郭華靜,藺瑞麗,宋平順,郭曄紅
作者單位:1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,甘肅 蘭州 730000
前胡為常用中藥材,為傘形科植物白花前胡Peucedauum praeruptorum Dunn的干燥根[1];產(chǎn)于河南、貴州、廣西、四川、湖北、湖南、江西、安徽、江蘇、浙江、福建等地。近年中藥材市場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)前胡的混淆品種較多,前胡飲片檢驗(yàn)的不合格率較高[2-3],來自同科屬的華北前胡Peucedanum harry-smithii Fedd.ex Wolff;少毛北前胡Peucedanum harrysmithii Fedd.ex Wolff var.subglabrum(Shan et.Sheb)為其主要混淆品,商品習(xí)慣稱為“硬前胡”[4],主產(chǎn)于甘肅、陜西等地。
由于前胡與硬前胡為同科屬植物,化學(xué)成分相近,通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前對(duì)前胡質(zhì)量控制的研究,包括運(yùn)用近紅外光譜對(duì)前胡進(jìn)行真?zhèn)舞b別[5]和不同產(chǎn)地鑒別[6],對(duì)前胡中歐前胡素、異歐前胡素等幾個(gè)呋喃香豆素成分的含量測(cè)定[7],對(duì)前胡藥材HPLC指紋圖譜的研究[8-10],這些都未能較全面表征前胡和硬前胡藥材之間的成分差異,所以前胡和硬前胡的區(qū)別有待研究。
市場(chǎng)流通的前胡來源比較復(fù)雜,前胡、硬前胡以及前胡中摻假硬前胡的判別研究鮮有報(bào)道。本研究采用HPLC法測(cè)定23批前胡、10批硬前和54批模擬樣品(前胡中摻假不同比例的硬前胡)中白花前胡甲素和乙素含量,通過對(duì)上述樣品中白花前胡甲素、白花前胡乙素的峰面積比值分析、相似度分析和聚類分析,建立判別前胡、硬前胡和摻假前胡的檢驗(yàn)方法,可以快速識(shí)別前胡樣品中是否摻假和摻假多少比例的硬前胡,為前胡飲片的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
1.1 儀器WATERS高效液相色譜儀(ACQUITY ARC);WATERS-C18柱(250 mm×4.60mm,5μm);KQ-300DB型超聲波清洗儀(昆山舒美儀器有限公司);SECURA125-1CN型電子天平(德國(guó)SARTORIUS);ELIX-ESSENTIAL-5純水儀;QNINTIX224-1CN型電子天平(德國(guó)SARTORIUS)。
1.2 材料白花前胡甲素(批號(hào)111711-201904),白花前胡乙素(批號(hào)111904-201804),購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈(新藍(lán)景,色譜純);甲醇(新藍(lán)景,色譜純);水(屈臣氏);無水甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)。
23批前胡樣品為傘形科植物白花前胡Peucedauum praeruptorumDunn的干燥根;10批硬前胡樣品為傘形科植物華北前胡Peucedanum harrysmithiiFedd.ex Wolff、少毛北前胡Peucedanum harry-smithiiFedd.ex Wolff var.subglabrum(Shan et.Sheb)的干燥根;分別為2016年、2018年甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院存留樣品,拉丁學(xué)名經(jīng)由甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師鑒定。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件色譜柱:Waters SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇溶液(A)-水溶液(B)梯度洗脫(0~15 min,75~85% A;15~18 min,85~75% A;18~22 min,75% A),流速:1.0 mL/min;PDA檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按白花前胡甲素峰計(jì)算不低于3 000。白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)照品、前胡樣品、硬前胡樣品及摻假樣品溶液HPLC色譜圖見圖1。
圖1 HPLC色譜圖:A為對(duì)照品;B為前胡樣品;C為硬前胡樣品;D為摻假樣品
1.3.2 溶液的制備
1.3.2.1 對(duì)照品溶液精密稱定白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)照品各適量,用甲醇定容,分別得每1 mL含52 μg和75 μg的混合對(duì)照品溶液。
1.3.2.2 供試品溶液取粉末(過三號(hào)篩),精密稱定1.0 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲(300 W,40 kHz)提取30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。
1.3.3 線性關(guān)系考察精密量取“1.3.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液1,5,10,15,20 mL,分別定容于50 mL量瓶中,按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、以峰面積(A)為縱坐標(biāo),得回歸方程。白花前胡甲素:A=11 569C-1.455,r=0.999 2,質(zhì)量濃度在1.04~20.8 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。白花前胡乙素:A=11 951C-3 2l3,r=0.996 1,質(zhì)量濃度在1.58~30.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.3.4 方法學(xué)考察
1.3.4.1 精密度試驗(yàn)取前胡(1號(hào)),按供試品制備方法制備,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為0.1%、0.1%,RSD均小于2.0%,表明該方法精密度良好。
1.3.4.2 重復(fù)性考察取前胡(1號(hào)),按供試品制備方法平行制備6份,按上述色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為1.46%、1.38%,表明該方法重復(fù)性良好。
1.3.4.3 穩(wěn)定性考察取前胡(1號(hào)),按供試品制備方法制備,按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、6、16、24、32、48 h進(jìn)樣,計(jì)算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為1.01%、0.71%,表明樣品48 h穩(wěn)定性良好。
1.3.4.4 加樣回收率試驗(yàn)取前胡(1號(hào))樣品6份,精密加入白花前胡甲素對(duì)照品(質(zhì)量濃度為4.20 mg/L)和白花前胡乙素對(duì)照品(質(zhì)量濃度為6.14 mg/L)適量,按供試品溶液制備方法制備并依法測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果白花前胡甲素平均回收率為97.61%,RSD為1.06%;白花前胡乙素平均回收率為98.54%,RSD為0.75%。
2.1 樣品含量測(cè)定分別取23批前胡和10批硬前胡粉末各1.0 g,精密稱定,按“1.3.2.2”節(jié)下的方法進(jìn)行處理,并按“1.3.1”節(jié)下的色譜條件進(jìn)樣10 μL,各成分含量結(jié)果見表1。由表1可知前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素含量范圍分別為0.59%~1.64%、0.03%~0.41%,硬前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素含量范圍分別為0.00%~0.02%、0.17%~0.48%。
表1 33批樣品含量測(cè)定結(jié)果/%
2.2 前胡與硬前胡的識(shí)別方法分析
2.2.1 峰面積比值法發(fā)現(xiàn)在23批前胡樣品中,白花前胡乙素與白花前胡甲素的比值在0.09~0.91;10批硬前胡樣品中,白花前胡乙素與白花前胡甲素的比值在12.14~93.67??梢娬非昂邪谆ㄇ昂宜睾桶谆ㄇ昂姿氐谋戎凳切∮?的,硬前胡中該比值大于1,通過峰面積比值法來區(qū)分前胡和硬前胡。見表2。
2.2.2 指紋圖譜相似度分析將上述色譜條件下檢測(cè)到的所有前胡樣品數(shù)據(jù)結(jié)果以AIA的格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版),選定S1號(hào)樣品為參照色譜圖,23份前胡樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.848~0.998,10份硬前胡樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.103~0.169,表明硬前胡樣品與前胡樣品差異性較大,可以采用相似度判斷真?zhèn)?。結(jié)果見表2。
表2 33批樣品峰面積比值/相似度數(shù)據(jù)
2.2.3 聚類分析以2種化學(xué)成分的含量為變量,運(yùn)用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,利用平方歐式距離作為樣品的測(cè)度,采用組內(nèi)聯(lián)接法進(jìn)行聚類,結(jié)果顯示,歐式距離為25時(shí)分為兩類,前胡聚一類,硬前胡為一類。而在前胡中又以質(zhì)量的相近程度而進(jìn)一步相聚,此結(jié)論和相似度分析一致。
2.3 前胡中摻假硬前胡的比值考察在正品前胡(1~4號(hào))中分別摻入3%~50%不同比例的硬前胡(24~33號(hào)),共計(jì)54批樣品,測(cè)定白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值,見表3。
表3 4批前胡與6批硬前胡不同比例的樣品峰面積比值與相似度/%
可見,在4批正品前胡摻假6批硬前胡后,比值在0.14~0.97,摻假在17%之下相似度在0.8之上,23批正品前胡中比值在0.09~0.91;由于前胡和硬前胡來自不同的產(chǎn)地,所含白花前胡乙素/白花前胡甲素本身差異較大,因此,前胡與摻假硬前胡的比值存在重疊部分,約65%的正品前胡的比值小于0.20,約78%的摻假前胡的比值大于0.20,顯示一定的同質(zhì)性,留后進(jìn)一步研究。但是對(duì)于前胡與硬前胡,采用比值法完全可以進(jìn)行區(qū)分。
3.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化
3.1.1 供試品提取方法考察參考文獻(xiàn)和《中國(guó)藥典》中的方法,選擇了三氯甲烷、不同比例的甲醇和乙醇進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)使用純甲醇進(jìn)行提取時(shí),色譜峰信號(hào)較多,且各成分的提取量較多,故選擇純甲醇作為提取溶劑。
3.1.2 供試品提取時(shí)間考察在相同的提取溶劑下,隨著超聲時(shí)間的增加,各成分的提取量增多,但實(shí)際增加的量較小,根據(jù)結(jié)果選擇超聲處理30 min。
3.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇比較前胡、硬前胡、硬前胡摻假樣品不同波長(zhǎng)色譜圖發(fā)現(xiàn),320 nm時(shí)藥材的色譜峰信息最全、基線最好、各特征峰的紫外吸收較強(qiáng)。故選擇320 nm的波長(zhǎng)為該方法檢測(cè)波長(zhǎng)。
3.2 前胡與硬前胡及摻假的識(shí)別對(duì)前胡、硬前胡和前胡中摻假不同比例硬前胡,進(jìn)行白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值、相似度分析和聚類分析,結(jié)果三種分析方法都可以將前胡與硬前胡完全區(qū)分;而前胡和前胡中摻假不同比例硬前胡峰面積比值存在重疊情況,未能完全識(shí)別。
3.3 檢驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC色譜方法,采用峰面積比值、相似度分析和聚類分析均可前胡與硬前胡的識(shí)別。作為標(biāo)準(zhǔn),建議規(guī)定白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值1.0為區(qū)分前胡與硬前胡的判別條件,小于1.0為前胡,大于1.0為硬前胡。
3.4 結(jié)論經(jīng)過對(duì)前胡、硬前胡和模擬摻假樣品的研究,通過白花前胡乙素/白花前胡甲素的峰面積比值、聚類和特征圖譜相似度等分析的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)所建立的方法能夠準(zhǔn)確、有效檢驗(yàn)前胡和硬前胡,并且這些方法具有簡(jiǎn)單、快速、高效的功能。