǒng)，用以評估可能的大量個(gè)人輻射照射劑量。

現(xiàn)有的商品化的自動(dòng)化免疫熒光分析及顯微系統(tǒng)如AKLIDES［33］、Europattern［34］和Nova View［35］等，均可在一定程度上實(shí)現(xiàn)γ-H2AX生物劑量測定部分自動(dòng)化，從而縮短時(shí)間，提高效率。Garty等［36-39］研制出一種基于機(jī)器人的自動(dòng)生物劑量檢測 工 具 （rapid automated biodosimetry tool，RABIT），利用多種先進(jìn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了γ-H2AX生物劑量測定從樣品分離到熒光成像全流程自動(dòng)化。測試結(jié)果表明，RABiT可在18 h工作周期內(nèi)完成對5 859個(gè)生物樣本的測定。而針對現(xiàn)場輻射劑量生物測定，Bensimon Etzol等［40-42］搭建了一種可操作和便攜移動(dòng)的生物劑量測量設(shè)備DosiKiT，可基于血液和毛囊樣本對輻射受照人群進(jìn)行事故現(xiàn)場測量，從而獲得全身和局部的劑量評估。Zhong等［43］則以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)制作了一種便攜式的集成設(shè)備，簡化了γ-H2AX免疫熒光染色的方案，可在室溫下40 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)γ-H2AX免疫熒光染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈線性劑量響應(yīng)關(guān)系，具有自動(dòng)化、高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。以上三者的比較總結(jié)于表2中。

Table 2 Comparison of automation/portable devices表2自動(dòng)化/便攜式設(shè)備比較

4 總結(jié)與展望

隨著核技術(shù)在國防事業(yè)、能源產(chǎn)業(yè)、農(nóng)林業(yè)及醫(yī)學(xué)診斷治療中越來越廣泛的應(yīng)用，大規(guī)模暴露于電離輻射環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)也在增加。輻射事故應(yīng)急處置要求快速對受照人員進(jìn)行劑量評估，基于DNA損傷的γ-H2AX生物劑量測定方法可在較短時(shí)間內(nèi)對輻照劑量進(jìn)行估算，從而達(dá)到快速篩分受照人群以便于應(yīng)急醫(yī)學(xué)處置的目的。本文總結(jié)了近10年來國內(nèi)外基于電離輻射生物標(biāo)志物γ-H2AX的檢測方法研究進(jìn)展，作為電離輻射生物標(biāo)志物，為縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率，對γ-H2AX檢測過程中的樣品量、自動(dòng)化圖像分析技術(shù)、檢測新技術(shù)等方面，國外學(xué)者均開展了一定深度的研究，國內(nèi)學(xué)者則側(cè)重于方法的應(yīng)用和機(jī)制的研究，在檢測技術(shù)改進(jìn)方面仍存在差距與不足。在快速輻射劑量估算、輻射應(yīng)急分診方面，建立快速準(zhǔn)確，可便攜自動(dòng)化的高通量γ-H2AX生物劑量測定方法是γ-H2AX作為電離輻射生物標(biāo)志物未來最重要的研究方向之一，且具有極高的應(yīng)用潛力。