梁 亮 唐 磊 石華冉 方中岳 歐 霞 楊 帆 張繼虹 楊景暉

（1）昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2）云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032）

惡性腫瘤是目前重大疾病中發(fā)病率最高的疾病。世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)稱，2020年全球有1 930萬(wàn)癌癥新發(fā)病例，近1 000萬(wàn)患者死于癌癥［1］。研發(fā)新型的抗腫瘤藥物一直是推動(dòng)腫瘤針對(duì)性治療的動(dòng)力。溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一類新的治療藥物，通過(guò)選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫的雙重作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。目前已研究了多種病毒，其中常用的病毒包括腺病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小病毒、新城疫病毒、柯薩奇病毒等用作溶瘤治療，且已應(yīng)用于臨床并取得了良好的治療效果［2］。隨著溶瘤病毒的不斷發(fā)展，目前已有4種溶瘤病毒獲批準(zhǔn)上市，分別是：Rigvir?、Oncorine?、Imlygic?和Delytact?。其中最新獲批的Delytact?是日本第一三共株式會(huì)社和東京大學(xué)聯(lián)合開(kāi)發(fā)的一款針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的溶瘤病毒，其是通過(guò)基因工程方法敲除γ34.5、ICP6、α47基因的單純皰疹病毒［3］，該病毒分別減弱了病毒的致病性、加強(qiáng)了靶向性、增強(qiáng)了病毒復(fù)制率，于2021年在日本被厚生勞動(dòng)省批準(zhǔn)上市，成為全球首款針對(duì)腦部腫瘤的溶瘤病毒產(chǎn)品［4］。而自1900年代首次發(fā)現(xiàn)流行性感冒病毒（influenza virus）簡(jiǎn)稱流感病毒，可能作為“有益”的病毒緩解白血病病情以來(lái)，不斷有研究證明其具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。

流感病毒屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），是一類有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，在世界范圍內(nèi)流行。人類在對(duì)抗流感的過(guò)程中做了諸多嘗試，分別成功研發(fā)出了滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位重組等類型的流感疫苗，這些經(jīng)驗(yàn)為進(jìn)一步以流感病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建溶瘤病毒積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)［5］。流感病毒是最早一批用于治療癌癥的病毒，在作為溶瘤病毒方面有著很大的潛力，經(jīng)過(guò)自然選育或反向遺傳學(xué)修飾后可形成對(duì)人致病能力較弱的減毒株［6］，并可利用完善的疫苗生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)在雞胚中大規(guī)模制造，且流感病毒的基因片段及產(chǎn)物的功能是明確已知的。流感病毒作為RNA病毒其基因不會(huì)整合至宿主基因上。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)溶瘤流感病毒的機(jī)制研究也越發(fā)深入，目前溶瘤流感病毒的作用方式可以總結(jié)為以下3點(diǎn)：a.病毒直接裂解腫瘤細(xì)胞；b.病毒激活機(jī)體免疫來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞；c.病毒作為載體表達(dá)外源基因提高上述兩種能力?，F(xiàn)將近年來(lái)流感病毒溶瘤的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 溶瘤流感病毒直接裂解腫瘤細(xì)胞

流感病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)是能夠觀察到的最直接的溶瘤結(jié)果，這與流感病毒感染癌細(xì)胞并復(fù)制出大量子代病毒使癌細(xì)胞裂解的特點(diǎn)有關(guān)。和流感病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程一致，當(dāng)流感病毒感染細(xì)胞時(shí)，流感病毒的血凝素通過(guò)吸附宿主細(xì)胞表面唾液酸受體以胞飲的方式進(jìn)入細(xì)胞，病毒囊膜與細(xì)胞膜融合后釋放病毒核酸并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。流感病毒的蛋白質(zhì)合成后開(kāi)始進(jìn)行病毒組裝，最后成熟的子代病毒通過(guò)出芽的方式釋放，此過(guò)程中使細(xì)胞發(fā)生裂解死亡。流感病毒感染腫瘤細(xì)胞的結(jié)果是相同的（圖1a）。

1.1 流感病毒感染腫瘤細(xì)胞

流感病毒特異性識(shí)別腫瘤靶細(xì)胞是進(jìn)行溶瘤治療的第一步，流感病毒的血凝素蛋白HA（hemagglutinin，HA）與病毒識(shí)別宿主細(xì)胞高度相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多發(fā)惡性腫瘤的細(xì)胞表面，唾液酸含量及種類顯著高于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞唾液酸化的增加常表現(xiàn)為唾液酸基以特異的α-2,3、α-2,6糖苷鍵與乳糖胺Galβ1~4 GluNAc單位相連。腫瘤中存在的唾液酸修飾異常主要是由唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)異常引起的，由于人體中缺乏CMP-Neu5Ac羥化酶基因，在成人的正常細(xì)胞中沒(méi)有Neu5Gc結(jié)構(gòu)，但部分腫瘤包括結(jié)腸癌組織中常具有Neu5Gc，可以作為一種腫瘤治療的特異性靶點(diǎn)［8］。流感病毒通過(guò)表面血凝素蛋白HA的末端結(jié)構(gòu)為唾液酸受體（SAα-2,3和SAα-2,6）介導(dǎo)病毒與腫瘤細(xì)胞膜融合，故流感病毒對(duì)此類腫瘤細(xì)胞就具備很好的靶向性［9］。此外，HA蛋白的構(gòu)象改變是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的必要步驟，胰蛋白酶或類似物（trypsin or trypsin-like serine proteases）通過(guò)結(jié)合HA蛋白的堿性裂解位點(diǎn)（basic cleavage site）使其形成合適的構(gòu)象來(lái)結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體［10-11］。Alain等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大部分惡性腫瘤組織中由腫瘤自身或中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境中的固有免疫細(xì)胞分泌的胰蛋白酶類似物（trypsin-like serine proteases）高表達(dá)。其中彈性蛋白酶在胰腺起源的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量又高于其他細(xì)胞。將部分非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）缺失（僅保留NS1前116位氨基酸）的PR8毒株中血凝素蛋白的胰蛋白酶切割位點(diǎn)替換為彈性蛋白酶后接種在異種胰腺導(dǎo)管腺癌移植瘤模型（PANC-1）和鼠黑色素瘤（B16）模型時(shí)觀察到了良好的療效［11］。

1.2 流感病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制

流感病毒感染宿主細(xì)胞后的復(fù)制需要病毒的NS1支持。NS1可阻斷Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，是病毒編碼的一種毒力蛋白。干擾素誘導(dǎo)蛋白激酶R（IFN-induced protein kinase R，PKR）是誘導(dǎo)干染素產(chǎn)生抗病毒作用的一個(gè)重要刺激元件，活化形態(tài)的PKR能夠使真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子2（eukaryotic translation factor 2，eIF2α）磷酸化進(jìn)而阻斷病毒蛋白的合成而抑制病毒的復(fù)制［13］。

NS1蛋白能夠抑制宿主細(xì)胞基因表達(dá)并刺激病毒自身蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［14］。NS1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)與多種作用有關(guān)：抑制mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制mRNA的前剪接和刺激病毒mRNA的翻譯，NS1與dsRNA結(jié)合并隨后阻斷dsRNA的激活，因此NS1蛋白可以作為細(xì)胞凋亡的抑制劑或誘導(dǎo)劑。流感病毒早期階段非結(jié)構(gòu)蛋白NS1通過(guò)抑制被dsRNA（double-stranded RNA）激活的PKR細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子的連鎖激活效應(yīng)和抑制IRF-3（IFN regulatory factor 3）并減少NF-κB（nuclear factor-κB）誘導(dǎo)的TNF-α釋放來(lái)拮抗細(xì)胞的凋亡。當(dāng)NS1截短或缺失后，PKR、IRF-3、NF-κB激活干擾素所誘導(dǎo)的連鎖反應(yīng)使流感病毒不能有效復(fù)制［15］（圖1）。

流感病毒感染癌細(xì)胞且不引起感染性疾病是溶瘤流感病毒的靶向要求。NS1截短的流感病毒可以特異地在RAS信號(hào)通路激活導(dǎo)致干擾素缺陷的腫瘤細(xì)胞中包裝復(fù)制且不影響人體正常細(xì)胞［16］。Muster等［16］已證實(shí)缺失NS1（delNS1）基因后的流感病毒在感染干擾素合成受抑制或RAS基因突變的腫瘤細(xì)胞后表現(xiàn)出高度的復(fù)制特異性，即僅在黑色素瘤、淋巴癌細(xì)胞中大量復(fù)制，而不在正常細(xì)胞中復(fù)制。在黑色素瘤細(xì)胞中，與表達(dá)野生型NS1蛋白病毒相比，delNS1顯示出更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用。這是由于delNS1病毒對(duì)PI3K/AKT途徑的激活減少所致。并且在包括黑素瘤細(xì)胞在內(nèi)的惡性細(xì)胞中，PI3K/AKT的活化與腫瘤的進(jìn)展和對(duì)抗腫瘤治療反應(yīng)的增強(qiáng)有關(guān)［17］。B16-F10黑色素瘤細(xì)胞由于RAS基因的過(guò)度活化使得PKR去磷酸化抑制了IFN的產(chǎn)生而使病毒能在IFN-α、β缺陷的細(xì)胞中增殖［18-19］（圖1）。病毒在Vero細(xì)胞和其他宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)的差異能力是由于Vero細(xì)胞缺乏功能性干擾素的表達(dá)這一事實(shí)所致［20］。超過(guò)30%的腫瘤細(xì)胞由于RAS基因的激活而抑制了真核細(xì)胞起始激酶（eukaryotic initiation factor）并進(jìn)一步阻止了PKR的活化［21］。研究發(fā)現(xiàn)所有癌癥亞型中約1/3的致癌大鼠肉瘤RAS基因突變導(dǎo)致PKR抑制［22］。并且NS1缺失的流感病毒可以靶向致癌性RAS突變的人518黑素瘤細(xì)胞的小鼠異種移植腫瘤模型［23］。驗(yàn)證了以PKR依賴性方式將PR8流感病毒靶向RAS突變的腫瘤。Efferson等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在RAS基因未激活的前列腺腫瘤細(xì)胞LNCap模型中，NS1基因缺失的流感病毒能誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞（PBMC）產(chǎn)生IFN-γ，與活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）產(chǎn)生的IL-12刺激病毒特異的CD8+T細(xì)胞，與NK細(xì)胞共同發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)來(lái)裂解腫瘤細(xì)胞（圖1）。

2 溶瘤病毒激活機(jī)體免疫來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞

溶瘤流感病毒不僅能在惡性腫瘤中復(fù)制，并且具有NS1缺失的甲型流感病毒比野生型病毒能更有效地刺激先天免疫來(lái)殺傷腫瘤。這是因?yàn)闇p毒與先天免疫系統(tǒng)病毒毒力因子缺失有關(guān)。NS1對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用是多方面的。機(jī)體細(xì)胞存在先天免疫介質(zhì)，NS1顯示出抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和NF-κB。由于NS1缺失的甲型流感病毒能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的PKR通路上調(diào)，因此下游信號(hào)傳導(dǎo)可能導(dǎo)致細(xì)胞膜上的鈣網(wǎng)蛋白（CALR）暴露。CALR充當(dāng)DAMP的角色，導(dǎo)致PKR敏感癌癥中甲型流感病毒感染后凋亡小體的免疫原性增強(qiáng)［25-26］。在對(duì)NS1部分截?cái)嗟牟《驹黾恿舜傺谆虻纳险{(diào)，但完整的NS1缺失導(dǎo)致表達(dá)進(jìn)一步增加［27］。溶瘤流感病毒免疫刺激的效力與NS1缺失的長(zhǎng)度相關(guān)，完全的NS1缺失導(dǎo)致病毒流產(chǎn)。因此，病毒促炎免疫刺激的水平和衰減的水平可以通過(guò)缺失的長(zhǎng)度來(lái)滴定。實(shí)驗(yàn)表明，NS1缺失到80或116個(gè)剩余氨基酸（去除效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，但留下RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核定位序列）誘導(dǎo)衰減和溶瘤效應(yīng)之間的最佳平衡［16，28］。NS1的截?cái)鄿p少了PKR途徑的抑制，同時(shí)保留對(duì)通過(guò)RIG-I途徑的免疫原性信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。并且PKR和RIG-I都與I型干擾素的產(chǎn)生有關(guān)［29］。溶瘤病毒的主要免疫刺激與腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的適應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)顯示，NS1缺失病毒可用于刺激樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），以通過(guò)交叉表達(dá)對(duì)惡性細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)［24，30］。T細(xì)胞的刺激可以通過(guò)暴露于delNS1病毒產(chǎn)生的病毒裂解物的DCs或通過(guò)將感染delNS1病毒的DCs暴露于腫瘤細(xì)胞裂解物來(lái)誘導(dǎo)。同樣，部分NS1缺失病毒比完全缺失NS1蛋白更有效。這些離體分析可能在某種程度上模擬溶瘤治療期間的體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。免疫細(xì)胞暴露于溶瘤NS1缺失病毒也顯示出誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞（PMBC），包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞對(duì)各種癌細(xì)胞系的直接IFN依賴性細(xì)胞毒作用［31-32］（圖1）。

3 編碼抗癌基因的重組溶瘤流感病毒

OVs可以通過(guò)多種機(jī)制直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，但不足以完全破壞腫瘤組織。與其他外源基因或其他治療策略的結(jié)合是增強(qiáng)治療效果的必要途徑。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞因子的重組病毒的產(chǎn)生并且溶瘤性delNS1病毒基因組中外源基因的表達(dá)不會(huì)干擾其抗腫瘤活性［33］。

3.1 表達(dá)IL-2、IL-15的溶瘤流感病毒

目前研究指出，大部分的實(shí)體瘤缺乏CTL的浸潤(rùn)，如何恢復(fù)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答是近年來(lái)抗腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。人白介素-2（IL-2）是一種免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞衍生分子，是抗原激活T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增所必需的，能誘導(dǎo)T輔助和T殺傷細(xì)胞的增殖以及刺激T細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子。此外，IL-2還可以激活B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［34］。Liu等［35］和Kittel等［36］構(gòu)建了一種可以在細(xì)胞內(nèi)外源分泌的IL-2的重組流感病毒。病毒具有在小鼠肺部高效復(fù)制的特性，在較高劑量（2×105PFU/只）接種6周齡的小鼠后沒(méi)有造成小鼠的死亡，除了注射部位IL-2的分泌增高以外研究還發(fā)現(xiàn)，針對(duì)該改造病毒特異的T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平也大幅增高，這提示表達(dá)IL-2的重組病毒具有激活腫瘤免疫環(huán)境的能力。IL-15在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面具有多種功能，并在NK細(xì)胞和T細(xì)胞的分化和增殖中起主要作用［37］。為了提高溶瘤流感病毒的免疫刺激特性，Hock等［38］在NS1缺失的基礎(chǔ)上利用反向遺傳學(xué)技術(shù)讓病毒內(nèi)源性表達(dá)IL-15，體外研究結(jié)果顯示，改造后的病毒能刺激CD4+、CD8+T細(xì)胞的分化且促進(jìn)STAT5A/B的磷酸化，并且在小鼠結(jié)腸癌組織處募集了大量的NK細(xì)胞與效應(yīng)記憶T細(xì)胞，效應(yīng)記憶T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ又能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，改善腫瘤免疫微環(huán)境。無(wú)論是內(nèi)源還是外源表達(dá)的人白介素在通過(guò)流感病毒表達(dá)后都顯著延長(zhǎng)了該蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期及局部濃度，并且大幅刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ、IL-4等其他細(xì)胞因子。

3.2 表達(dá)CTLA-4單鏈抗體的溶瘤流感病毒

CTLA-4是一種下調(diào)T細(xì)胞活化初始階段的抑制性受體，是檢查點(diǎn)抗體的初始目標(biāo)。Yervoy?單抗藥物的獲批顯示出CTLA-4在腫瘤治療中的潛力。Hamilton等［39］設(shè)計(jì)表達(dá)該抗體的流感病毒，并證明編碼阻止免疫檢查點(diǎn)CTLA-4的單鏈抗體可增強(qiáng)流感病毒的抗癌活性。為了在病毒生命周期中表達(dá)抗體的具有復(fù)制能力的IAV，使用了聚合酶PB1和PA區(qū)段。為了從IAV表達(dá)9H10抗體，將重鏈和輕鏈基因都插入了IAV基因組中。重鏈基因被克隆到PB1下游。將豬破傷風(fēng)病毒1（PTV-1）2A序列插入PB1和重鏈基因之間，以便進(jìn)行PB1和重鏈蛋白的分離。另外，將IL-2信號(hào)肽序列克隆在2A和重鏈序列之間，以靶向新生的重鏈多肽并分泌。采用相同的策略將抗體的輕鏈表達(dá)在PA片段上。通過(guò)靶向免疫檢查點(diǎn)CTLA-4的單鏈可變片段的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了IAV的溶瘤能力。B16-F10黑色素瘤是一種高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性癌癥模型，以其在體內(nèi)的快速生長(zhǎng)而聞名［40］。瘤內(nèi)注射IAVCTLA-4可有效抑制B16-F10腫瘤的生長(zhǎng)。此外，用IAV-CTLA-4進(jìn)行治療可介導(dǎo)明顯的作用，從而延遲未經(jīng)治療的遠(yuǎn)端腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了總生存期。

3.3 表達(dá)HER-2的溶瘤流感病毒

人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2/neu）為一具有免疫原性的糖蛋白，在卵巢癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中存在并高表達(dá)，具有免疫原性的HER-2/neu肽可被CTL和TH識(shí)別，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一。Efferson等［41］以流感病毒A/PR/8/34的NA基因?yàn)檠b載基因，將HER-2中9個(gè)氨基酸構(gòu)成的CTL表位E75插入到NA的莖部區(qū)域，構(gòu)建出重組流感病毒。感染該重組病毒的DC能產(chǎn)生高水平的IFN-α并激發(fā)外周血單核細(xì)胞，卵巢癌和乳腺癌患者相關(guān)的淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)HER-2的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL效應(yīng)，并分泌IFN-γ和IL-2。因此減毒性流感病毒能夠作為腫瘤抗原的遞呈載體，可行使腫瘤疫苗的作用具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值［42］。

3.4 堿基突變使溶瘤流感病毒溶瘤能力增強(qiáng)

文中已敘述部分惡性腫瘤組織中胰蛋白酶類似物（elastase）高表達(dá)［12］。為了進(jìn)一步將IAV靶向腫瘤，將胰蛋白酶切割位點(diǎn)改為了彈性蛋白酶切割 位 點(diǎn)。Kuznetsova等［11］將NS1基 因 截短 的A/Puerto Rico/8/34流感病毒的HA堿性裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列由SIQSR343G344LFGA變?yōu)镾IQSPI343G344LFGA，選擇該切割位點(diǎn)是因?yàn)樵谀[瘤微環(huán)境中表達(dá)了酶。此外，先前已顯示切割位點(diǎn)的交換減弱了肺中病毒的生長(zhǎng)。新產(chǎn)生的彈性蛋白酶激活的（elastase-activated）流感病毒AE病毒在腫瘤細(xì)胞中的生長(zhǎng)效價(jià)與胰蛋白酶激活的（trypsin-activated）對(duì) 應(yīng) 病 毒AT病 毒 相 似。向B16f1黑色素瘤衍生的小鼠體內(nèi)進(jìn)行AE病毒的顱內(nèi)注射，與AT病毒相似，可減少腫瘤的生長(zhǎng)，并且在異源人類PANC-1衍生的腫瘤中具有更好的治療效果。因此，在病毒HA中引入減毒標(biāo)記“彈性蛋白酶切割位點(diǎn)”可以進(jìn)行安全有效的溶瘤病毒治療。

3.5 表達(dá)GM-CSF的新型甲型流感病毒并在肝細(xì)胞癌中具有溶瘤作用

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）是T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的單體糖蛋白?？梢源碳じ杉?xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，并在腫瘤治療中起到很好的治療效果。Yang等［43］以A/PR/8/34為母本，將GM-CSF編碼序列插入到流感非結(jié)構(gòu)蛋白基因中，構(gòu)建了delNS1-GM-CSF溶瘤病毒。delNS1-GM-CSF病毒通過(guò)感染MDCK、A549、SMCC7721和HepG2肝癌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞具有與野生型A/PR/8/34有著相同的病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。在4種肝癌細(xì)胞中（SMMC-7721、HepG2、MHCC97L、Huh7.5）細(xì)胞系中觀察到了病毒的細(xì)胞殺傷作用，而在正常肝細(xì)胞系LO2中未顯示出細(xì)胞毒性。在腫瘤內(nèi)注射病毒HepG2細(xì)胞構(gòu)建的BALB/c裸鼠移植瘤模型后，重配delNS1-GM-CSF病毒顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，在62例肝癌臨床樣品離體實(shí)驗(yàn)中同樣觀察到了delNS1-GM-CSF的抑瘤作用［43］。

3.6 表達(dá)抗程序性細(xì)胞死亡1（PD-1）單克隆抗體的溶瘤流感病毒

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，能夠下調(diào)免疫系統(tǒng)使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸?？筆D-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用成為抗腫瘤的治療方法［44］。Lei等［45］以流感病毒株A/PR/8/34為載體，將免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1抗體基因插入到PR8病毒株P(guān)B1、PA片段后成功拯救出了溶瘤流感病毒rFlu-a PD1。用重組溶瘤流感病毒rFlu-a PD1感染正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞系HepG2、SMCC-7721后發(fā)現(xiàn)顯著降低了肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力而對(duì)正常的肝細(xì)胞沒(méi)有明顯的殺傷作用。又通過(guò)流式細(xì)胞的方法檢測(cè)到rFlu-a PD1可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。同時(shí)建立的肝癌PDX小鼠腫瘤經(jīng)過(guò)rFlu-a PD1治療后比對(duì)照組小鼠腫瘤體積有明顯縮小。重組溶瘤流感病毒rFlu-a PD1選擇性的感染腫瘤細(xì)胞，且大量復(fù)制并最終殺傷腫瘤細(xì)胞，成為肝癌免疫治療的新方法［45］。

4 總結(jié)和展望

OVs是一類新型的抗腫瘤藥物，通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫的雙重作用達(dá)到對(duì)腫瘤的殺傷效果。流感病毒具有作為溶瘤病毒的潛力，其不僅可以直接裂解腫瘤細(xì)胞并激活機(jī)體免疫來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，也作為載體表達(dá)外源基因提高抗腫瘤靶向能力。雖然流感病毒作為危害人類身體健康主要致病原，但經(jīng)改造后具有安全遞送外源基因的能力，流感病毒在其復(fù)制周期中不包含DNA階段，因此排除了病毒基因整合到人類染色體的風(fēng)險(xiǎn)。溶瘤病毒的注射方法多為瘤內(nèi)注射，其他給藥途徑還需要進(jìn)一步研究。不同流感病毒亞型的抗體往往具有較低的交叉保護(hù)能力，因此通過(guò)使用屬于不同抗原亞型的病毒載體來(lái)避免預(yù)存免疫也會(huì)是今后研究的一個(gè)方向，溶瘤流感病毒的多種亞型提供了多重溶瘤提供可能。最后，以T-VEC溶瘤病毒聯(lián)合檢查點(diǎn)抑制劑Yervoy、Keytruda等免疫療法取得的巨大成功提示更加合理地聯(lián)合溶瘤流感病毒與其他抗腫瘤治療方式可能會(huì)使溶瘤病毒有更加廣闊的應(yīng)用前景［46］。