王競晗

（山東省臨沂市沂南縣動物疫病預(yù)防控制中心，山東 臨沂 276300）

0 引言

圍產(chǎn)期的奶牛因為乳汁分泌和胎兒的發(fā)育，全身需要大量能量，但該時期的奶牛飲食減退，能量匱乏。為了補充能量，奶牛的脂肪開始消耗，這使得游離脂肪酸（NEFA）在體內(nèi)產(chǎn)生，并在一定程度上與血液混合，發(fā)生高NEFA血癥。肝內(nèi)的NEFA是酮體的主要來源，主要成分β羥丁酸占78%，乙酰乙酸占20%，丙酮占2%。β羥丁酸是酮體的主要成分，可以對圍產(chǎn)期奶牛的健康狀況做及時的監(jiān)測，避免出現(xiàn)能量負(fù)平衡、脂肪異常動員而出現(xiàn)的臨床酮病或亞臨床酮病。先前的研究已經(jīng)廣泛證明了血漿中的游離脂肪酸（NEFA）和β羥丁酸（BHBA）與臨床酮癥和移位性腹股溝等產(chǎn)后疾病的發(fā)病率之間存在密切的關(guān)聯(lián)。因此研究高NEFA血癥與高BHBA狀態(tài)對肝臟細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng)和致死效果，分析NEFA和BHBA使肝臟細(xì)胞死亡的信號通路的機理，對臨床酮癥的發(fā)病原因和治療方案有借鑒意義。

臨床酮癥發(fā)病時，奶牛的發(fā)情時間推后，胚胎成型時間變長，胚胎成活率明顯下降，嚴(yán)重影響奶牛的繁殖效果。而β羥丁酸是引發(fā)奶牛酮病的主要致病成分之一，約占NEFA的78%，β羥丁酸在血漿中過多會導(dǎo)致奶牛身體細(xì)胞氧化凋亡，如果發(fā)生大量損害，則影響奶牛的身體正常運轉(zhuǎn)。這種生理適應(yīng)性的挑戰(zhàn)在現(xiàn)代高價值繁殖奶牛中加劇，并且由于營養(yǎng)和環(huán)境條件的差異而變得復(fù)雜。

所用的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞（BEND）在體外培育，分組加入BHBA和PC，研究牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞受BHBA的氧化作用，分析原花青素保護其免受氧化的作用機理，對臨床酮病影響奶牛生產(chǎn)的內(nèi)在原因提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方案

1.1 材料

試驗試劑采用市面隨機采購方式，遵循數(shù)理統(tǒng)計隨機性[1-2]，試劑見表1。

表1 試驗試劑

1.2 試驗方案

選取β羥丁酸的濃度分別為A1：0.6 mmol/L、A2：1.2 mmol/L、A3：2.4 mmol/L，選取原花青素濃度為10 umol/L，作用時間為24 h。試驗環(huán)境統(tǒng)一采用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液配置的完全培養(yǎng)基，試驗方案中不再詳述[3]。將試驗分為8組，各組做3復(fù)孔，見表2。

表2 試驗方案

將細(xì)胞瓶內(nèi)的細(xì)胞傳代至6孔板中，待貼壁穩(wěn)定生長后（約7 h）向6孔板中加入不同濃度的藥物，即8組，3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取上清用于氧化指標(biāo)的CAT試劑盒測定與GSH-PX試劑盒測定。

2 試驗方法

2.1 CAT試劑盒測量

試劑1，100 mL液體；試劑2，10 mL底物液體；試劑3，10 mL液體。試劑統(tǒng)1在4 ℃放置6個月。

BEND細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)并稀釋，1 d后離心得到上清液。首先，做預(yù)實驗，測量樣品的稀釋程度。在正式試驗中，從8組中取出16個10 mL離心管，分為對照管與測量管。將1.0 mL試劑1和0.1 mL試劑2加入對照管中，然后放入37 ℃的水浴鍋中充分浸泡1min，最后分別加入1.0 mL試劑3、試劑4和上清液；將對應(yīng)管得到的0.1 mL液體加入到測量管中，并加入1.0 mL試劑1，0.1 mL試劑2，放入37 ℃的水浴鍋中充分浸泡1 min，再添加1.0 mL的試劑3。充分搖動均勻?qū)φ展芎蜏y量管，轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)平板上，每孔200 μL，每組重復(fù)3次。將試管放置到酶標(biāo)儀中，將其波長調(diào)整為405 nm，并在96孔板中觀察OD值。細(xì)胞上清中CAT活性的計算[4]：

2.2 GSH-PX試劑盒的測定方法

試劑，2 mL儲備液。試劑2，包括甲粉，放入雙蒸水溶解，乙液50 mL，使用時將甲、乙兩溶液摻混使其產(chǎn)生晶體，后加熱溶解。試劑3，粉劑1瓶。試劑4，粉劑1支。試劑5，粉劑4支。試劑6，GSH標(biāo)準(zhǔn)品，12.28 mg。試劑統(tǒng)一在4 ℃放置6個月。

BEND細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)并稀釋，1 d后離心得到上清液。首先，做預(yù)實驗，測量樣品的稀釋程度。取8支非酶管，向各管加入0.2 mL 1 mmol/L GSH，在37 ℃條件下保持5 min，加入0.1 mL試劑1，在37 ℃條件下保持5 min，最后加入3 mL試劑2和0.2 mL上清液。取8個酶管，向各管加入0.3 mL 1 mmol/L GSH和0.2 mL上清液，在37 ℃條件下保持5 min，加入0.3 mL試劑1，在37 ℃條件下保持5 min，最后加入3 mL試劑2，取上清液顯色。各取8個對照管和標(biāo)準(zhǔn)管。向?qū)φ展芗尤? mL試劑3、0.5 mL試劑4、2 mL GSH溶液，0.05 mL試劑5。向標(biāo)準(zhǔn)管加入1 mL 20 μmol/L GSH溶液、2 mL試劑3、0.5 mL試劑4。將1 mL上清液分別轉(zhuǎn)移至酶管和非酶管中，并加入2 mL試劑3、0.5 mL試劑4。充分搖動均勻后，轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)平板上，每孔200 μL，每組3～5個復(fù)孔。將試管放置到酶標(biāo)儀中，將其波長調(diào)整為412 nm，并在96孔板中觀察OD值。細(xì)胞上清中GSH-PX活性的計算[4]：

3 結(jié)果與分析

3.1 BHBA與PC聯(lián)合培養(yǎng)對BEND細(xì)胞CAT活性的測定結(jié)果

與空白組相比，單獨加BHBA組的BEND細(xì)胞隨BHBA濃度的升高CAT活性整體呈下降趨勢，其中BHBA濃度為0.6 mmol/L時BEND細(xì)胞的CAT活性顯著下降（P＜0.05），BHBA濃度為1.2 mmol/L和2.4 mmol/L時BEND細(xì)胞的CAT活性極顯著下降（P＜0.01），PC組和BHBA+PC組的CAT活性均上升。見圖1。

圖1 BEND細(xì)胞CAT活性

3.2 BHBA與PC聯(lián)合培養(yǎng)對BEND細(xì)胞GSH-PX活性的測定結(jié)果

與空白組相比，單獨加BHBA組BEND細(xì)胞隨BHBA濃度的升高GSH-PX含量整體呈下降趨勢；單獨加PC組BEND細(xì)胞的GSH-PX含量則呈現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。BHBA+PC組和其與之對應(yīng)的BHBA組相比，BEND細(xì)胞的GSH-PX活性整體呈上升趨勢，其中BHBA濃度為0.6mmol/L時加PC呈現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01），見圖2。

圖2 BEND細(xì)胞GSH-PX活性

3.3 測定結(jié)果分析

通過向牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞（BEND）中加入不同濃度的β羥丁酸（BHBA）及原花青素（PC），通過前期實驗確定添加藥物濃度及作用時間，測定CAT、GSH-PX等各項指標(biāo)。在BHBA作用下產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物和氧化基團使BEND發(fā)生一系列的氧化損傷[5]，造成細(xì)胞的活性喪失和凋亡，PC可消除氧化產(chǎn)物和氧化基團，達到“中和”效果，在關(guān)鍵時刻上避免BEND發(fā)生氧化損傷。OH自由基氧化特性極為活潑，它與多種有機物都會發(fā)生快速反應(yīng)，可以破壞糖、氨基酸、磷脂、核苷酸和有機酸等，因此在生物體內(nèi)有較廣的反應(yīng)面?？寡趸窩AT能分解OH自由基，從而直接保護生物體細(xì)胞不受氧化作用而產(chǎn)生損傷，維持生物體的正常運轉(zhuǎn)和生理機能，測定CAT含量對研究生物體細(xì)胞狀態(tài)有重要意義[6-7]。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）是生物體內(nèi)大量存在的可以分解氧化物的抗氧化酶，它特異地催化還原谷胱甘肽（GSH）的還原反應(yīng)。Se的生物功能通過至少13種硒蛋白介導(dǎo)，作為谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）的重要組成部分，它對抗氧化劑防御很重要，其補充直接影響酶的活性，測定GSH-PX活性可以作為衡量機體硒水平的一項生化指標(biāo)。

4 結(jié)論

將BHBA與PC加入牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并測定CAT、GSH-PX等氧化指標(biāo)，分析氧化指標(biāo)的變化特征，研究BHBA與PC的作用機理，得出以下結(jié)論。

（1）BHBA可使牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的活性下降，使細(xì)胞更容易氧化，發(fā)生凋亡。

（2）PC可使牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的活性上升，清除細(xì)胞內(nèi)氧化成分，保護細(xì)胞免受氧化物的損害。

（3）BHBA和PC的同時加入使牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的活性處于單獨添加BHBA和單獨添加PC之間，說明原花青素可拮抗β羥丁酸誘發(fā)的氧化損傷，對BEND細(xì)胞起到保護作用。