朱舜明，張榮懷，張學(xué)軍，邴森

作者單位：1陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，陜西 西安 710068；2西安市第三醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710068

急性心肌缺血后，通過藥物或機(jī)械干預(yù)恢復(fù)病人冠狀動脈血流（再灌注）對于挽救病人心肌功能至關(guān)重要［1］；但再灌注會引發(fā)病人機(jī)體局部氧化爆發(fā)和高水平炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡，造成“再灌注損傷”［2］。改善急性心肌梗死的臨床結(jié)局，探索減輕缺血-再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷的新型治療藥物，對于該病的臨床診斷和治療至關(guān)重要［3］。

阿魏酸（Ferulic acid）是一種廣泛存在的酚類化合物，在諸如堅果、西紅柿和當(dāng)歸（Angelica sinensis）等植物中均有發(fā)現(xiàn)，其對多種疾病具有良好的治療活性［2］。阿魏酸能夠通過抑制環(huán)氧合酶（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）改善血管內(nèi)皮功能［4］。此外，阿魏酸通過降低活性氧（ROS）水平，進(jìn)而預(yù)防慢性炎癥性疾?。?］。但對阿魏酸在心肌I/R所致細(xì)胞損傷中的作用目前仍未引起足夠關(guān)注。

凋亡是程序性細(xì)胞死亡的主要類型，與I/R損傷緊密相關(guān)［6-7］。胱天蛋白酶（caspase）是介導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其中caspase-3被認(rèn)為是重要的凋亡啟動子［8］。盡管已證實磷酸肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine protein kinase，PI3K/Akt）途徑調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化和凋亡［9］，但其在阿魏酸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用中的分子機(jī)制還有待研究。

本研究自2018年10月至2019年7月通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支法構(gòu)建心肌缺血再灌注大鼠模型，探究阿魏酸和PI3K/Akt的作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物阿魏酸和LY294002購于美國Sigma Chemical公司。PI3K和Akt酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于美國Cusabio Biotech公司。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于德國Roche Diagnostics公司?？筂DA5、SOD1、TNFα、IL-6、IL-1β、Caspase-3、Cleaved caspase-3、PI3K、p-Akt（Ser473）、Akt、eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-mTOR（Ser2448）和β-actin蛋白一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。BCA蛋白定量分析試劑盒和二抗購于中國Beyotime Biotechnology公司。其余試劑均為分析純。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（200～220 g）由陜西省人民醫(yī)院［SYXK（陜）2016-006］提供。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組所有實驗大鼠均可自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)溫度22～24°C，濕度50%～60%，12 h明暗循環(huán)。48只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組（n=12）：（1）假手術(shù)組（sham組）；（2）I/R模型組（I/R組）；（3）阿魏酸+I/R組（Fer+I/R組）；（4）阿魏酸+LY294002+I/R組（Fer+LY+I/R組）。

1.2.2 I/R大鼠模型建立及給藥處理通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg），待大鼠完全麻醉后，仰臥位固定。再分別接入動物呼吸機(jī)以及心電監(jiān)護(hù)儀，于大鼠胸部左側(cè)第5根肋骨處縱向切開，鈍性分離肌肉組織，暴露胸腔。剪開心包膜后，用6-0絲線將冠狀動脈左前降支（LAD）結(jié)扎。當(dāng)監(jiān)護(hù)儀指標(biāo)顯示脈搏減弱、左心室心肌顏色發(fā)白，并且其心電圖的ST段顯著抬高，表示結(jié)扎成功。結(jié)扎30 min后持續(xù)對大鼠灌注3 h，當(dāng)ST段出現(xiàn)50%以上回落，則判定為I/R大鼠模型建立成功。

假手術(shù)組大鼠僅打開胸腔，不結(jié)扎。在I/R建模30 min前，假手術(shù)組和I/R組按100 mg/kg腹膜注射0.9%氯化鈉注射液，F(xiàn)er+I/R組大鼠腹膜內(nèi)注射阿魏酸（10 mg/kg）。Fer+LY+I/R組大鼠在I/R建模30 min前腹膜內(nèi)注射阿魏酸（10 mg/kg），再于麻醉后，LAD結(jié)扎前，通過尾靜脈注射LY294002（0.3 mg/kg）。

1.2.3 HE染色脊椎脫臼法處死大鼠后，暴露胸腔后取出心臟，使用預(yù)冷生理鹽水清洗，去除大血管及結(jié)締組織，用濾紙拭干。再將大鼠左心室心肌用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，橫向切成4 μm厚切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡（IX51，Olympus，日本）下觀察。病變程度量化：（-）無病變；（+）局部病變；（++）零星散布病變；（+++）融合性病變；（++++）大量塊狀病變。

1.2.4 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡各組大鼠心臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，使用商業(yè)試劑盒（Roche）進(jìn)行TUNEL測定，以評估不同組大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度。Fluorescein-dUTP著色為凋亡細(xì)胞數(shù)，呈綠色；4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）著色為總細(xì)胞數(shù)，呈藍(lán)色。為確定心肌細(xì)胞凋亡程度，每組隨機(jī)選擇6個視野（×200），使用Image Pro Plus 6.0計算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 心肌超微結(jié)構(gòu)觀察分離大鼠心臟組織，先用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）清洗，再于4°C磷酸鹽緩沖液中用1%四氧化鋨固定2 h。使用Araldite CY212包埋后，通過超薄切片機(jī)（Ultracut E，Reichert，奧地利）制備70～80 nm超薄切片。再用乙酸鈾酰和乙酸鉛染色，在透射電子顯微鏡（Morgagni 268D，F(xiàn)eiCo，荷蘭）下觀察記錄各組心肌細(xì)胞形態(tài)輪廓，線粒體和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，以及閏盤Z線變化情況。

1.2.6 ELISA檢測按照試劑盒說明書要求，使用PI3K和Akt ELISA試劑盒檢測各組大鼠心肌組織中PI3K和Akt表達(dá)水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）處死大鼠后開胸取出心臟，稱取約200 mg心臟組織，剪碎并用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）清洗。再加入預(yù)冷RIPA裂解緩沖液提取總蛋白；裂解液在4℃、12 000 r/min離心5 min。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白樣品通過SDSPAGE電泳分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜與5%脫脂牛奶在Tris緩沖液中4℃孵育過夜封閉。封閉膜后，再與抗MDA5、SOD1、TNF-α、IL-6、IL-1β、Caspase-3、Cleaved caspase-3、PI3K、p-Akt（Ser 473）、Akt、eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-mTOR（Ser2448）和β-actin一抗孵育過夜。用TBST洗滌3次，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG室溫孵育1 h。使用ECLPLUS系統(tǒng)檢查蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化情況。通過Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有計量數(shù)據(jù)均表示為±s，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較SNK-q法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸干預(yù)明顯減輕I/R大鼠心臟組織病理學(xué)變化通過蘇木精-伊紅染色對I/R誘導(dǎo)損傷和阿魏酸干預(yù)對大鼠心臟組織損害程度進(jìn)行分析。染色結(jié)果顯示，相較于假手術(shù)組，I/R組大鼠心肌中表現(xiàn)出明顯的炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞壞死和水腫。在Fer+I/R組大鼠中，心肌細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤，及細(xì)胞水腫病變均明顯低于I/R組，且心肌纖維結(jié)構(gòu)更清晰完整（圖1和表1）。

表1 不同實驗組大鼠心肌組織病理學(xué)分級

2.2 阿魏酸干預(yù)抑制I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡TUNEL/DAPI雙 重 染 色 結(jié) 果 顯 示，I/R組［（55.45±1.14）%］大鼠存在嚴(yán)重的心肌組織損傷，F(xiàn)er+I/R組［（18.73±1.01）%］大鼠TUNEL陽性心肌細(xì)胞百分比明顯低于I/R組（P＜0.001）；Fer+LY+I/R組［（46.81±1.56）%］凋 亡 指 數(shù) 明 顯 高 于Fer+I/R組（P＜0.01）（圖2）。

Western blotting分析結(jié)果表明，與I/R組（3.98±0.28）相比，F(xiàn)er+I/R組（2.01±0.14）大鼠活性Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而Fer+LY+I/R組（3.76±0.25）大鼠Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)高于Fer+I/R組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 阿魏酸顯著抑制I/R誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的Cleaved caspase-3免疫印跡結(jié)果

2.3 阿魏酸干預(yù)顯著激活PI3K/Akt信號通路心肌組織PI3K和Akt蛋白ELISA檢測結(jié)果顯示，I/R組［PI3K：（14.58±0.96）ng/L；Akt：（0.27±0.07）μg/L］大鼠心肌組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù) 組［PI3K：（21.32±1.26）ng/L；Akt：（0.38±0.08）μg/L］；Fer+I/R組［PI3K：（27.52±2.73）ng/L；Akt：（0.72±0.15）μg/L］大鼠PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平均明顯高于I/R組（P＜0.05）。

PI3K/Akt信號通路各蛋白Western blotting檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，PI3K/Akt信號通路下游靶標(biāo)p-eNOS（Ser1177）和p-mTOR（Ser2448）蛋白表達(dá)水平也明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；而Fer+I/R組上述蛋白表達(dá)水平均高于I/R組（P＜0.05）（圖4和表2）。

表2 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖4 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測

2.4 阿魏酸干預(yù)可保護(hù)I/R損傷后大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整性TEM心肌超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠出現(xiàn)明顯肌原纖維變性、線粒體腫脹、不規(guī)則線粒，以及心肌細(xì)胞閏盤Z線扭曲。在Fer+I/R組大鼠中，心肌細(xì)胞核及其線粒體結(jié)構(gòu)均保持完整，沒有明顯的肌原纖維變性，與假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)相近。而Fer+LY+I/R組大鼠心肌組織細(xì)胞排列紊亂，有明顯心肌纖維斷裂，細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重，其心肌超微結(jié)構(gòu)病變與I/R組相似（圖5）。

圖5 阿魏酸顯著改善I/R大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)：A為假手術(shù)組；B為I/R組；C為Fer+I/R組；D為Fer+LY+I/R組。

2.5 阿魏酸干預(yù)抑制I/R大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)Western blotting分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠MDA5蛋白表達(dá)水平，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），SOD1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與I/R組相比，F(xiàn)er+I/R組大鼠MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），SOD1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。而與Fer+I/R組相比，F(xiàn)er+LY+I/R組 大 鼠SOD1含 量 明 顯 下 調(diào)，MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖6和表3）。

表3 I/R大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖6 阿魏酸顯著抑制I/R大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平

3 討論

I/R是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激調(diào)控［10］。研究顯示誘導(dǎo)I/R后，大鼠心肌細(xì)胞損傷明顯，出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡表型［11］；與永久性缺血大鼠相比，再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡率也顯著增加［12］。

I/R可能激活casepase凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)。其中，caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，活性caspasse-3直接參與誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、酶和DNA等生物活性大分子降解。紫草素（Shikonin）和褪黑素（Melatonin）通過下調(diào)caspase-3表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，明顯緩解I/R模型動物心肌損傷［13-14］。本研究TUNEL/DAPI雙重染色及Western blotting實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未檢測到心肌組織caspase-3過度激活；阿魏酸干預(yù)能顯著下調(diào)I/R大鼠活性caspase-3蛋白表達(dá)水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，以減輕I/R大鼠再灌注期間心肌組織病理損傷。這表明，抑制I/R后心肌細(xì)胞凋亡是阿魏酸損傷發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。

心肌再灌注期間通過激活PI3K/Akt信號通路，降低氧化應(yīng)激，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)以及抑制心肌細(xì)胞凋亡，可以明顯降低I/R損傷的發(fā)病率和死亡率［15-16］。受PI3K調(diào)控的Akt在Ser473位點磷酸化后激活［17］，產(chǎn)生p-Akt，進(jìn)一步刺激下游效應(yīng)靶標(biāo)，如eNOS、mTOR、NF-κB、Bcl-2蛋白家族和caspase蛋白家族［18］，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性，以提高心肌細(xì)胞存活率［9］。其中，eNOS磷酸化及其產(chǎn)生的NO在Akt介導(dǎo)的抗凋亡作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［19］。因此，本研究研究了阿魏酸干預(yù)對PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白表達(dá)的影響。免疫組化和蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，eNOS磷酸化水平增加與PI3K蛋白上調(diào)和Akt磷酸化同時發(fā)生。LY294002是一種特異性阻斷PI3K細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的蛋白激酶抑制劑［20］，結(jié)合TEM心肌超微結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Fer+I/R組大鼠心肌細(xì)胞核及其線粒體結(jié)構(gòu)均保持完整；而阿魏酸+LY294002組觀察到明顯肌原纖維變性、線粒體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，以及Z線扭曲。LY294002處理逆轉(zhuǎn)了阿魏酸對I/R大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。上述結(jié)果表明，阿魏酸通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑保護(hù)I/R大鼠心臟免受I/R誘導(dǎo)損傷。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一種重要的抗氧化金屬酶，通過調(diào)控胞內(nèi)活性氧水平，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要作用［21］。細(xì)胞氧化應(yīng)激失衡導(dǎo)致丙二醛（malondialdehyde，MDA）不斷積累，對線粒體和溶酶體造成不可逆損傷［22］。IL-6、IL-1β和TNF-α等分泌型炎癥調(diào)控因子表達(dá)水平失衡會明顯加劇I/R病理發(fā)展［23］。本文實驗結(jié)果顯示，阿魏酸明顯抑制I/R大鼠MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)，并上調(diào)SOD1蛋白水平。這表明阿魏酸對I/R大鼠發(fā)揮心臟保護(hù)作用與其抗炎和抗氧化特性有關(guān)。

本研究也存在一定局限性。首先，盡管選擇使用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路，但關(guān)于LY294002是否對心肌組織存在影響并沒有做詳細(xì)的研究。在后續(xù)研究中，我們也將以大鼠為動物模型，進(jìn)一步分析LY294002對大鼠心肌組織的作用，以期能夠更為全面地解析阿魏酸對PI3K/Akt途徑與大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響關(guān)系。其次，本文結(jié)果仍需要結(jié)合臨床研究數(shù)據(jù)做進(jìn)一步佐證。

綜上，阿魏酸干預(yù)可有效預(yù)防I/R大鼠心肌損傷。阿魏酸通過激活PI3K/AKT信號通路，減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，以緩解I/R誘導(dǎo)心肌損傷。在未來，阿魏酸有望為臨床預(yù)防I/R心肌損傷提供新的思路。