鄭茂，鄒玉，王潔瑩，況南珍，傅穎媛

作者單位：1德陽市人民醫(yī)院檢驗科，四川 德陽 618000；2南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；3海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，海南 海口 570100

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的全身性自身免疫性疾病，主要病理特征是骨與軟骨組織受損，繼而造成關(guān)節(jié)破壞［1］。RA病程長、預(yù)后差、致殘性大，且病情進行性加重，一直以來是臨床研究關(guān)注的重點。然而，RA確切的發(fā)病機制仍未完全闡明，目前的研究觀點主要認為與滑膜細胞異常增生密切相關(guān)［2］。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是RA滑膜內(nèi)膜襯里的主要填充細胞，在滑膜襯里層處于極度活躍的狀態(tài)，呈腫瘤樣增殖，在RA病人滑膜病變及關(guān)節(jié)損傷中起著關(guān)鍵作用［3］。因此，抑制FLS增生對控制RA發(fā)病及病情進展具有重要意義。

瑞香素（daphnetin，DAP），化學(xué)名7，8-二羥基香豆素，是金邊瑞香、長白瑞香等瑞香屬植物的主要活性成分，為我國自主研發(fā)的天然藥物。文獻報道顯示，DAP具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［4］。本課題組前期研究從金邊瑞香中分離提純出DAP，并發(fā)現(xiàn)DAP可抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA，一種類風濕關(guān)節(jié)炎常用的動物模型）的關(guān)節(jié)炎癥，改善關(guān)節(jié)病變，提高Foxp3+Treg細胞水平，使Th17/Treg趨于平衡［5-7］。體外實驗還發(fā)現(xiàn)DAP能促使CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes in collagen-induced arthritic rats，CIA-FLS）的促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL、p53去甲基化，以及降低Bcl-2、STAT3基因的表達，使其出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象［8-9］。然而，DAP誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡的信號途徑尚不清楚。為此，本研究自2018年3―9月利用DAP結(jié)合不同特異性含半胱氨酸的胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）抑 制 劑，觀 察DAP對CIA-FLS增殖與凋亡的影響，旨在初步探討DAP誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡的可能機制途徑，為DAP用于臨床治療RA提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞系CIA-FLS購于上海研生實業(yè)有限公司，許可證號J2900117872001。細胞采用含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，CIA-FLS為貼壁生長。

1.2 藥物DAP化學(xué)式C9H6O4，純度≥98%，購于北京索萊寶生物科技有限公司。將20 mg DAP溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO）配成20 g/L貯存液，使用時以培養(yǎng)液稀釋至目標濃度。

1.3 試劑caspase-3抑制劑（Casp3-In，美國Selleck公司），caspase-8抑制劑（Casp8-In，美國Santa Cruz公司），caspase-9抑制劑（Casp9-In，美國Santa Cruz公司），泛caspase抑制劑（Pancasp-In，美國Selleck公司），人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（上海貝博生物公司），Hoechst 33258染液（上海貝博生物公司），AnnexinVFITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（美國BD公司），離心柱型總RNA提取試劑盒（北京天根科技公司），PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司），Real-time PCR試劑盒（日本TOYOBO公司），PCR引物（北京華大基因公司），含鏈霉素青霉素的DMEM培養(yǎng)液（北京索萊寶生物公司），胎牛血清（天津灝洋生物公司），AccutaseTM細胞分離溶液（美國eBioscience公司）。

1.4 儀器二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），超凈工作臺（上海博迅公司），水平搖床（海門其林貝爾公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），流式細胞儀（美國BD公司），PCR熱循環(huán)儀（美國Thermo Scientific公司），Real-time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 CCK-8檢 測DAP對CIA-FLS增 殖 的 影 響取生長良好的對數(shù)期CIA-FLS，加入AccutaseTM細胞分離液消化，低速離心收集細胞，再加入培養(yǎng)液重懸后計數(shù)細胞濃度，將細胞接種于96孔板（每孔約8×103個細胞）。培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度DAP（終濃度分別為0、5、10、20、40、80 mg/L），每個濃度設(shè)3個平行孔，對照孔（含細胞）和空白孔（不含細胞）加入等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，輕輕混勻，并放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h再取出，在酶標儀上測定各孔450 nm處的吸光度（OD）。CIA-FLS細胞活力（%）=（實驗孔OD值－空白孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

2.2 Real-time PCR檢 測DAP對CIA-FLS中caspase基因的影響取CIA-FLS接種于24孔板（每孔約5×104個細胞），培養(yǎng)12 h后，加入DAP（終濃度為40 mg/L）處理48 h，并設(shè)細胞對照孔。培養(yǎng)結(jié)束后提取CIA-FLS的總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：11 μL RNase-free Water，4 μL RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，1 μL Primer Mix，3 μL Total RNA）。將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA繼續(xù)進行實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)（擴增反應(yīng)體系：6.4 μL RNase-free Water，10 μL Master Mix，0.8 μL Forward primer，0.8 μL Reverse primer，2 μL cDNA）。每個基因設(shè)3個平行管，采用公式2-ΔΔCt計算目標基因caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA相對表達量。

2.3 caspase抑制劑不同條件預(yù)處理后，CCK-8檢測DAP對CIA-FLS增殖的影響取CIA-FLS接種于96孔板（每孔約8×103個細胞），培養(yǎng)12 h后，分別加入不同濃度的各caspase抑制劑預(yù)處理1、2、4 h，再加入DAP共處理48 h，其中Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L，Pancasp-In終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，DAP終濃度為40 mg/L。其余實驗步驟同2.1，最后計算各孔CIA-FLS細胞活力。

2.4 Hoechst 33258熒光染色觀察CIA-FLS凋亡形態(tài)取CIA-FLS接種于24孔板（每孔約5×104個細胞），培養(yǎng)12 h后，分別加入各caspase抑制劑預(yù)處理2 h，再加入DAP共處理48 h，其中Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In終濃度為5 μmol/L，Pancasp-In終濃度為20 μmol/L，DAP終濃度為40 mg/L，并設(shè)細胞對照孔。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去各孔培養(yǎng)液，加入PBS洗滌1 min。將Hoechst 33258染液稀釋30倍制成染色工作液，每孔加入200 μL染色工作液，室溫避光染色10 min。吸去染色液，加入PBS水平緩搖洗滌3 min，重復(fù)3次。染色完成后盡快置于熒光顯微鏡下，選擇340～350 nm藍色激發(fā)光觀察細胞凋亡形態(tài)，并拍照留存。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測CIA-FLS凋亡率細胞分組同“2.4”，CIA-FLS培養(yǎng)48 h后，加入AccutaseTM細胞分離液，室溫消化后低速離心，使用流式管收集細胞。每管加入預(yù)冷PBS洗滌2次，低速離心后棄盡上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細胞，再分別加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，最后上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DAP對CIA-FLS增殖的影響如圖1所示，倒置顯微鏡下可觀察到CIA-FLS為成纖維樣生長形態(tài)，貼壁狀態(tài)良好，細胞排列均勻；經(jīng)DAP作用后CIA-FLS生長狀態(tài)受到抑制，細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變形且貼壁能力下降。經(jīng)DAP作用后CIAFLS細胞活力明顯下降，并與DAP作用濃度呈劑量依賴性。當DAP濃度為40 mg/L時，CIA-FLS細胞活力在50%左右，故后續(xù)實驗選擇此濃度繼續(xù)研究。

3.2 DAP對CIA-FLS中caspase基因的影響如表1所示，經(jīng)DAP（終濃度為40 mg/L）作用48 h后，與對照組相比，CIA-FLS的caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA相對表達量明顯增加（P＜0.05）。由此可見，DAP可以激活CIA-FLS的caspase通路。

表1 DAP對CIA-FLS中caspase基因mRNA相對表達量的影響/±s

表1 DAP對CIA-FLS中caspase基因mRNA相對表達量的影響/±s

組別對照組DAP組F值P值caspase-3 1.00±0.00 3.07±0.43 69.47 0.001 caspase-8 1.00±0.00 1.67±0.09 171.29＜0.001 caspase-9 1.00±0.00 2.35±0.20 131.85＜0.001

3.3 caspase抑制劑不同條件預(yù)處理后，DAP對CIA-FLS增殖的影響與單獨DAP作用組相比，各caspase抑制劑預(yù)處理均在不同程度上影響DAP抑制CIA-FLS增殖的效應(yīng)。當Casp3-In、Casp9-In濃度為5 μmol/L，Pancasp-In濃度為20 μmol/L，預(yù)處理CIA-FLS 2 h或4 h，均可明顯提高CIA-FLS細胞活力；當Casp8-In濃度為5 μmol/L時亦可在一定程度上提高CIA-FLS細胞活力，但不如Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In效果明顯，而當Casp8-In濃度為20 μmol/L時，CIA-FLS細胞活力卻低于單獨DAP作用組。見圖2。

3.4 DAP對CIA-FLS凋亡形態(tài)的影響根據(jù)CCK-8實驗和初期預(yù)實驗，選擇Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In濃 度 為5 μmol/L，Pancasp-In濃 度 為20 μmol/L，預(yù)處理CIA-FLS 2 h，再與DAP（終濃度為40 mg/L）共處理48 h。如圖3所示，對照組細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，細胞排列均勻，未見明顯的凋亡熒光；DAP組細胞核形狀大小不一，出現(xiàn)較多濃染致密的顆粒狀、塊狀熒光，細胞核固縮、碎裂明顯，細胞數(shù)量明顯少于對照組；Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預(yù)處理組，呈均勻藍色熒光的正常細胞核較DAP組明顯增多，但仍可見到少量散在分布的顆粒狀熒光，少數(shù)細胞核碎裂；Casp8-In預(yù)處理組與DAP組差異不明顯，細胞數(shù)量較少。

3.5 DAP對CIA-FLS凋亡率的影響與對照組相比，經(jīng)DAP作用后CIA-FLS凋亡率明顯升高［（34.80±3.90）%比（5.68±1.35）%，P＜0.05］；各caspase抑制劑預(yù)處理組CIA-FLS凋亡率均明顯低于DAP組（P＜0.05）；各caspase抑制劑預(yù)處理組中，Casp8-In預(yù)處理組CIA-FLS凋亡率明顯高于Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預(yù) 處 理 組［（29.46±2.16）%比（18.09±2.50）%、（20.41±3.53）%、（10.17±1.91）%，P＜0.05］。

4 討論

FLS異常增生引發(fā)的持續(xù)性滑膜炎癥和軟骨破壞，是RA最顯著的病理特征［10］。研究表明FLS具有類腫瘤樣增殖和抗凋亡的特性，增生活化的FLS產(chǎn)生多種促炎細胞因子與基質(zhì)破壞性酶類，促進了FLS侵襲和破壞關(guān)節(jié)［11］。目前尚無根治RA的方法，臨床上常用的治療藥物包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等，雖然具有明顯對癥及抗炎效果，但相應(yīng)毒副作用大，不適合長期使用；新興生物靶向制劑如利妥昔單抗，具有一定療效，但價格昂貴且僅對部分難治性RA有效［12］。天然植物來源的活性單體藥物，具有來源廣泛、易于獲得、價格相對低廉、作用靶點多等優(yōu)勢，在臨床應(yīng)用方面日益受到關(guān)注，也是人類從自然界獲取新藥的重要途徑［13］。既往文獻報道中國傳統(tǒng)中藥活性成分如雷公藤多苷［14］、姜黃素［15］、白藜蘆醇［16］、青藤堿［17］等，治療RA病人或關(guān)節(jié)炎大鼠表現(xiàn)出較好療效，極大拓展了學(xué)者們對RA的研究思路。鑒于FLS存在異常增生和凋亡不足的特性，利用中藥活性單體成分干預(yù)來抑制FLS增殖、誘導(dǎo)其凋亡，有望成為一種治療RA行之有效的臨床方案［18］。

細胞凋亡是一種高度有序、受基因精細調(diào)控以及一系列酶參與的細胞自主性死亡方式，caspase家族是其中非常關(guān)鍵的調(diào)控因子。根據(jù)caspase在凋亡通路所處位置及執(zhí)行功能的不同，可將其分為兩大類，第一類是凋亡啟動因子（包括caspase-2/8/9/10），第二類是凋亡效應(yīng)因子（包括caspase-3/6/7）［19］。細胞凋亡主要有兩條經(jīng)典的介導(dǎo)通路，分別是死亡受體途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑中，死亡受體與相應(yīng)配體結(jié)合后發(fā)生多聚化，募集FADD，再與caspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，活化procaspase-8，激活下游效應(yīng)caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡［20］。線粒體途徑由細胞內(nèi)死亡信號如病毒、射線、化療藥物等激活，使線粒體膜通透性增加，造成Cyt-c等釋放入胞質(zhì)，在ATP/dATP存在情況下，Cyt-c與Apaf-1等結(jié)合形成多聚復(fù)合體，活化procaspase-9，激活下游效應(yīng)caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡［21］。由此可見，caspase-8、caspase-9分別是兩條凋亡途徑的上游啟動因子，而caspase-3是凋亡途徑末端共同的效應(yīng)因子。caspase貫穿這兩條途徑的始終，使其互相聯(lián)系、彼此影響，共同調(diào)節(jié)細胞凋亡過程。為此，本研究重點聚焦于caspase通路來探討DAP對CIA-FLS增殖與凋亡的影響。

本研究首先明確DAP對CIA-FLS增殖的影響，結(jié)合倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)和CCK-8試驗，證實DAP能以劑量依賴性的方式降低CIA-FLS細胞活力，抑制其增殖。此外，DAP促使CIA-FLS的caspase相關(guān)基因表達增加，說明這個過程中caspase通路激活。當采用不同caspase抑制劑預(yù)處理CIAFLS后，DAP的抑制作用不同程度減弱，這與caspase抑制劑的種類、濃度、預(yù)處理時間均存在關(guān)聯(lián)，特別是抑制劑種類。細胞發(fā)生凋亡時會出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)變化，如細胞核碎裂、細胞質(zhì)濃縮等，本研究利用Hoechst 33258熒光染色觀察到CIA-FLS呈均勻彌散熒光，而經(jīng)DAP作用后CIA-FLS細胞核形態(tài)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)較多典型的凋亡熒光，Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預(yù)處理組的凋亡現(xiàn)象較DAP組有不同程度改善。因此，我們推測DAP可能通過誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡，從而抑制其增殖，這一過程中caspase通路起著重要作用。

為了進一步明確DAP誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡的特性，并探討其主要參與哪條凋亡途徑，本研究還采用雙染流式細胞術(shù)檢測CIA-FLS凋亡率，發(fā)現(xiàn)各caspase抑制劑預(yù)處理組凋亡率較DAP組均明顯降低，以Pancasp-In預(yù)處理組降低最為明顯，但Casp8-In預(yù)處理組凋亡率卻明顯高于其他抑制劑預(yù)處理組。不難看出，通過熒光染色觀察到的凋亡情況與流式檢測結(jié)果基本一致，DAP可誘導(dǎo)CIA-FLS發(fā)生明顯凋亡改變。當抑制caspase通路后，可有效阻斷DAP誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡的效應(yīng)，并且抑制線粒體途徑的凋亡啟動因子對凋亡阻斷效果，明顯優(yōu)于抑制死亡受體途徑的凋亡啟動因子，說明線粒體途徑在這一過程中起著重要作用。文獻報道［22］RA病人的FLS在線粒體凋亡途徑中，可出現(xiàn)多種方式抵抗相關(guān)受體介導(dǎo)的凋亡，包括Bcl-2家族蛋白的功能失調(diào)、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)、p53突變等，表明線粒體凋亡途徑是FLS出現(xiàn)凋亡抵抗的重要原因，亦是天然藥物誘導(dǎo)FLS凋亡的重要潛在靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DAP可呈劑量依賴性地抑制CIA-FLS增殖，并通過caspase依賴的途徑誘導(dǎo)CIA-FLS發(fā)生凋亡，其中主要涉及線粒體凋亡途徑，表明DAP有望作為治療RA的一種天然候選藥物。值得注意的是，caspase通路涉及的調(diào)控基因眾多，以及其他少見凋亡通路的存在，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路［23］、非caspase依賴的凋亡通路［24］，故仍有待于我們后續(xù)的實驗研究來進一步剖析DAP誘導(dǎo)CIA-FLS凋亡的精細機制，特別是線粒體途徑中具體作用的分子靶位。