李霞，李慧，許聰聰，李軍峰，張冬冬

作者單位：1棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 棗莊 277800；2棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277800；3棗莊市薛城區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277800

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高且發(fā)病迅速導(dǎo)致病人生存率降低，目前肝癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［1］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）在肝癌等腫瘤組織中異常表達(dá)，并可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程從而抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展，研究表明天然植物提取物可能通過(guò)調(diào)控LncRNA表達(dá)從而影響肝癌細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過(guò)程［2-3］。但關(guān)于LncRNA與天然植物提取物調(diào)控的肝癌細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程之間的關(guān)系尚未完全闡明。肉靈芝又稱太歲，其主要組成成分為多糖類、維生素、氨基酸等，研究表明肉靈芝提取物具有抗腫瘤、抗氧化等作用［4］。但肉靈芝提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。長(zhǎng)鏈非編碼

RNA NBR2（long non-coding RNA neighbour of BRCA1 gene 2，LncRNA NBR2）在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，姜黃素可通過(guò)上調(diào)LncRNA NBR2的表達(dá)而激活A(yù)MPK信號(hào)通路從而抑制結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程［5］。雙特異性磷酸酶4/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（dual specificity protein phosphatase 4/extracellular signal regulated kinase，DUSP4/ERK）信號(hào)通路激活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲，而抑制DUSP4/ERK信號(hào)通路的活化可抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲［6］。但肉靈芝提取物與LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路在肝癌細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程中的調(diào)控關(guān)系尚未可知。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)肉靈芝提取物在抑制肝癌細(xì)胞Hep3B增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路的表達(dá)變化，試圖闡明LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路可能參與肉靈芝提取物調(diào)控的Hep3B細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程，為肝癌靶向治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑肉靈芝提取物干粉購(gòu)自吉林省白山市林源春生物科技有限公司；肝癌細(xì)胞Hep3B購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；MTT、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine2000、pcDNA3.1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；si-LncRNA NBR2、si-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（prolif-erating cell nuclear antigen，PCNA）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人DUSP4、p-ERK抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組肉靈芝提取物干粉（1.5 g）溶解于蒸餾水（900 mL）中，充分混勻后轉(zhuǎn)移至容量瓶中（1 000 mL），定容至1 000 mL，充分混勻，制備濃度為1.5 g/L的肉靈芝提取物母液，采用0.22 μm的濾頭過(guò)濾母液后密封，置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用時(shí)進(jìn)行稀釋，按照一定比例稀釋母液，調(diào)整藥物濃度分別為1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L［7］。Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)/孔），分別加入含有不同濃度（1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L）的肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h，分別記作1 mg/L肉靈芝提取物組、2 mg/L肉靈芝提取物組、4 mg/L肉靈芝提取物組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞）、si-LncRNA NBR2組（si-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞）、pcDNA-NC組（pcDNANC轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞）、pcDNA-LncRNA NBR2組（pcDNA-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞）、肉靈芝提取物+si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，加入含有濃度為4 mg/L肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h）、肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組（si-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，加入含有濃度為4 mg/L肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h）。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞接種至96孔板（5×103個(gè)/孔），按照“1.2.1”分組處理，加入MTT溶液（每孔20 μL），加入DMSO（每孔150 μL），應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為490 nm處的OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集各組Hep3B細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，分別加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA NBR2的表達(dá)水平采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。LncRNA NBR2以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA NBR2相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PCNA、Cleaved-caspase-3、DUSP4、p-ERK蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響與NC組比較，1 mg/L肉靈芝提取物組、2 mg/L肉靈芝提取物組、4 mg/L肉靈芝提取物組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），選取4 mg/L肉靈芝提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1，表1。

圖1 不同濃度肉靈芝提取物抑制Hep3B細(xì)胞PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)

表1 不同濃度肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響/±s

表1 不同濃度肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響/±s

注：①與NC組比較，P＜0.05。

組別NC 1 mg/L肉靈芝提取物2 mg/L肉靈芝提取物4 mg/L肉靈芝提取物F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 PCNA 0.91±0.09 0.75±0.07①0.55±0.05①0.32±0.04①137.04＜0.001細(xì)胞增殖率/%100.27±9.14 81.24±7.68①62.12±6.01①38.06±3.17①135.09＜0.001

2.2 肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響與NC組比較，肉靈芝提取物組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖2，表2。

圖2 肉靈芝提取物抑制Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)

表2 肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響/±s

表2 肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響/±s

組別NC肉靈芝提取物t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 Cleaved-caspase-3 0.43±0.04 0.88±0.07 16.75＜0.001凋亡率/%8.69±0.71 25.16±2.21 21.29＜0.001

2.3 肉靈芝提取物對(duì)NBR2表達(dá)的影響與NC組比較，肉靈芝提取物組LncRNA NBR2的表達(dá)水平升高［（3.46±0.31）比（1.00±0.11），t=22.44，P＜0.05］。

2.4 NBR2對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響與si-NC組比較，si-LncRNA NBR2組細(xì)胞增殖率、PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-LncRNA NBR2組細(xì)胞增殖率及PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 NBR2對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響/±s

表3 NBR2對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。②與pcDNA-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LncRNA NBR2 pcDNA-NC pcDNA-LncRNA NBR2 F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.10 0.42±0.04①1.00±0.11 2.89±0.25①482.60＜0.001 PCNA 0.91±0.09 1.32±0.11①0.92±0.09 0.40±0.04②171.08＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.46±0.04 0.19±0.02①0.48±0.05 0.83±0.08②227.45＜0.001細(xì)胞增殖率/%100.00±9.17 132.76±11.26①100.00±9.47 61.58±5.32②92.81＜0.001凋亡率/%8.51±0.72 3.89±0.31①8.63±0.73 18.16±1.71②317.87＜0.001

圖3 NBR2對(duì)Hep3B細(xì)胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5 LncRNA NBR2低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響與肉靈芝提取物+si-NC組比較，肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組細(xì)胞增殖率及PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05），見圖4，表4。

表4 NBR2低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響/±s

表4 NBR2低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響/±s

注：①與肉靈芝提取物+si-NC組比較，P＜0.05。

組別肉靈芝提取物+si-NC肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2 t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.09 0.46±0.03①17.08＜0.001 PCNA 0.30±0.04 0.73±0.07①16.00＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.86±0.08 0.50±0.05①11.45＜0.001細(xì)胞增殖率/%100.00±10.32 152.12±14.76①17.19＜0.001凋亡率/%24.96±2.11 13.07±1.05①15.14＜0.001

圖4 LncRNA NBR2低表達(dá)逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對(duì)Hep3B細(xì)胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.6 DUSP4/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況與NC組比較，肉靈芝提取物組DUSP4、p-ERK蛋白水平降低（P＜0.05），si-LncRNA NBR2組DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05）；與肉靈芝提取物+si-NC組比較，肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05），見圖5，表5。

表5 DUSP4/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況/±s

表5 DUSP4/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況/±s

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與肉靈芝提取物+si-NC組比較，P＜0.05。

組別NC肉靈芝提取物si-LncRNA NBR2肉靈芝提取物+si-NC肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2 F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 9 DUSP4 0.79±0.07 0.35±0.03①1.02±0.09①0.38±0.04 0.70±0.06②189.59＜0.001 p-ERK1 0.37±0.03 0.12±0.01①0.45±0.04①0.04±0.01 0.34±0.03②382.88＜0.001 p-ERK2 0.60±0.06 0.27±0.02①0.88±0.09①0.25±0.03 0.58±0.05②199.54＜0.001 ERK1 0.42±0.04 0.40±0.04 0.39±0.03 0.41±0.04 0.38±0.03 1.71 0.168 ERK2 0.86±0.08 0.89±0.08 0.85±0.07 0.87±0.06 0.84±0.07 0.64 0.640

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肉靈芝提取物和LncRNA NBR2對(duì)DUSP4/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

3 討論

肝癌早期癥狀不明顯導(dǎo)致病人確診時(shí)已處于中晚期，而天然植物的有效成分具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用，且副作用較小，既往研究顯示胡蘿卜苷等中藥具有抗肝癌的作用，多種中藥具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)等作用，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明［8-9］。

肉靈芝提取物抗肝癌的作用機(jī)制尚未闡明，本研究結(jié)果顯示不同濃度的肉靈芝提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，肉靈芝提取物處理后PCNA的表達(dá)下調(diào)，Cleaved-caspase-3的表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似［10-11］，證實(shí)肉靈芝提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

NBR2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平降低，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1途徑而抑制非小細(xì)胞肺癌EMT進(jìn)展［12］。NBR2表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)傳導(dǎo)而抑制骨肉瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化［13］。本研究結(jié)果顯示肉靈芝提取物處理后肝癌細(xì)胞中NBR2的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步分析顯示干擾NBR2表達(dá)后細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低，PCNA的表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平降低，而NBR2過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，PCNA的表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高，提示肉靈芝提取物可能通過(guò)上調(diào)NBR2的表達(dá)從而發(fā)揮抗肝癌的作用。同時(shí)本研究結(jié)果顯示干擾NBR2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。ERK屬于MAPKs家族成員，DUSP4屬于雙特異性磷酸酶家族成員，其可通過(guò)促進(jìn)ERK磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制DUSP4/ERK信號(hào)通路活化可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲［14-15］。本研究結(jié)果顯示肉靈芝提取物可明顯降低DUSP4、p-ERK的表達(dá)水平，干擾NBR2表達(dá)后DUSP4、p-ERK蛋白水平明顯升高，而干擾NBR2表達(dá)與肉靈芝提取物共同處理后DUSP4、p-ERK蛋白水平明顯升高，提示NBR2可能通過(guò)抑制DUSP4/ERK信號(hào)通路激活而發(fā)揮作用，肉靈芝提取物可通過(guò)上調(diào)NBR2表達(dá)而調(diào)控DUSP4/ERK信號(hào)通路從而影響肝癌細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程。

綜上所述，NBR2/DUSP4/ERK通路介導(dǎo)肉靈芝提取物對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，但NBR2/DUSP4/ERK通路的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明，NBR2可能作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。