康翠翠，蔡曉慶，張妹，陳小嬌，王秋月，陳文平

（1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 平谷 101206；2.國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平谷綜合試驗(yàn)站，北京 平谷 101206）

沙門氏菌是一種常見(jiàn)的危害人與動(dòng)物的革蘭氏陰性菌，目前確定的沙門氏菌血清型已超過(guò)2 600種，其中腸炎沙門氏菌是引起人及動(dòng)物中毒的一種重要血清型沙門氏菌，嚴(yán)重危害人與動(dòng)物健康。雞白痢和禽傷寒沙門氏菌不僅可以造成雞群死亡，還可垂直傳播至下一代，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。目前，沙門氏菌的檢測(cè)方法包括選擇性增菌培養(yǎng)、血清型鑒定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、生化鑒定和以核酸為基礎(chǔ)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)。然而選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定和血清型鑒定耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)；ELISA法只適合于血清檢測(cè)；以核酸為基礎(chǔ)的PCR法檢測(cè)時(shí)間短、效率高，可以檢測(cè)各種樣品，因此成為目前沙門氏菌檢測(cè)廣受歡迎的一種方法。本文在前人研究基礎(chǔ)上，對(duì)禽源常見(jiàn)的通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌PCR檢測(cè)程序進(jìn)行優(yōu)化，提高檢測(cè)靈敏度，以期為后期飼料、水源或疾病診斷中沙門氏菌的檢出提供更加準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株：腸炎沙門氏菌（CVCC3762）和雞白痢沙門氏菌（CVCC533）標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，-80 ℃保存于本實(shí)驗(yàn)室。

材料：營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR mix、ddHO、DM 2000 DNA Marker均購(gòu)自北京匯天東方科技有限公司，瓊脂糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

待兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株融化后，取1 μL菌液放入裝有5 mL無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后取出備用。取1.5 mL菌液于2 mL無(wú)菌離心管中，12 000 rpm/min，4 ℃離心2 min，棄去上清液，沉淀嚴(yán)格按照動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌中的DNA。DNA提取完成后利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA濃度，并將DNA置于-20 ℃保存。

試驗(yàn)中所涉及的引物是根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成的，具體序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基于雞白痢沙門氏菌ipaj基因設(shè)計(jì)的引物來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)徐桂云實(shí)驗(yàn)室。

表1 沙門氏菌各血清型引物序列及原始反應(yīng)程序

1.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

原始PCR體系：2×Taq PCR mix 7 μL，前后引物（10 μM）各0.5 μL，DNA 1 μL，ddHO補(bǔ)充至15 μL。通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌反應(yīng)程序見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

為了確定通用型和各血清型沙門氏菌常規(guī)PCR的最佳退火溫度，本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)7個(gè)不同溫度梯度進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通用型沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的退火溫度梯度依次為45.6、49.8、52.4、55.1、57.7、62.1 ℃和64.1 ℃；腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的退火溫度梯度為46.6、50.8、53.4、56.1、58.7、63.1 ℃和65.1 ℃。利用各沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析后確定最佳退火溫度。

在確定最優(yōu)退火溫度后，將體系中引物終濃度分別調(diào)整至0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，確定其最佳引物濃度。

在確定最佳退火溫度及最佳引物濃度的基礎(chǔ)上，將體系中的循環(huán)數(shù)分別按照25、30個(gè)及35個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增，確定其引物最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

1.4 PCR檢測(cè)限測(cè)定及對(duì)比

用ddHO對(duì)DNA進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，獲得終濃度為430.0、43.0、4.3 pg/μL、430.0、43.0、4.3 fg/μL和430.0、43.0 ag/μL共8個(gè)梯度的DNA稀釋液，分別利用原始反應(yīng)體系（表1）及優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，確定優(yōu)化前后反應(yīng)體系的檢測(cè)限，從而確定該程序是否優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

通用型沙門氏菌程序優(yōu)化采用腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC3762）和雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC533）；雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌程序優(yōu)化采用雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC533）；腸炎沙門氏菌程序優(yōu)化采用腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC3762）。

2.1 退火溫度的優(yōu)化

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌程序均按照材料與方法1.3.1中設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖1 沙門氏菌退火溫度優(yōu)化結(jié)果

雞白痢沙門氏菌退火溫度在45.6～64.1 ℃范圍內(nèi)均可以擴(kuò)增出目的條帶（圖1 D），雞白痢傷寒沙門氏菌在46.6～63.1 ℃范圍內(nèi)可擴(kuò)增出目的條帶（圖1 E），通用型沙門氏菌在45.6～57.7 ℃、腸炎沙門氏菌在46.6～58.7 ℃范圍內(nèi)可擴(kuò)增出目的條帶（圖1 A～C）。其中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的退火溫度分別為52.4、52.4 ℃和53.4 ℃時(shí)，目標(biāo)條帶相對(duì)清晰；腸炎沙門氏菌在50.8 ℃時(shí)目標(biāo)條帶相對(duì)清晰，因此分別選擇50.8、52.4、52.4℃和53.4℃作為腸炎沙門氏菌、通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌引物的最適退火溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 引物濃度的優(yōu)化

在確定最佳退火溫度的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM共4個(gè)不同濃度梯度的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，確定其最佳引物濃度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 沙門氏菌引物濃度優(yōu)化結(jié)果

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌引物濃度在0.2～0.8 μM時(shí)擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，相對(duì)而言，引物濃度在0.4～0.8μM范圍內(nèi)，通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌（圖2 A，B，D，E）擴(kuò)增條帶均最為明顯，而腸炎沙門氏菌的引物濃度在0.6～0.8 μM范圍內(nèi)擴(kuò)增條帶最為明顯，因此在后續(xù)試驗(yàn)中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌引物濃度均選擇0.4 μM、腸炎沙門氏菌引物濃度選擇0.6 μM作為最適引物濃度。

2.3 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

按照確定的最佳退火溫度及引物濃度，將反應(yīng)體系分別擴(kuò)增25、30個(gè)和35 個(gè)循環(huán)，結(jié)果如圖3所示。其中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌循環(huán)數(shù)為25～35，腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30～35時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較為清晰，因此本試驗(yàn)分別將通用型沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)定為25、35、30和35進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 沙門氏菌擴(kuò)增循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.4 檢測(cè)限

沙門氏菌檢測(cè)程序優(yōu)化前后檢測(cè)限見(jiàn)圖4。

圖4 沙門氏菌檢測(cè)程序優(yōu)化優(yōu)化前后檢測(cè)限

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌PCR檢測(cè)方法優(yōu)化后，除雞白痢沙門氏菌外，通用型沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌檢測(cè)靈敏度均提高。程序優(yōu)化前，通用型沙門氏菌檢測(cè)限為43.0～430.0 pg/μL，優(yōu)化后通用型沙門氏菌檢測(cè)限為43.0～430.0 fg/μL。腸炎沙門氏菌優(yōu)化前檢測(cè)限為43.0 pg/μL，優(yōu)化后為4.3 pg/μL。雞白痢沙門氏菌優(yōu)化前后檢測(cè)限無(wú)變化，均為430.0 fg/μL。雞白痢傷寒沙門氏菌優(yōu)化前后檢測(cè)限分別為4.3 pg/μL 和43 fg/μL。

3 討論

雞白痢和禽傷寒沙門氏菌不僅可以通過(guò)水平傳播給同批次雞群，還可以通過(guò)垂直傳播傳遞給下一代，通常會(huì)造成雞群高死亡率、產(chǎn)蛋率下降等，給家禽產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而腸炎沙門氏菌不僅導(dǎo)致家禽發(fā)病，同時(shí)存在于家禽肉蛋等食品中，進(jìn)而導(dǎo)致人類發(fā)生食物中毒。因此雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的及時(shí)檢出對(duì)于雞群和人類的安全是至關(guān)重要的。然而目前用于檢測(cè)雞白痢和腸炎沙門氏菌的方法不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于檢測(cè)樣品也有局限性。研究表明，以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法比傳統(tǒng)檢測(cè)方法更加快捷、準(zhǔn)確且操作方便。以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法有普通PCR法和熒光定量PCR法，然而熒光定量PCR法對(duì)操作人員、操作環(huán)境及設(shè)備要求較高、試劑成本昂貴，并不適用于所有機(jī)構(gòu)。因此普通PCR仍是目前快速、準(zhǔn)確檢測(cè)病原的一種主流方式。

目前，對(duì)于通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的檢測(cè)靶基因有inv A、stn、ompA、ompC、glgC、tcpS、sdf I和SEN1392等。在PCR反應(yīng)體系中，基于靶基因設(shè)計(jì)的引物的退火溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù)是至關(guān)重要的。退火溫度一般低于引物Tm值5 ℃，約在50～65 ℃范圍內(nèi)。退火溫度太高會(huì)影響引物的結(jié)合效率，太低會(huì)增加引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，導(dǎo)致特異性降低。引物濃度需選擇適宜的濃度，盡可能使反應(yīng)特異性和擴(kuò)增效率達(dá)到最高。循環(huán)數(shù)要足夠，避免出現(xiàn)假陰性的情況。任何一個(gè)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)的引物序列是不同的，其退火溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù)也應(yīng)隨之變化。前人研究中通常使用的引物退火溫度為55～60 ℃，引物濃度為0.4 μM，循環(huán)數(shù)為30，然而此程序是否是引物的最佳擴(kuò)增程序尚不知道。本研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同的引物，其退火溫度是不同的；與原先程序及文獻(xiàn)中報(bào)道的各引物退火溫度相比，本研究中最佳退火溫度均降低3～6 ℃；引物濃度變化較小，只有腸炎沙門氏菌引物濃度增加至0.6 μM；對(duì)于循環(huán)數(shù)，除通用型沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌外，其它引物循環(huán)數(shù)均增加了5個(gè)。退火溫度、循環(huán)數(shù)等的變化可能與儀器品牌有關(guān)。由此說(shuō)明，對(duì)于每一種引物，應(yīng)對(duì)其退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)進(jìn)行探討，以確保檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，除雞白痢沙門氏菌外，其它沙門 氏 菌PCR檢 測(cè) 限 降 至4.3 pg/μL～430.0 fg/μL，提升了10～1 000倍。其中優(yōu)化后通用型沙門氏菌檢測(cè)限改善最大，提升了1 000倍。楊林等發(fā)現(xiàn)利用相同的引物通過(guò)多重PCR法檢測(cè)腸炎沙門氏菌檢測(cè)限為162.0 pg/μL，雞白痢傷寒沙門氏菌檢出限為214.0 pg/μL，其檢測(cè)限均在100.0 pg/μL以上。本研究中腸炎和雞白痢傷寒沙門氏菌檢測(cè)限分別為43.0 pg/μL和430.0 fg/μL，遠(yuǎn)超過(guò)前人研究，說(shuō)明本研究中腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌程序優(yōu)化效果明顯。本研究中雞白痢沙門氏菌在優(yōu)化前后退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)變化較小，其檢測(cè)限無(wú)明顯變化。張童利等人優(yōu)化以SEEP9120_017695基因設(shè)計(jì)的雞白痢沙門氏菌引物，其檢測(cè)限為2.13 pg/μL。本研究中雞白痢沙門氏菌檢測(cè)限為4.3 pg/μL，與張童利等人的結(jié)果無(wú)明顯差異，說(shuō)明雞白痢沙門氏菌引物程序無(wú)明顯變化。但本研究中雞白痢沙門氏菌循環(huán)數(shù)為30時(shí)即可達(dá)到檢測(cè)限，與傳統(tǒng)35個(gè)循環(huán)相比，大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。

綜上所述，對(duì)于各種引物，應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)設(shè)備、條件和需求進(jìn)行程序優(yōu)化，以便提高檢測(cè)靈敏度。本研究中，沙門氏菌PCR檢測(cè)方法優(yōu)化后，3種血清型及1種通用型沙門氏菌的檢測(cè)限均降低，檢測(cè)靈敏度大大升高，為后期環(huán)境、飼料及病料中多種沙門氏菌的及時(shí)檢出奠定了基礎(chǔ)。