范俊臣，張之為

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物，是我國第四大糧食作物，2020年全國29個省(直轄市、自治區(qū))馬鈴薯種植面積為559.6萬公頃，總產(chǎn)量12 294.4萬噸[1]，在保障國家糧食安全和農(nóng)民增收中具有不可代替的作用[2]。

馬鈴薯對鹽中度敏感，鹽害會抑制植株生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡[3]，大大降低馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，研究馬鈴薯對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)理具有重要意義。

研究表明，鹽脅迫下，植物葉片出現(xiàn)褐色或棕色斑點甚至萎蔫卷曲，葉片色素被破壞，同時氣孔收縮，限制了二氧化碳進(jìn)入，影響光合作用，且長期脅迫下造成根系壞死，導(dǎo)致植物死亡[4-6]；鹽脅迫下，過量Na+、Cl-等離子對細(xì)胞產(chǎn)生離子毒害作用，影響植株對其他離子的吸收，而且形成的滲透壓脅迫會引起細(xì)胞水勢變化，導(dǎo)致植物失水[7，8]；此外，鹽脅迫會造成植物體內(nèi)大量活性氧積累，打破自由基產(chǎn)生與清除這一動態(tài)平衡，導(dǎo)致膜脂過氧化，丙二醛(MDA)大量增加，造成膜系統(tǒng)損傷甚至瓦解，對植物體造成嚴(yán)重傷害[9-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線，在清除活性氧過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)也是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可與SOD共同作用清除鹽脅迫下產(chǎn)生的活性氧和自由基，從而降低過氧化傷害[10]。因此，MDA含量及SOD、POD、CAT活性常被用作衡量植物耐鹽性的生理指標(biāo)。

小G蛋白(small GTPases)是一類單體GTP結(jié)合蛋白，分子量為20～30 kD，依據(jù)功能可分為5個家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran家族[12]。Rab蛋白是小G蛋白家族最大的亞家族，在膜轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用[13]，并可與效應(yīng)子相互作用，在細(xì)胞生長發(fā)育、極性運輸、逆境脅迫反應(yīng)等中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[14]。Tripathy等[15]發(fā)現(xiàn)在水稻中超表達(dá)PgRab7基因，可使植株SOD、APX和CAT活性提高，從而表現(xiàn)出耐鹽和耐旱的特征；El-Esawi等[16]研究表明，轉(zhuǎn)OsRab7基因水稻植株的相對含水量、葉綠素含量、氣體交換特性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和抗氧化酶(CAT、SOD、POD、APX)活性顯著高于野生型，表現(xiàn)出耐鹽、耐旱和耐高溫的特性，同時產(chǎn)量增加。

本研究以超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯為材料，經(jīng)過NaCl脅迫處理后分析植株含水量、抗氧化酶活性及MDA含量的變化，以明確StRab5b基因在馬鈴薯響應(yīng)鹽脅迫中的調(diào)控作用，為馬鈴薯耐鹽性研究提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年6—8月在呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理實驗室進(jìn)行。供試材料為超表達(dá)StRab5b基因的馬鈴薯株系L7、L8、L10，品種為夏坡蒂，已經(jīng)過qPCR鑒定[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫處理 選取在MS固體培養(yǎng)基中生長4周的馬鈴薯組培苗，取出洗凈根系，在清水中緩苗3 d，然后置于裝有30 mL 150 mmol/L NaCl的組培瓶中，每瓶6株，重復(fù)3次，以轉(zhuǎn)空載體馬鈴薯為對照(CK)，置于光照16 h、黑暗8 h、溫度22℃、濕度80%條件下培養(yǎng)，在處理0、24、48 h采集植株樣品測定相應(yīng)理化指標(biāo)。

1.2.2 植株含水量的測定 吸干采集樣品表面水分，稱鮮重，然后置于80℃烘干至恒重，稱干重。按公式[18]計算含水量:植株含水量(%)＝(植株鮮重-植株干重)/植株鮮重×100。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測定 SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[19]，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[19]，CAT活性測定采用紫外分光光度法[19]。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8軟件作圖，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間鹽脅迫對超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯幼苗含水量的影響

經(jīng)過150 mmol/L NaCl處理后，觀察不同時間內(nèi)植株的生長，結(jié)果(圖1)顯示，未經(jīng)脅迫時，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L8、L10與CK均為正常生長形態(tài)，葉片舒展未發(fā)生皺縮；脅迫處理24 h，L7、L8、L10的葉片開始輕微皺縮，而CK的葉片未發(fā)現(xiàn)明顯皺縮；脅迫處理48 h，L7、L8、L10和CK的葉片均開始皺縮，L7、L8、L10的葉片皺縮程度明顯高于CK。

圖1 超表達(dá)SbRab5b基因馬鈴薯在鹽脅迫處理后的植株表型

從圖2可知，隨著NaCl處理時間的延長，轉(zhuǎn)StRab5b基因馬鈴薯與CK植株含水量均呈降低趨勢。在處理0 h，CK與轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系L7、L8、L10的含水量沒有顯著差異；處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的含水量分別顯著下降12.5%、17.6%、24.6%；處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的含水量分別顯著下降31.7%、36.2%、42.8%。說明鹽脅迫條件下，超表達(dá)StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的植株含水量。

圖2 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的含水量變化

2.2 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的抗氧化酶活性變化

2.2.1 SOD活性的變化 如圖3所示，經(jīng)過150mmol/L NaCl處理后，隨著鹽脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L8的SOD活性先降后升，CK、L7的SOD活性呈遞增趨勢，而L10的活性先升后降。鹽脅迫處理0 h，CK與轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L8、L10的SOD活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分別顯著下降66.7%、81.1%、29.5%；在處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分別顯著下降54.4%、48.8%、80.3%?？傮w來說，在鹽脅迫下，超表達(dá)StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的SOD活性。

圖3 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的SOD活性變化

2.2.2 POD活性 如圖4所示，在150 mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫時間的延長，CK的POD活性呈遞增趨勢，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L10的活性呈先降后升趨勢，而L8的活性先升后降。在處理0 h，CK與轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L8、L10的POD活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的POD活性分別顯著下降50.6%、16.6%、37.8%；在處理48 h，與CK相比，L8的POD活性顯著下降29.1%，而L7的POD活性顯著增加54.2%，L10的POD活性上升13.0%，但與CK差異不顯著。可見，在鹽脅迫初期，超表達(dá)StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的POD活性，但在脅迫后期，不同轉(zhuǎn)基因株系的反應(yīng)不同，L8的POD活性降低，而L7和L10的POD活性升高。

圖4 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的POD活性變化

2.2.3 CAT活性的變化 如圖5所示，在150mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫時間的延長，CK與L10的CAT活性呈遞增趨勢，而L7、L8的CAT活性均呈先升后降的趨勢。在處理0 h，CK與轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L8、L10的CAT活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8的CAT活性分別上升45.2%、25.8%，差異顯著，L10的CAT活性略有降低，差異不顯著；在處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的CAT活性顯著降低62.9%、75.7%、32.8%?？?見，鹽 脅 迫 初 期，超 表 達(dá)StRab5b基因的馬鈴薯CAT活性升高，但在脅迫后期大幅降低。

圖5 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的CAT活性變化

2.3 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量變化

由圖6可知，在150 mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫處理時間的延長，CK和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯L7、L8、L10的MDA含量均呈現(xiàn)遞增趨勢。在處理0 h，四者的MDA含量沒有顯著差異；在處理24、48 h，與CK相比，L7、L8、L10的MDA含量均顯著增加，分別增加了193%、80%、265%和218%、179%、295%?？梢?，在鹽脅迫下，超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量大幅增加，脅迫時間越長MDA含量越高。

圖6 鹽脅迫下超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量變化

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯屬于鹽中度敏感作物，鹽脅迫對其生長的影響主要表現(xiàn)在使長勢變?nèi)?、葉片萎蔫發(fā)黃[21]。已有研究[22]表明，在鹽脅迫下，過表達(dá)抗逆基因StSnRK2.1、StSnRK2.7可明顯提高馬鈴薯的抗逆性，其株高、鮮重及相對含水量的降幅顯著低于對照。而在本試驗中，隨著鹽脅迫時間的延長，超表達(dá)StRab5b基因的馬鈴薯L7、L8、L10均出現(xiàn)較為嚴(yán)重的萎蔫，植株含水量顯著降低，對鹽脅迫的抵抗力明顯降低。

鹽脅迫對植物生理生化反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在滲透調(diào)節(jié)、光合作用、氧化活性等方面[23]。鹽脅迫會導(dǎo)致植物產(chǎn)生大量活性氧，若不能及時清除，就會引發(fā)脂質(zhì)過氧化和蛋白交聯(lián)，進(jìn)而損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化毒害作用。SOD、POD和CAT能有效清除活性氧，降低活性氧對細(xì)胞的傷害[10]。本試驗中，在NaCl脅迫處理48 h后，對照植株的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均明顯提高，清除活性氧的能力強(qiáng)；但超表達(dá)StRab5b基因的馬鈴薯株系中SOD和CAT活性顯著低于對照植株，而POD活性3個株系間表現(xiàn)不同，L7、L10升高，L8下降。綜合推測StRab5b基因在馬鈴薯植株清除活性氧上表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控，超表達(dá)該基因抑制了抗氧化酶的活性，使植物體清除活性氧的能力減弱。

作為膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，MDA積累量與植物受逆境傷害程度呈正比關(guān)系，植物受傷害程度越小，MDA積累量越小，反之則越大[24]。張景云等[25]在鹽脅迫二倍體馬鈴薯葉片中發(fā)現(xiàn)MDA含量隨鹽脅迫時間的延長呈逐漸升高趨勢。本試驗結(jié)果也表明，馬鈴薯植株體內(nèi)的MDA含量隨著NaCl脅迫時間的延長而增加，且超表達(dá)StRab5b基因的植株體內(nèi)MDA積累量更高。

綜上所述，在150 mmol/L NaCl脅迫下，超表達(dá)StRab5b基因馬鈴薯的抗氧化能力受到明顯抑制，遭受鹽脅迫傷害更嚴(yán)重，推測StRab5b基因負(fù)向調(diào)控馬鈴薯對于鹽脅迫的抗性。