蘆 蘭，王 鑫，張瑞琦，趙 偉，袁 博，張一凡，馮占斌

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安市第九醫(yī)院，陜西 西安 710054)

長期過量飲酒會(huì)對(duì)心臟造成嚴(yán)重?fù)p害，酒精是最重要的損傷因子，在體內(nèi)可以分解為乙醛和脂肪酸乙酯等毒性產(chǎn)物，并通過激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變心肌細(xì)胞的功能，引起心肌代謝和組織學(xué)異常，最終導(dǎo)致心肌肥大、心臟擴(kuò)大、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、心功能下降等一系列改變，臨床上稱之為酒精性心肌病(Alcohol cardiomyopathy，ACM)[1]。ACM的病理生理學(xué)改變涉及心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞功能變化等多方面因素，是導(dǎo)致非缺血性擴(kuò)張型心肌病的主要原因，其特點(diǎn)是左心室舒張期內(nèi)徑(LVEDD)增加和左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)降低[2]。有研究發(fā)現(xiàn)：ACM患者的心肌組織中可見大量的凋亡細(xì)胞，ACM動(dòng)物細(xì)胞模型中也同樣檢測(cè)到了Bax、Cleaved caspase-3等細(xì)胞凋亡標(biāo)志物升高的現(xiàn)象，提示酒精與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3-5]，凋亡是導(dǎo)致ACM發(fā)病的主要因素之一[6]。

凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)是氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)的清道夫受體之一[7]，它的表達(dá)受多種促炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)和機(jī)械刺激等因素調(diào)控[8]，與心肌缺血損傷后的炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)有關(guān)。LOX-1已被證實(shí)在心血管疾病中起重要作用，如動(dòng)脈粥樣硬化等。研究表明，心肌缺血后LOX-1的表達(dá)量增多，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡、局部炎癥和成纖維細(xì)胞的活化，最終導(dǎo)致心肌功能的喪失[9]。LOX-1在ACM中的表達(dá)如何以及是否誘發(fā)細(xì)胞凋亡目前國內(nèi)外報(bào)道較少。本研究計(jì)劃建立ACM大鼠模型，并通過外源性shRNA干預(yù)，觀察LOX-1和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)量變化，旨在探討LOX-1與酒精誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為ACM的防治提供新的研究思路和方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 該研究得到了西安市第九醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵守了美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)的指導(dǎo)方針。選取2周齡的健康雄性SD大鼠(麟美生物，中國)9只，體重200～250 g，隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組(n=3)、ACM組(n=3)和ACM+shLOX-1組(n=3)。所有大鼠均置于45 ℃和50%濕度的環(huán)境中，正常飲食，在12 h光/暗循環(huán)下自由活動(dòng)。正常對(duì)照組：正常飼養(yǎng)16周不做干預(yù)處理；ACM組：第1周，50%的乙醇[6 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取5%的乙醇(用來替代水)；第2周，50%的乙醇[8 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取10%的乙醇(用來替代水)；第3周，50%的乙醇[10 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取20%的乙醇(用來替代水)；第4～16周，50%的乙醇[12 ml/(kg·d)]，每天灌胃2次，且自由獲取20%的乙醇(用來替代水)，誘發(fā)ACM，建立ACM大鼠模型(心臟彩超示模型組較正常組心腔擴(kuò)大、心肌變薄視為ACM模型成功)；ACM+shRNA組：相同方法誘發(fā)ACM，并在體內(nèi)尾靜脈注射預(yù)先設(shè)計(jì)的腺病毒相關(guān)的shRNA進(jìn)行LOX-1沉默抑制LOX-1的表達(dá)。16周后，將各組大鼠處死，取出心臟標(biāo)本，測(cè)定分析相關(guān)指標(biāo)。

1.2 qRT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen,美國)從大鼠心肌組織勻漿液中分離總RNA。提取總RAN后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；NanoQuant酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)檢測(cè)RNA純度，RNA純度=OD260/OD280，該比值應(yīng)在1.8～2.0之間。按照SuperScript Ⅲ RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)說明制備20 μl反應(yīng)體系，使用StepOne Software熒光定量PCR儀(Applied biosystems，美國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min；85 ℃ 10 min。使用Step One Software熒光定量PCR儀(Applied biosystems，美國)按照superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)制備反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)。各因子引物如表1，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 Western blot 收集樣品，用PBS在冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞(3×10 s)，使其在4 ℃下12000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃測(cè)量蛋白濃度。離心物的等分物在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF膜(默克，美國)。隨后使用抗LOX-1(1∶1000,ab60178)、Bax(1∶1000，ab32503)、Cleaved caspase-3(1∶1000,ab184787)的一抗，在4 ℃下處理12 h。用TBST(索萊寶，中國)沖洗后，加入二次HRP偶聯(lián)的抗體，孵育1 h。接下來，在TBST洗滌后，使用 DAB試劑盒(索萊寶，中國)觀察條帶。通過 ImageJ1.53f(NIH，美國)獲得蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Graphpad Prism 8.3.0(Graphpad LLC，美國)進(jìn)行分析和繪圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組LOX-1及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3 mRNA表達(dá)量分析 通過qRT-PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況顯示：ACM組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯高于Blank組[(1.51±0.02)與(0.97±0.03)、(2.21±0.08)與(1.05±0.04)、(2.10±0.09)與(1.07±0.09)，均P<0.0.1)]；ACM+shRNA組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)量明顯低于ACM組[(0.64±0.01)與(1.51±0.02)、(1.63±0.02)與(2.21±0.08)、(1.58±0.01)與(2.10±0.09)，P<0.01]，見圖1。

A：Bax mRNA表達(dá)量對(duì)比；B：Cleaved caspase-3 mRNA表達(dá)量對(duì)比；C：LOX-1 mRNA表達(dá)量對(duì)比。Blank組：空白對(duì)照組；ACM組：酒精性心肌病組；ACM+shRNA組：shRNA抑制LOX-1表達(dá)的酒精性心肌病組。*P<0.01

2.2 LOX-1及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量分析 通過Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況顯示：ACM組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于Blank組[(0.99±0.02)與(0.89±0.02)、(0.61±0.01)與(0.30±0.01)、(0.61±0.01)與(0.20±0.01)，均P<0.01]；ACM+shRNA組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯低于ACM組[(0.57±0.14)與(0.99±0.02)、(0.45±0.03)與(0.61±0.01)、(0.42±0.01)與(0.61±0.01)，均P<0.01]，上述指標(biāo)提示蛋白檢測(cè)結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果具有相同的趨勢(shì)，見圖2。

A：各組大鼠Western blot蛋白印跡圖；B：各組大鼠LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3 的蛋白表達(dá)量對(duì)比。Blank組：空白對(duì)照組；ACM組：酒精性心肌病組；ACM+shRNA組：shRNA抑制LOX-1表達(dá)的酒精性心肌病組。*P<0.01

2.3 LOX-1與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3相關(guān)性分析 使用Pearson檢驗(yàn)對(duì)LOX-1與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在ACM大鼠模型中 LOX-1與心肌凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3呈正相關(guān)(r=0.323,P=0.080；r=0.370,P=0.082),見圖3。

注：P>0.05表示相關(guān)性太弱。相關(guān)系數(shù)r在0.8～1.0之間是極強(qiáng)相關(guān)；0.6～0.8之間是強(qiáng)相關(guān)；0.4～0.6 之間是中等程度相關(guān)；0.2～0.4之間是弱相關(guān)；0.0～0.2則是極弱相關(guān)或無相關(guān)

3 討 論

ACM是以酒精劑量依賴性的方式逐步進(jìn)展的，過量飲酒是導(dǎo)致左心功能障礙的主要原因之一，酒精的毒性作用可導(dǎo)致心力衰竭、心臟傳導(dǎo)阻滯、心房顫動(dòng)、心肌重構(gòu)、心臟代謝和功能異常[10]。目前，關(guān)于ACM的研究多集中在氧化應(yīng)激、細(xì)胞器功能障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、細(xì)胞死亡、蛋白代謝異常、神經(jīng)體液系統(tǒng)紊亂、炎癥、基因改變、營養(yǎng)失衡及自噬等方面[11]，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有研究提出酒精可抑制蛋白質(zhì)的合成，誘導(dǎo)炎癥和心肌細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)的心臟組織的丟失是導(dǎo)致酗酒者射血分?jǐn)?shù)和舒張末期升高的原因[5]。此外，這種凋亡導(dǎo)致的組織丟失也會(huì)引起心室壁變薄和心室擴(kuò)張，最終導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生[12]。酒精分解產(chǎn)生的乙醛被認(rèn)為是導(dǎo)致組織和細(xì)胞毒性的主要物質(zhì)，其毒性比乙醇更強(qiáng)，能顯著抑制心肌蛋白質(zhì)合成，損傷心肌收縮功能，破壞心肌興奮-收縮偶聯(lián)，導(dǎo)致氧化損傷和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]。因此，乙醛是導(dǎo)致酒精性心肌病最重要的物質(zhì)，大量攝入酒精可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體凋亡，并刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可能是由活性氧(ROS)信號(hào)通路介導(dǎo)的[13]。乙醛能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生增加，激活ERK1/2、SPAK/JNK和P38 MAPK，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。

1972年Kerr最先提出細(xì)胞凋亡的概念，它是細(xì)胞死亡的形式之一，是細(xì)胞的一種主動(dòng)程序性死亡，與各種基因的激活存在密切關(guān)聯(lián)[16]。細(xì)胞凋亡有時(shí)也被稱為程序性細(xì)胞死亡(或更通俗地說是“細(xì)胞自殺”)，細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)依賴于一系列半胱氨酸-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活[17]。caspase家族是在細(xì)胞凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其中Cleaved caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位[8]。Cleaved caspase-3可引起DNA損傷修復(fù)酶降解，與此同時(shí)激活核酸內(nèi)切酶，從而引起細(xì)胞凋亡[18]。另外，Ge等[19]發(fā)現(xiàn)，長期大量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致Cleaved caspase-3活性增高，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。引起細(xì)胞凋亡的另一個(gè)因素是Bcl-2蛋白家族，包括抗凋亡蛋白(如 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(如 Bax、Bad、Bak、Bid和 Bcl-xs等)，其中促凋亡蛋白Bax水平的高低與細(xì)胞凋亡調(diào)控直接相關(guān)，即Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。這些研究結(jié)果均表明Bax、Cleaved caspase-3與細(xì)胞凋亡有明顯的關(guān)系。

LOX-1是最早被鑒定為引起血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取ox-LDL的受體之一，隨后在心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、血小板中也發(fā)現(xiàn)了LOX-1的存在，提示LOX-1在體內(nèi)可能有多種功能。在正常生理情況下，LOX-1的表達(dá)較低，主要功能是參與ox-LDL的結(jié)合、內(nèi)吞和蛋白降解，但在高血壓(血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1)、糖尿病(葡萄糖)、缺氧和機(jī)械應(yīng)激(剪切應(yīng)力)等病理狀態(tài)下卻呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。此外，LOX-1的激活與許多病理生理過程有關(guān),包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期信號(hào)改變及細(xì)胞凋亡等，但LOX-1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，國內(nèi)外報(bào)道甚少。

本研究通過構(gòu)建ACM模型，并給予外源性shRNA干預(yù)從基因以及蛋白水平檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)：ACM組凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)量明顯升高，提示ACM大鼠存在心肌細(xì)胞凋亡情況；我們進(jìn)一步通過shRNA抑制LOX-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)：LOX-1在ACM+shRNA組表達(dá)降低，而在qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果中，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3也出現(xiàn)協(xié)同性降低現(xiàn)象，提示LOX-1可能通過正向調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)參與酒精誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)展過程。Pearson檢驗(yàn)結(jié)果提示：隨著自變量LOX-1的增大，相關(guān)變量Bax、Cleaved caspase-3也會(huì)隨之變化，且r值表明兩變量存在正相關(guān)關(guān)系，但該現(xiàn)象缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)，難免存在統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，在后續(xù)的研究中會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證現(xiàn)有結(jié)論。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ACM模型中LOX-1及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)明顯升高，且LOX-1與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3成正相關(guān)。推測(cè)LOX-1可能通過對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved caspase-3的正向調(diào)節(jié)參與酒精誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程。