孫長勝，徐振棟，沈佳奇

浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司（平湖 314200）

蟬花（Cordyceps chanhuaZ.Z. Li，F(xiàn).G. Luan，Hywel-Jones，C.R. Li & S.L. Zhang，sp. nov.），是蟲草科（Cordycipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps）[1]的一種，是在我國有上千年利用歷史的藥食兩用真菌，是寄生在蟬若蟲上形成的一種蟲生真菌。其主要成分有蟲草素、蟲草多糖、腺苷、甘露醇和麥角甾醇[2]，現(xiàn)代研究表明，其具有增強(qiáng)免疫力[3]、改善睡眠[4]、抗疲勞[5]、抗腫瘤[6]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[7]等功能。2021年1月蟬花子實體獲批新食品原料，成為繼蛹蟲草、廣東蟲草之后的第三個蟲草類新食品原料。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)蟬花多糖對果蠅有延壽抗氧化的功效，但對單純的蟬花子實體和孢子粉的延壽抗氧化功能還未有研究。此次研究將不同劑量不同蟬花產(chǎn)品添加到果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基中飼養(yǎng)果蠅，以探究不同劑量不同蟬花產(chǎn)品對果蠅壽命的延長作用，隨后通過測定各組果蠅組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）的活性及丙二醛（MDA）的含量來探究蟬花的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試驗動物：黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）W1118；蟬花子實體粉和孢子粉由浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司提供。

試劑：玉米粉、蔗糖、瓊脂、酵母粉、冰醋酸、無水乙醚；SOD試劑盒、MDA試劑盒、TP試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HPX-300BSH-3恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；ZHJH-C1214B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；H2100R高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ML304T分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 果蠅培養(yǎng)基的配制

將10 g瓊脂、80 g蔗糖、108 g玉米粉加入鍋中，再加900 mL涼水，充分?jǐn)嚢?，使玉米粉分散均勻，后加熱攪拌成糊狀，停止加熱，加入冰醋? mL攪拌均勻，再加入溶于100 mL溫水的10 g酵母粉，攪拌均勻，然后使用注射器將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基高約2 cm（大約8 mL），用脫脂棉球塞上管口，報紙封口，于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，隨后置于超凈工作臺冷卻凝固培養(yǎng)基，再置于37 ℃烘箱烘20 h使水汽蒸發(fā)，即獲得果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分裝前加入特定量的樣品混勻，即制成試驗培養(yǎng)基。

1.3.2 不同蟬花產(chǎn)品對果蠅壽命影響的測定

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.2%，1%和5%的蟬花孢子粉、子實體粉、混合粉（5%孢子粉+95%子實體粉，以該比例為蟬花孢子粉與子實體整體采收時的產(chǎn)品組成）飼養(yǎng)的果蠅為試驗組，以僅用基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅為空白對照組。選取8 h內(nèi)羽化成蟲的果蠅，用乙醚麻醉后鑒別分離雌雄果蠅，裝入培養(yǎng)管飼喂，每管10只果蠅，雌雄各設(shè)置3個重復(fù)，于25 ℃恒溫60%恒濕培養(yǎng)，每天記錄果蠅存活情況，最后統(tǒng)計果蠅平均壽命，半數(shù)死亡時間及最高壽命。

1.3.3 不同蟬花產(chǎn)品對果蠅體內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響

果蠅5%組織勻漿的制備：取不同培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d后的果蠅，乙醚麻醉，稱量其質(zhì)量（精確到0.000 1 g），用0.9%的生理鹽水充分研磨配制成5%的果蠅組織勻漿，并以4 000 r/min離心15 min，取上清液備用。果蠅組織中可溶性蛋白含量、SOD活力、MDA含量的測定均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對果蠅壽命的影響

以用基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅為空白對照組，以添加0.2%，1%和5%的不同蟬花產(chǎn)品飼養(yǎng)的果蠅為試驗組，探究蟬花孢子粉和子實體對果蠅壽命的影響。試驗結(jié)果如表1和表2所示。

表1 不同處理對雌果蠅壽命的影響

表2 不同處理對雄果蠅壽命的影響

對比表1空白對照組和劑量組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于雌果蠅來說，培養(yǎng)基中加入中、低劑量的孢子粉、子實體粉時，能極顯著增加雌果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.01），且低劑量的效果更高，平均壽命提高率分別為21.31%和21.94%，半數(shù)死亡時間提高率分別為20.8%和22.48%。此外，添加低劑量的孢子粉和子實體粉還能顯著增加雌果蠅最高壽命（P＜ 0.05），分別提高4.69%和8.33%。低劑量的混合粉也能極顯著增加雌果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜ 0.01），提高率為14.39%和15.09%，不及純子實體粉和孢子粉。以劑量組內(nèi)比較結(jié)果來看，各蟬花產(chǎn)品對雌果蠅延壽作用并不隨濃度的提高而增強(qiáng)，甚至在最高壽命方面有降低。

對比表2空白對照組和劑量組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于雄果蠅來說，除中、高劑量的孢子粉組外，其余各組均能不同程度地顯著增加雄果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.05），且對平均壽命來說，各低劑量組的提升效果更好，分別提高19.92%，27.15%和19.19%；對半數(shù)死亡時間來說，孢子粉和混合粉組中低劑量組提升效果好，分別為25.41%和22.95%，子實體粉組為中劑量組提升效果最好，達(dá)30.33%。從最高壽命來看，僅有低劑量的子實體組能顯著增加雄果蠅最高壽命（P＜0.05），提高率為20.99%。此外，與雌果蠅類似，各蟬花產(chǎn)品對雄果蠅的延壽作用也并不隨濃度的提高而增強(qiáng)。

綜合雌雄果蠅結(jié)果，蟬花子實體和孢子粉對果蠅壽命有提升作用，并且0.2%劑量的子實體組的提升效果最好。

2.2 對果蠅SOD活性和MDA含量的影響

將在各組培養(yǎng)基中培養(yǎng)了25 d的果蠅制成5%組織勻漿，按照試劑盒的方法測定組織勻漿的SOD活力和MDA含量。測定結(jié)果如表3和表4所示。

表3 不同處理對果蠅SOD活力的影響

從表3中可以看出，對于雌果蠅，只有0.2%孢子粉組和子實體組相比于空白對照組體內(nèi)的SOD活力有顯著提升（P＜0.01），分別比空白對照組提高了12.92%和14.07%，而中、高劑量的孢子粉反而顯著降低了雌果蠅SOD活力。對于雄果蠅，0.2%孢子粉組和子實體組及1%子實體組比空白對照組對SOD活力有顯著提升（P＜0.05），分別為5.53%，6.99%和4.96%，而中、高劑量的孢子粉組和混合組則顯著降低了雄果蠅的SOD活力。從結(jié)果來看，果蠅SOD活力在低濃度的孢子粉和子實體粉組中提升效果最好，隨著濃度升高，果蠅SOD活力呈下降趨勢。

從表4結(jié)果來看，對于雌果蠅，僅0.2%子實體組能顯著降低MDA含量（P＜0.05），降低了30.08%，其余低劑量組能降低，但效果不顯著，并且5%孢子粉組還極顯著地增加了MDA含量（P＜0.01）；對于雄果蠅，0.2%孢子粉組、子實體組和混合組及1%子實體組均能極顯著降低果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.01），分別降低了42.34%，49.55%，36.94%和45.05%。其余各組效果均不顯著。

表4 不同處理對果蠅MDA含量的影響

綜合雌雄果蠅的SOD、MDA結(jié)果可知，蟬花孢子粉和子實體能提高果蠅體內(nèi)SOD活性、降低MDA含量，且0.2%子實體組的效果最優(yōu)。

3 結(jié)論

果蠅是雙翅目果蠅屬昆蟲，因其世代周期短、繁殖速度快、壽命較短，且許多代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段與哺乳動物相似等優(yōu)勢而作為模式動物常被用于抗衰老研究[8]。超氧陰離子自由基（O2-）是生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種可攻擊生物大分子的自由基，其能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，引起機(jī)體衰老或病變。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧陰離子自由基（O2-），防止其損傷細(xì)胞[9]。氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸時，會發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，形成丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過氧化物[10]。因此SOD活力與MDA含量的測定結(jié)果能反映機(jī)體清除氧自由基的能力和細(xì)胞受氧自由基攻擊的損傷情況[11]。在我國《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》中將果蠅生存試驗、過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶這三項指標(biāo)的結(jié)果是否呈陽性作為判定保健食品是否具有延緩衰老功能的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

試驗探究了蟬花不同產(chǎn)品不同添加量對果蠅壽命的影響，并以超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量為指標(biāo)探究了其抗氧化活性。

在對果蠅壽命影響方面，0.2%添加量的孢子粉、子實體粉及混合粉和1%添加量的子實體粉均能顯著提高雌雄果蠅的平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.05），0.2%子實體粉組能顯著提高雌雄果蠅的最高壽命（P＜ 0.05）。其中，0.2%的子實體粉組綜合效果最好，使雌雄果蠅平均壽命分別延長了21.94%和27.15%，使雌雄果蠅半數(shù)死亡時間提高了22.48%和25.41%，最高壽命提高了8.33%和20.99%。綜合來看，孢子粉、子實體粉對果蠅壽命的延長不隨劑量的增加而增加，只有在適當(dāng)?shù)臐舛认虏疟憩F(xiàn)出顯著的正向作用。上述結(jié)果表明，蟬花具有延長果蠅壽命的作用，且雌雄果蠅延壽效果顯著時所需劑量偏低。

在抗氧化作用方面，0.2%添加量的孢子粉和子實體粉能顯著提高雌雄果蠅體內(nèi)SOD活力（P＜0.05），0.2%的子實體粉能顯著降低雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.05）。0.2%的孢子粉能顯著降低雄果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.05），對雌果蠅來說，雖能降低27.64%的MDA含量，但不夠顯著。綜合來看，孢子粉、子實體粉對果蠅抗氧化作用的影響不隨劑量的增加而增加，與壽命試驗的結(jié)果一致。該結(jié)果表明，低劑量的蟬花子實體和孢子粉對雌雄果蠅均表現(xiàn)出抗氧化作用。

除蟬花之外，目前市面上還有如冬蟲夏草、蛹蟲草、廣東蟲草等蟲草類產(chǎn)品被廣泛使用。這些不同的蟲草對果蠅壽命的影響均存在一定的研究報道，如：劉玉香[12]的研究發(fā)現(xiàn)，0.02，0.06和0.2 mg/mL的冬蟲夏草口服液能分別提高雄果蠅平均壽命25%，31%和32%；閆文娟等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，1%劑量的廣東蟲草子實體粉能延長果蠅壽命，雌雄分別延長10.97%和9.78%；王菊鳳等[14]的研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.15%的蛹蟲草多糖可以使雌雄果蠅的平均壽命延長率分別達(dá)34.3%和11.24%，使雌雄果蠅的半數(shù)死亡時間延長率分別為61.76%和23%，且蛹蟲草多糖對果蠅的延壽作用并不隨多糖濃度的提高而增強(qiáng)；張明等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草分級多糖P60能顯著延長雌雄果蠅的最高平均壽命，分別為12.54%和14.02%，并能顯著提高雌雄果蠅SOD活力6.95%和9.14%，降低MDA含量10.53%和27.07%；于士軍等[16]發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束粗多糖有延壽和抗氧化作用，雌雄果蠅壽命延長率分別是18.78%和26.23%；邵穎等[17]發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束分級多糖P60能顯著提高雌雄果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時間、最高壽命和SOD活力（P＜0.05）；趙節(jié)昌等[18]研究發(fā)現(xiàn)1.0 mg/mL的蟬花孢子粉多糖可以顯著提高雌雄果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡時間和最高壽命（P＜0.05）；中、高劑量組蟬花孢梗束粗多糖均顯著提高雌雄性果蠅的半數(shù)死亡時間和最高壽命（P＜0.05），且蟬花孢子粉和孢梗束粗多糖均具有提高果蠅體內(nèi)SOD活力和降低MDA含量的效果。從上述研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)各種蟲草均具有延壽和抗氧化的作用，有效成分可能為蟲草多糖，有待進(jìn)一步研究其中的有效成分及其作用機(jī)制。