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        山東地方雞種NR3C2基因多態(tài)性檢測及其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

        2022-10-21 08:18:36周艷雷秋霞韓海霞李福偉劉杰劉瑋王杰湯存?zhèn)ダ畲簌i曹頂國
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年9期
        關(guān)鍵詞:黑雞雞種產(chǎn)蛋量

        周艷雷秋霞韓海霞李福偉劉杰劉瑋王杰湯存?zhèn)ダ畲簌i曹頂國

        (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,山東 濟南 250100;2.山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心,山東 濟南 250100;3.山東益嘉種禽有限公司,山東 臨沂 276000)

        鹽皮質(zhì)激素受體(MR,NR3C2)是核受體超家族的一員,該超家族是一類配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,在多細胞生物中是含量最豐富的幾大類轉(zhuǎn)錄因子超家族之一[1]。核受體的一般途徑為配體與相應(yīng)核受體結(jié)合誘導(dǎo)受體的二聚化并增強其與特定DNA序列的結(jié)合[2],從而激活或抑制下游基因的表達。NR3C2基因的表達范圍很廣,在腎臟極化的緊密上皮、人類和鼠的大腸、氣道、汗腺、唾液腺、肝臟、內(nèi)皮的上皮組織[3]、脂肪組織[4]及單核細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞、番鴨的肝、腎、腦、腿、膽和胸[5]中均有表達。NR3C2分布的廣泛性揭示了其功能的多樣性,目前研究最多的是與人類疫病相關(guān)的功能,比如腎細胞癌[6]、胰腺癌[7]、肝癌[8]等腫瘤發(fā)生、高血壓[9]、1型假性醛固酮減少癥[10]、高原肺水腫[11]、慢性中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變[12]等。此外NR3C2還被發(fā)現(xiàn)與人的行為異常[13]及精神分裂[14,15]等有關(guān),近來也有研究表明NR3C2參與脂類代謝,在脂肪性肥胖[16]中發(fā)揮作用。在動物中的研究表明,NR3C2的表達水平在番鴨不同行為狀態(tài)下存在差異[5];其單核苷酸變異與豬的肥胖相關(guān)[17];對內(nèi)洛爾牛進行研究表明,其單倍型與肉色、烹飪損失、肌肉糖原含量和血漿促腎上腺皮質(zhì)激素濃度等肉質(zhì)性狀相關(guān)[18];在雞上目前未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)研究報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NR3C2基因在雞卵巢顆粒細胞中高表達(未發(fā)表),因此猜測該基因在雞繁殖性能中可能發(fā)揮重要作用。

        雞NR3C2基因位于4號染色體,共有8個外顯子組成,編碼981個氨基酸。本研究以山東地方雞種和高產(chǎn)蛋雞為素材,采用直接測序和PCRRFLP技術(shù)對該基因進行SNP掃描,分析多態(tài)位點與雞繁殖性狀的相關(guān)性,以期挖掘該基因與山東地方雞繁殖性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記,為地方雞種遺傳改良和創(chuàng)新利用奠定科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物

        濟寧百日雞396只、汶上蘆花雞522只、萊蕪黑雞392只、海蘭褐蛋雞206只,均來自山東省地方雞品種資源活體基因庫。所有試驗群體均為同批入孵,飼養(yǎng)條件一致,隨機采樣,翅靜脈采血,ACD抗凝,-20℃保存。采用常規(guī)酚/氯仿法提取雞血液DNA。萊蕪黑雞單籠飼養(yǎng),專人負責(zé)個體產(chǎn)蛋記錄。

        1.2 突變位點及引物信息

        根據(jù)雞NR3C2基因(GenBank登錄號NC_052535)的DNA序列,設(shè)計1對引物,引物序列為F:5′-AGACAGACAGGGATAG-3′,R:5′-GAGGACACTGAGTTAA-3′,擴增目的片段長度771 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.3 PCR擴增與PCR-RFLP分析

        PCR反應(yīng)體系(15 μL):2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL,ddH2O 5.6 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各0.45 μL,基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR擴增程序:94℃3 min;94℃30 s,48.1℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃4 min。

        PCR-RFLP反應(yīng)體系(15 μL):TaqⅠ(10U/μL)0.5 μL,10×BufferTaqⅠ1 μL,PCR產(chǎn)物8 μL,ddH2O 5.5 μL,65℃水浴過夜。

        酶切產(chǎn)物檢測:120 V、1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min,分析酶切產(chǎn)物基因型。

        1.4 序列分析

        每個基因型取兩個不同個體的PCR產(chǎn)物于濟南力戈科技有限公司進行克隆測序。

        1.5 關(guān)聯(lián)分析

        采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件包的GLM程序進行基因型與性狀(產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日齡)的關(guān)聯(lián)分析。統(tǒng)計分析模型為yi=μ+Gi+ei,其中yi代表性狀表型值,μ為性狀群體均值,Gi代表基因型效應(yīng)值,ei為隨機殘差。

        不同基因型間的比較分析用最小二乘法,試驗數(shù)據(jù)用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(LSM±SE)表示,顯著水平設(shè)定P<0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 基因型判定

        由圖1可知,NR3C2基因3 714多態(tài)位點經(jīng)TaqⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后在山東省3個地方雞種和引進高產(chǎn)品種中均表現(xiàn)出3種基因型:GG(417、51、303 bp),AA(468、303 bp)和GA(468、417、303、51 bp)。

        圖1 雞NR3C2基因3 714多態(tài)位點酶切結(jié)果

        2.2 序列分析

        測序結(jié)果表明(圖2),雞NR3C2基因3 714位點是一個G→A的突變,該突變位點位于外顯子1內(nèi),包含TaqⅠ限制性內(nèi)切酶的識別序列“T/CGA”,其中“G”不發(fā)生突變即“T/CGA”類型記做“GG”;“G”突變?yōu)椤癆”,即“T/CAA”類型記做“AA”;GA為雜合型。

        圖2 雞NR3C2基因3 714多態(tài)位點的序列分析(反向測序)

        2.3 NR3C2基因3 714多態(tài)位點等位基因和基因型頻率分布

        3 714位點在濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞3個地方雞種中的優(yōu)勢基因型均為雜合型GA,頻率約為50.00%,等位基因A和G的頻率也接近平均分布。在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中的優(yōu)勢基因型為純合型GG,頻率為88.84%,優(yōu)勢等位基因G頻率為93.93%(表1)。

        表1 NR3C2基因3 714多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率

        2.4 NR3C2基因3 714多態(tài)位點與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)分析

        在392只萊蕪黑雞群體中,對NR3C2基因3 714位點與4個繁殖性狀進行關(guān)聯(lián)分析和多重比較,結(jié)果見表2。

        表2 NR3C2基因3 714多態(tài)位點各基因型與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

        3 714位點與43W產(chǎn)蛋量(P=0.0467)、44W產(chǎn)蛋量(P=0.0486)和45W產(chǎn)蛋量(P=0.0499)均顯著相關(guān)。基因型GG個體的最大產(chǎn)蛋量與基因型GA個體間差異顯著(P<0.05),而且該基因型在開產(chǎn)日齡性狀上也表現(xiàn)出優(yōu)勢,GG基因型個體的開產(chǎn)日齡最早,比GA基因型個體平均早1.17 d。

        3 討論與結(jié)論

        鹽皮質(zhì)激素受體基因功能非常廣泛[3],不僅維持水鈉平衡,還與心血管重構(gòu)、行為認知、脂肪代謝、腦缺血再灌注腦損傷[19]、認知障礙[20]、產(chǎn)后抑郁癥[21]等病理生理反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)雞NR3C2基因3 714位點GG基因型在低繁殖力的3個山東省地方雞種中表現(xiàn)為劣勢基因型,而在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型,頻率高達88.84%,等位基因G頻率高達93.93%。濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞均為山東省地方雞種,與國外高產(chǎn)蛋雞品種相比,繁殖力較低,這也是制約地方雞種創(chuàng)新利用的瓶頸因素,而海蘭褐蛋雞是經(jīng)過長期選擇形成的商業(yè)化品系,近年來,基因組育種在其品系育成過程中更是發(fā)揮了重要作用,有益基因經(jīng)過選育在群體內(nèi)大量聚合,因此,結(jié)合品種特點初步推測GG基因型可能與高產(chǎn)蛋性狀有關(guān)。

        關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也表明該位點與萊蕪黑雞多個時期的產(chǎn)蛋量存在顯著相關(guān),GG基因型個體在開產(chǎn)日齡、43W產(chǎn)蛋量、44W產(chǎn)蛋量和45W產(chǎn)蛋量性狀中均表現(xiàn)最優(yōu),且在其中3個性狀上與GA基因型個體間差異顯著,可以推斷GG型與高繁殖性能相關(guān),可以用于地方雞種的育種。在地方雞種選育過程中,可選擇GG型個體留種,不但可以將開產(chǎn)日齡提前,還能提高總產(chǎn)蛋量,極大提升地方雞種的繁殖性能,促進地方雞種的創(chuàng)新利用,提高經(jīng)濟效益。

        本研究采用PCR-RFLP方法在汶上蘆花雞、濟寧百日雞、萊蕪黑雞和海蘭褐中檢測到NR3C2基因3 714 nt處發(fā)生點突變G→A,基因型GG在3個地方雞種中表現(xiàn)為劣勢基因型,而在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明3 714位點對43W產(chǎn)蛋量(P=0.0467)、44W產(chǎn)蛋量(P=0.0486)和45W產(chǎn)蛋量(P=0.0499)均表現(xiàn)出顯著相關(guān),且GG基因型個體的開產(chǎn)日齡也最早,比GA基因型個體平均早1.17 d。GG基因型可以作為地方雞種繁殖性狀的分子標(biāo)記。

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