鄒玥，劉穎，郭雪華

作者單位：吉林省婦幼保健院中心實驗室，吉林 長春 130000

胎兒心臟發(fā)育畸形是臨床常見的先天畸形類型，據(jù)報道［1］，心臟發(fā)育畸形在胎兒期的發(fā)生率約為0.3%～1.4%，因心臟發(fā)育畸形導(dǎo)致的妊娠終止率可高達(dá)75%，其存活率僅有10%～38%，存活患兒經(jīng)治療后也有部分預(yù)后不良，影響身體健康。胎兒心臟發(fā)育畸形受遺傳、環(huán)境等多因素影響，近年來研究發(fā)現(xiàn)［2］，染色體22q11.2微缺失與胎兒心臟發(fā)育畸形關(guān)系密切，染色體22q11.2微缺失病例中有60%～80%病例合并心臟發(fā)育畸形。臨床對22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發(fā)育畸形尚無有效治療方法，因此進(jìn)行產(chǎn)前早期篩查診斷對降低死胎率和活產(chǎn)兒心臟畸形率非常重要。目前微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array comparative genomic hybridization，arrayCGH）是替代傳統(tǒng)分析細(xì)胞核型的有效工具，無需細(xì)胞培養(yǎng)即可高分辨準(zhǔn)確檢測出染色體微缺失，但價格高、難度大，而近幾年臨床應(yīng)用較多的多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation probe amplification，MLPA）雖花費較少，操作簡單，但該方法與arrayCGH均需行羊水穿刺采集樣本，會增加早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、宮內(nèi)死亡的風(fēng)險，孕婦及家屬接受度不高，不適用于產(chǎn)前篩查［3-4］。近年來新一代測序技術(shù)打破了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷的局限性，該技術(shù)包括大規(guī)模平行測序、焦磷酸測序、Illumina測序等多種方法，具有低成本、高通量、無創(chuàng)傷的特點，在胎兒遺傳病基因檢測和生殖篩查中優(yōu)勢顯著［5］，但目前該技術(shù)在22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發(fā)育畸形中的應(yīng)用及診斷效能尚未有研究報道。鑒于此，筆者選取78例可疑胎兒心臟發(fā)育畸形者的孕婦采用新一代測序技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前檢測，分析其篩查價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料按下述入排標(biāo)準(zhǔn)選取吉林省婦幼保健院2018年7月至2020年3月可疑胎兒心臟發(fā)育畸形的孕婦78例作為受試對象，年齡范圍為23～41歲，年齡（28.43±4.27）歲；孕齡范圍為12～24周，孕齡（18.94±2.86）周；其中自然受孕者65例；既往有唇裂、無腦兒、心臟缺陷、智力缺陷、死胎等異常生育史者18例；有家族遺傳史者2例。本研究已經(jīng)吉林省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)（201806-002）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)超聲檢查疑似胎兒心臟發(fā)育畸形者；（2）均為單胎妊娠；（3）均接受跟蹤隨訪；（4）均對本研究知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期有糖尿病、高血壓等合并癥者；（2）既往有高血壓、糖尿病者；（3）接受過輸血、細(xì)胞治療、移植手術(shù)者；（4）過度肥胖者；（5）心、肝、腎等功能異常者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理（1）羊水穿刺及DNA提取：告知孕婦及家屬羊水穿刺風(fēng)險，孕婦需簽署同意書。進(jìn)行穿刺前需行血常規(guī)、凝血常規(guī)、傳染病檢查、超聲檢查，在無感染、無發(fā)熱、凝血功能正常、羊水量充足的情況下進(jìn)行羊水穿刺。穿刺后取羊水樣本，離心后棄去上清液，采用游離DNA提取試劑盒（上海希言科學(xué)儀器有限公司）按照操作流程提取胎兒脫落細(xì)胞中的DNA。（2）外周血DNA提?。翰杉袐D及其配偶的外周血于抗凝管中保存，在4℃、10 000 r/min（離心半徑12 cm）條件下離心10 min，后取上層血漿，采用游離DNA提取試劑盒（上海希言科學(xué)儀器有限公司）按照操作流程提取游離DNA。

1.2.2 新一代測序技術(shù)檢測用Nanodrop2000核酸定量儀（美國Nanodrop）測定提取的孕婦外周血游離DNA的純度和濃度，檢測合格后于-20℃冰箱保存。游離DNA經(jīng)文庫制備后在Illumina Next-Sep500測序平臺完成100 kb、測序深度1×的高通量測序，將測序結(jié)果經(jīng)信息分析通過Z值進(jìn)行染色體22q11.2缺失基因判定。

1.2.3 MLPA技術(shù)檢測采用微缺失檢測試劑盒（荷蘭MBC-Holland）按照操作流程進(jìn)行檢測，共含22q11.2區(qū)域的29個探針，稀釋提取的羊水DNA濃度后進(jìn)行變性、雜交、連接反應(yīng)，取連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，過程：95℃、60℃下各30 s，72℃下1 min，35個循環(huán)后在72℃下延伸10 min。然后取反應(yīng)產(chǎn)物在ABI3130基因分析儀中進(jìn)行電泳，采用Coffalyser軟件進(jìn)行分析得出基因相對拷貝數(shù)比值：比值＜0.7表示檢測區(qū)基因有缺失；比值為0.7～1.3，表示檢測區(qū)基因無缺失；比值＞1.3表示檢測區(qū)基因有重復(fù)片段。采集檢測結(jié)果有22q11.2缺失的孕婦及配偶外周血，提取外周血DNA采用MLPA技術(shù)檢測胎兒父母有無22q11.2微缺失，以進(jìn)行父母溯源。

1.2.4 arrayCGH技術(shù)檢測采用Oligo Human CGH Microarray芯片（美國Agilent公司），經(jīng)過洗滌、離心甩干后對采集提取的孕婦羊水DNA進(jìn)行全基因組掃描分析22q11.2精確缺失位置和大小。

1.2.5 跟蹤隨訪跟蹤隨訪至孕婦妊娠結(jié)束，引產(chǎn)或死產(chǎn)者進(jìn)行尸檢觀察胎兒心臟發(fā)育畸形情況，活產(chǎn)者進(jìn)行心臟檢查觀察發(fā)育情況，統(tǒng)計胎兒心臟發(fā)育畸形結(jié)果。將arrayCGH驗證結(jié)果記作診斷22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發(fā)育畸形的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.3 觀察指標(biāo)（1）隨訪結(jié)果；（2）新一代測序技術(shù)檢測胎兒22q11.2微缺失情況；（3）MLPA技術(shù)檢測胎兒及其父母22q11.2微缺失情況；（4）arrayCGH技術(shù)驗證情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件作為統(tǒng)計學(xué)工具。采用配對χ2檢驗方法比較各診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法的診斷價值，采用Kappa一致性檢驗分析不同方法與“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)果的一致性，P＜0.05為檢測水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪情況共35例胎兒心臟發(fā)育畸形，發(fā)生率為其中永存動脈干、右心室雙出口2例，共同動脈干、雙上腔靜脈、共同房室瓣反流3例，大動脈轉(zhuǎn)位、單心室、三尖瓣閉鎖3例，肺動脈閉鎖、室間隔缺損3例，單心房、單心室、完全性心內(nèi)膜墊缺損2例，肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨5例，室間隔缺損、肺動脈狹窄、右位主動脈弓5例，室間隔缺損、動脈導(dǎo)管缺如、右位主動脈弓4例，室間隔缺損、動脈導(dǎo)管缺如4例，室間隔缺損、右位主動脈弓2例，法洛四聯(lián)癥、肺動脈閉鎖2例。

2.2 新一代測序技術(shù)結(jié)果35例胎兒心臟發(fā)育畸形中有12例經(jīng)新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為34.29%（12/35）；43例胎兒心臟發(fā)育正常中有1例經(jīng)新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為2.33%（1/43）。（即新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了13例陽性樣本-22q11.2微缺失）。

2.3 MLPA檢測結(jié)果35例胎兒心臟發(fā)育畸形中有14例經(jīng)MLPA發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為40.00%（14/35）；43例胎兒心臟發(fā)育正常中有1例經(jīng)MLPA發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為2.33%（1/43）。（即MLPA方法發(fā)現(xiàn)了15例陽性樣本22q11.2微缺失）。

此外，15例發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失的胎兒父母基因溯源發(fā)現(xiàn)有2例父源22q11.2微缺失，占比為13.33%（2/15）；余13例父母檢測結(jié)果均正常。

2.4 arrayCGH技術(shù)驗證結(jié)果

2.4.1 14例胎兒心臟發(fā)育畸形22q11.2微缺失的檢測結(jié)果35例胎兒心臟發(fā)育畸形中有14例經(jīng)arrayCGH檢測發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為40.00%（14/35），具體信息見表1。

表1 14例胎兒心臟發(fā)育畸形22q11.2微缺失的檢測結(jié)果

2.4.2 1例胎兒心臟發(fā)育正常22q11.2微缺失的檢測結(jié)果43例胎兒心臟發(fā)育正常中有1例經(jīng)arrayCGH檢測發(fā)現(xiàn)父源22q11.2微缺失，MLPA檢測缺失范圍為LCR A-D，arrayCGH檢測22q11.2微缺失范圍為19187939-21464479，2.27Mb，檢出率為2.33%（1/43）。

2.4.3 新一代測序技術(shù)診斷22q11.2微缺失情況的診斷分析結(jié)果（1）胎兒心臟發(fā)育畸形者經(jīng)新一代測序技術(shù)檢測22q11.2微缺失檢出率，均高于胎兒心臟發(fā)育正常者。診斷價值分析（配對χ2檢驗）發(fā)現(xiàn)：新一代測序技術(shù)檢測與金標(biāo)準(zhǔn)arrayCGH驗證法的關(guān)聯(lián)性χ2=59.43，P=0.000（提示兩法關(guān)聯(lián)），差異性χ2=0.50，P=0.480（提示兩法相近），靈敏度0.87，特異度1.00。其符合率（準(zhǔn)確度）為97.4%（76/78）、Kappa=0.910（提示一致性好），見表2。

表2 新一代測序技術(shù)診斷22q11.2微缺失情況/例

（2）胎兒心臟發(fā)育畸形者經(jīng)MLPA檢測22q11.2微缺失檢出率，均高于胎兒心臟發(fā)育正常者。診斷價值分析（配對χ2檢驗）發(fā)現(xiàn)：MLPA檢測22q11.2微缺失情況與金標(biāo)準(zhǔn)arrayCGH驗證法的關(guān)聯(lián)性χ2=71.70，P=0.000（提示兩法關(guān)聯(lián)），差異性χ2=0.00，P=1.000（提示兩法相同）。其符合率（準(zhǔn)確度）為100.0%（76/78）、Kappa=1.000（提示兩法完全一致），見表3。

表3 MLPA診斷22q11.2微缺失情況/例

3 討論

染色體22q11.2微缺失是最常見的引起胎兒心臟發(fā)育畸形的遺傳因素之一，因其為顯性遺傳，攜帶者下一代發(fā)生22q11.2微缺失的概率較大［6］，因此產(chǎn)前篩查22q11.2微缺失意義重大。近年來隨著基因組學(xué)的技術(shù)進(jìn)步，臨床上采用MLPA、arrayCGH等技術(shù)進(jìn)行22q11.2微缺失的檢測，但檢測過程均具有創(chuàng)性，對宮內(nèi)胎兒發(fā)育有潛在危險，不適用于產(chǎn)前篩查。因此，亟須尋求一種安全、有效、簡便的方法來進(jìn)行22q11.2微缺失產(chǎn)前篩查，預(yù)防新生兒出生缺陷。

本研究發(fā)現(xiàn)，在78例可疑胎兒心臟發(fā)育畸形的孕婦中有35例確診胎兒心臟發(fā)育畸形，胎兒心臟發(fā)育畸形易造成孕期流產(chǎn)、死胎、新生兒早期死亡等，因此需高度重視胎兒心臟發(fā)育畸形產(chǎn)前篩查。本研究35例胎兒心臟發(fā)育畸形者經(jīng)新一代測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)有12例22q11.2微缺失，檢出率為34.29%，43例胎兒心臟發(fā)育正常者經(jīng)新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)有1例22q11.2微缺失，檢出率為2.33%，說明新一代測序技術(shù)對22q11.2微缺失有一定的篩查作用。研究發(fā)現(xiàn)［7-8］，妊娠5周后就可在母體外周血中檢測出胎兒DNA，并且其濃度隨孕期增加而升高，且妊娠后血漿胎源性DNA分子長度顯著短于母體，因此從母體外周血血漿中提取胎兒DNA比較簡便。

本研究采用Illumina新一代測序技術(shù)對母體外周血提取的胎兒DNA進(jìn)行大規(guī)模深度測序，在DNA復(fù)制時加入標(biāo)記核苷酸進(jìn)行追蹤捕獲目的基因組，利用Illumina平臺邊合成邊測序，覆蓋基因范圍廣泛，具有較高的敏感度和準(zhǔn)確性，且操作方法簡單，對宮內(nèi)胎兒發(fā)育無影響［9］。Gatticchi等［10］在對由2ALMS1基因變異引起的Alstr?m綜合征病人進(jìn)行基因篩查診斷研究中，發(fā)現(xiàn)新一代測序技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確進(jìn)行篩查診斷，進(jìn)一步證實了新一代測序技術(shù)在基因篩查診斷中的價值。既往研究報道［11-12］，MLPA技術(shù)在基因變異導(dǎo)致的各種疾病中有較高的檢測價值。本研究中35例胎兒心臟發(fā)育畸形中有14例經(jīng)MLPA發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為40.00%，43例胎兒心臟發(fā)育正常中有1例經(jīng)MLPA發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為2.33%；其中15例22q11.2微缺失的胎兒父母基因溯源發(fā)現(xiàn)有2例父源22q11.2微缺失，占比為13.33%，余13例父母檢測結(jié)果均正常，說明了MLPA技術(shù)對22q11.2微缺失具有檢測診斷價值。MLPA技術(shù)將DNA探針技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，能夠高通量快速檢測基因組拷貝數(shù)變異，準(zhǔn)確識別缺失區(qū)域，且能對父母溯源，有助于遺傳咨詢，評估再次孕育風(fēng)險，常用于檢測臨床基因遺傳疾?。?3］。另外本研究結(jié)果顯示，經(jīng)arrayCGH技術(shù)檢測驗證，35例胎兒心臟發(fā)育畸形中有14例發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為40.00%，43例胎兒心臟發(fā)育正常中有1例發(fā)現(xiàn)22q11.2微缺失，檢出率為2.33%。arrayCGH技術(shù)能夠進(jìn)行基因組拷貝數(shù)變異分析，對檢測微小缺失具有獨特優(yōu)勢，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，臨床常采該技術(shù)驗證其他基因測序技術(shù)檢測結(jié)果［14］。

本研究結(jié)果顯示胎兒心臟發(fā)育畸形者經(jīng)一代測序技術(shù)、MLPA技術(shù)檢測22q11.2微缺失檢出率均高于心臟發(fā)育正常者，提示22q11.2微缺失與胎兒心臟發(fā)育畸形有密切關(guān)系。大量研究發(fā)現(xiàn)，染色體22q11.2區(qū)域有較多低拷貝重復(fù)序列，易發(fā)生非等位基因同源重組，影響胚胎早期心臟形態(tài)發(fā)生及心血管的發(fā)育，主要導(dǎo)致圓錐動脈畸形，如法洛四聯(lián)癥、主動脈離斷、房/室間隔缺損、永存動脈干、右室雙出口和大動脈轉(zhuǎn)位等［15-17］，故進(jìn)行產(chǎn)前篩查胎兒22q11.2微缺失情況對降低新生兒心臟畸形率意義重大。本研究采用新一代測序技術(shù)檢測胎兒22q11.2微缺失情況結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)arrayCGH驗證法具有高度一致性，采用MLPA檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)arrayCGH驗證法完全一致，且以上兩種檢測方法與金標(biāo)準(zhǔn)arrayCGH驗證法有顯著關(guān)聯(lián)性，無明顯差異性，檢測符合率高，說明新一代測序技術(shù)和MLPA技術(shù)對22q11.2微缺失的檢測準(zhǔn)確度高，證實了新一代測序技術(shù)及MLPA技術(shù)的篩查價值。新一代測序技術(shù)相比傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)所需樣本量少、通量高、分辨率高，能檢測出低至0.1 Mb的缺失或重復(fù)［18］；與arrayCGH技術(shù)相比無需對全基因組測序，可利用序列捕獲技術(shù)針對性檢測目的基因組，節(jié)省成本，檢測速度快；與MLPA技術(shù)相比樣本要求簡單，可降低樣本污染風(fēng)險，且無創(chuàng)傷性。因此，臨床可應(yīng)用新一代測序技術(shù)作為22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發(fā)育畸形的產(chǎn)前篩查方法。

綜上，22q11.2微缺失是胎兒心臟發(fā)育畸形的常見原因，新一代測序技術(shù)和MLPA對其篩查價值相當(dāng)，可在臨床產(chǎn)前篩查中推廣應(yīng)用。