劉 放，談 紅，晉 群，韓淑芳，陳瑞敏，楊 燕

(1.錦州醫(yī)科大學研究生培養(yǎng)基地 解放軍第九六〇醫(yī)院，山東 濟南250031；2.解放軍第九六〇醫(yī)院心內科，山東 濟南250031)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈急性閉塞、心肌壞死導致的一系列臨床危重情況，即使成功進行早期再灌注治療，仍存在心肌細胞丟失和心臟重構等因素致使心臟收縮功能減低，誘發(fā)嚴重心力衰竭，是影響患者預后的重要因素。他汀類藥物可改善急性心肌梗死患者的心室重構和左室收縮功能[1-2],同時大量的研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可顯著影響缺血區(qū)組織的血管新生，但其作用機制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)微小RNA(micro RNA,miRNA)與心肌梗死患者心力衰竭的發(fā)生和預后有關[3-4]，他汀類藥物是否通過調控miRNA的表達、促進梗死心肌組織內血管新生而達到其改善AMI長期預后的作用還有待于進一步研究。本實驗旨在通過研究AMI兔接受不同劑量阿托伐他汀治療后，心肌miR-126、miR-221表達以及血管新生的變化、心功能的改善以及其相關性，進一步深入探討他汀類藥物對心肌梗死后心室重構和心功能改善的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑：Light Cycle 480ⅡPCR擴增儀(Roche公司)；Phllip iE33多普勒超聲診斷儀；XDH-3型動物用心電圖描計議；動物用無菌手術器械；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司)；小鼠單克隆CD31一抗(Abcam公司)；羊抗鼠IgG二抗(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)；Trizol、逆轉錄、PCR試劑盒均購自Takara公司；miR-126、miR-221、U6引物由天根生化科技(北京)有限公司合成。

1.1.2 動物模型建立：雄性新西蘭大白兔購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心[SCK(魯)20150001]，體重3～4 kg。開胸縫扎兔左前降支動脈建立急性心肌梗死模型[5]。方法步驟：10%水合氯醛靜脈注射麻醉，仰臥位固定，記錄術前心電圖。備皮、消毒鋪巾，沿胸骨左緣約1 cm處切開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、胸大肌、胸小肌及肋間肌，鉗夾剪斷第2～4肋骨，充分暴露胸腔，切開并懸吊心包，暴露心臟。于左心耳下緣尋找心大靜脈，左前降支與之伴行，在左心耳下緣1～1.5 cm處結扎左前降支。有效阻斷血流后可見相應心肌節(jié)段由鮮紅色變?yōu)榘导t色，室壁運動減弱，同時描記心電圖，可見胸前導聯(lián)ST段弓背型抬高，AMI模型建立成功，然后逐層關閉胸腔。手術中注意避免損傷血管及胸膜而導致大出血及氣胸影響動物存活。

1.1.3 實驗動物分組：最終成功建立兔心肌梗死模型33只。術后24 h采用隨機數字表法分為三組(AMI組、低劑量阿托伐他汀組和高劑量阿托伐他汀組)，每組11只。AMI組給予等量助溶劑連續(xù)灌胃 4 周，低劑量阿托伐他汀組給予阿托伐他汀鈣片1 mg/(kg·d)，高劑量阿托伐他汀組給予阿托伐他汀2 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃 4 周，對照組接受假手術治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲心動圖檢查：第28天將兔按照3 ml/kg給予10%水合氯醛耳緣靜脈內注射麻醉，M型超聲心動圖檢測各組左室射血分數(LVEF)、每搏輸出量(SV)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.2.2 標本采集：超聲心動圖檢測后處死動物，取梗死部位心肌組織標本均分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組織化學染色；另一份心肌組織液氮快速冷凍后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測。

1.2.3 心肌組織免疫組化染色和微血管密度(MVD)測定：每例樣本取同部位切面的5張切片，脫蠟，二甲苯、梯度酒精逐步水化；在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中高壓抗原修復15 min；玻片置于3%H2O2中，濕盒孵育10 min；滴加小鼠單克隆CD31一抗(1∶100)，濕盒孵育；加羊抗鼠IgG二抗，濕盒孵育；DAB染色，觀察到切片有顏色改變時，即用自來水洗去染色液；蘇木素復染3 min，1%鹽酸酒精分化，控制染色程度；將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，放入65 ℃烘箱中15 min。每張切片在400倍光鏡下選擇梗死區(qū)5個血管密度最高的區(qū)域計數，其平均值為MVD值，相互分離的內皮細胞、內皮細胞簇、內皮細胞條索均按1個微血管計數，管腔大于8個紅細胞大小、且?guī)в休^厚肌層的血管則不予計數。

1.2.4 miRNA 表達水平的測定：采用RT-PCR法檢測miR-126 和miR-221表達水平。使用Trizol常規(guī)方法提取組織總RNA，測定OD值在1.7～2.1。采用兩步法(解鏈-退火延伸)進行實時熒光定量PCR反應，擴增條件：預變性：95 ℃ 30 s，退火和延伸：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。采用U6作為參照基因，每個實驗樣本設置3個副孔，以2-△△Ct表示樣品中目的基因初始 cDNA 相對表達量。所用引物由天根生化科技(北京)有限公司定制。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行分析。數據以均數±標準差表示,采用單因素方差分析，各組之間數據兩兩比較采用兩個獨立樣本的t檢驗;檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 建模成功后心電圖表現(xiàn) 結扎前降支后心動圖胸前導聯(lián)ST段弓背型抬高0.2 mV以上，表明兔急性心肌梗死建模成功。

2.2 左室收縮功能檢測結果 實驗動物建模28天后，行心臟M型超聲心動圖檢查，測定各組心臟左室收縮功能的指標，見表1(圖1)。結果顯示：單因素方差分析顯示總體各組兔LVEF(F=14.97,P<0.01)、LVFS(F=25.66，P<0.01)、SV(F=25.36，P<0.01)，比較差異均有統(tǒng)計學意義；與對照組比較，其余三組LVFS、SV、LVEF的數值均顯著降低，經阿托伐他汀藥物干預后，兩組各指標均較AMI組明顯升高，以高劑量阿托伐他汀組升高更為明顯，但仍低于對照組。除LVEF在高劑量和低劑量阿托伐他汀組之間比較差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，各組之間LVEF、LVFS、SV兩兩比較有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。

表1 各組兔miR-126、miR-221表達水平、LVFS、SV和LVEF比較

對照組 AMI組 低劑量阿托伐他汀組 高劑量阿托伐他汀組

2.3 梗死心肌組織中MVD檢測 結果經免疫組織化學染色后，被CD31抗體標記的新生血管內皮細胞呈棕黃色，細胞漿無棕色或與背景一致為陰性，細胞核呈藍色。對照組無心肌梗死，故沒有新生血管，僅存在一些固有血管。AMI組MVD為(3.45±1.04)，經阿托伐他汀干預后，低劑量組MVD增加至(5.73±1.49)，高劑量組作用更明顯(7.64±1.81)，見表1。單因素方差分析顯示總體各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=50.95，均P<0.01)，AMI組、低劑量和高劑量阿托伐他汀組之間比較均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

2.4 miR-126和miR-221表達變化 與對照組比較，AMI組miR-126的表達水平(0.63±0.07與1.03±0.06)明顯降低，而miR-221表達水平明顯升高(1.01±0.04 與 0.38±0.07)，表明心肌梗死后心肌組織中miR-126和miR-221的表達有顯著變化。經阿托伐他汀干預后，miR-126在低劑量組較AMI組明顯升高(1.87±0.09 與0.63±0.07)，高劑量組升高更明顯(2.44±0.29 與 0.63±0.07)，而且miR-221的變化與之相反，在低劑量組比較AMI組明顯下降(0.75±0.14與1.01±0.04)，高劑量組下降更為顯著(0.43±0.11與1.01±0.04)。單因素方差分析顯示四組之間miR-126(F=256.58,均P<0.01)和miR-221(F=81.66，P<0.01)均值總體差異有統(tǒng)計學意義，兩兩比較顯示比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見表1。

2.5 MVD和miR-126、miR-221相關性分析 在高劑量阿托伐他汀組，梗死心肌組織MVD與miR-126表達水平呈顯著正相關(r=0.703，P<0.05)，與miR-221表達水平呈顯著負相關(r=-0.755，P<0.01)。

3 討 論

AMI是冠心病的急危重癥表現(xiàn)，由冠狀動脈血流突然減少甚至閉塞導致，進展迅速，病死率高。梗死相關血管的血運重建使梗死心肌得到早期再灌注治療，可降低AMI患者病死率，改善左室收縮功能。但是，有部分患者由于微循環(huán)功能障礙而出現(xiàn)心肌灌注不足，或梗死區(qū)域的頓抑心肌持續(xù)缺血、壞死[5]，影響患者遠期預后。AMI 后微血管的形成有利于恢復缺血心肌的血供，縮小心肌梗死面積，進而改善 AMI 后心功能，對患者的預后有著重要的臨床意義，促血管新生將心肌梗死的治療帶向一個新的治療方向[6]。血管新生即從先前的血管構造上生長出新的微血管的過程，它包括3個連續(xù)的步驟：①血管舒張，血管壁通透性升高，基底膜降解；②內皮細胞激活、增生、遷移；③新管腔形成及重塑[7]。很多調節(jié)途徑參與其中，如Notch、P13K/Akt和MAPK/ERK等信號通路[8]。

miRNA是一類由18～25個核苷酸構成的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，其通過與相應靶基因miRNA的3’非翻譯區(qū)結合，影響其降解或后續(xù)的翻譯過程，達到負性調控其基因表達的作用。有多種miRNA通過調節(jié)血管新生參與冠心病的發(fā)生和發(fā)展[9]。我們之前的研究也證實一些miRNA在冠心病和心衰的發(fā)生、發(fā)展、診斷以及預后中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。調控新血管形成的特定miRNA有兩大類，一為促進新血管形成的miRNA，二為阻止新血管形成的miRNA。有些文獻總結了與血管新生相關的miRNAs，其中促血管新生的有miR-17-92、miR-let-7、miR-27b、miR-126、miR-130a、miR-210、miR-296、miR-378、miR-21、miR-31等；抑制血管新生的有miR-15/16、miR-424、miR-221/222、miR-92a、miR-320、miR-200b、miR-217、miR-503、miR-34、miR-214等[12]。miR-126是一種內皮特異性的 miRNA，在衰老內皮細胞及其分泌的微顆粒中表達下調[13]，而內皮衰老是導致內皮功能障礙的重要因素之一；Sun等[14]發(fā)現(xiàn)，來自急性冠脈綜合征(ACS)患者血液中的血小板源性外泌體(PLT-EXO)含有高表達的miR-126,通過干預 PLT-EXOP中miR-126水平，以減緩斑塊內血管新生，這或許為治療ACS提供新的策略；DA-Silva等[15]研究證實，有氧訓練能夠促進miR-126表達增加；miR-126通過間接調節(jié)VEGF途徑和直接調節(jié)其參與血管新生有關信號途徑(MAPK和P13K/Akt/eNOS等)的靶點，可能參與了運動誘導的心臟血管新生。miR-221/222也是在內皮細胞特異性高表達的miRNA，可在轉錄后水平抑制干細胞因子配體c-kit和內皮源性一氧化氮合酶(eNOS)等基因的表達，從而抑制內皮細胞增殖和遷移，抑制血管新生和血管形成[16]。Poliseno等[17]研究表明，在動脈粥樣硬化過程中，miRNA-221/miRNA-222在內皮細胞中發(fā)揮顯著的抗血管新生作用；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-221在經血管緊張素Ⅱ治療的人微血管內皮細胞中表達上調，且miR-221的特異性拮抗劑能夠強力阻斷血管緊張素Ⅱ的促血管新生作用,提示miR-221在血管新生中可能具有雙重作用。

近年來，國內外學者在他汀類藥物對血管新生的影響和miRNA的干預方面進行了大量的研究工作[19-20]。Colakoglu等[21]和Elewa等[22]研究表明，臨床常規(guī)劑量他汀對缺血誘導的血管新生表現(xiàn)為促進作用，其機制可能與P13K/Akt通路有關。Khalighfard等[23]研究報道阿托伐他汀可通過干預血管新生傳導通路，促進間充質細胞向血管內皮細胞分化；在冠狀動脈慢血流患者，阿托伐他汀可通過miR-221-VEFG軸促進外周循環(huán)內皮祖細胞遷移和增殖[24]。Minami等[25]在對冠心病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，在給予阿托伐他汀治療后，冠心病患者外周血中的miR-221和miR-222的表達水平明顯下調，證明阿托伐他汀可明顯減少外周血中miR-221/miR-222的表達水平。Pan等[26]報道阿托伐他汀可以上調ApoE基因敲除小鼠頸動脈粥樣斑塊中miR-126表達水平。本實驗通過建立急性心肌梗死兔模型，并用阿托伐他汀對心肌梗死兔進行藥物干預，觀察其對心肌梗死后左室收縮功能的影響，并選取了與內皮功能密切相關的miR-126和miR-221作為監(jiān)測指標，結果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可顯著改善左室收縮功能。進一步取梗死心肌組織在組織層面研究發(fā)現(xiàn)，經藥物治療的兔梗死心肌組織中miR-221表達顯著下調，而miR-126表達顯著上調，這表明阿托伐他汀同樣可以降低梗死心肌組織中miRNA的表達。我們進一步分析經他汀治療后兔的心肌組織miR-221、miR-126的表達水平與新生血管密度的關系時發(fā)現(xiàn)，新生血管密度與miR-221的表達水平呈顯著負相關，與miR-126表達呈顯著正相關，這提示我們阿托伐他汀可能通過影響miR-221、miR-126表達進而促進血管新生，進一步提高左室收縮功能，改善心肌梗死患者的長期預后。

綜上所述，本研究證實阿托伐他汀可改善心肌梗死后的左室收縮功能，其機制可能與通過調節(jié)梗死心肌組織miR-221和miR-126的表達而促進血管新生有關，其相關傳導通路有待進一步研究，本實驗為臨床應用阿托伐他汀治療AMI提供一定的理論依據。隨著miRNAs對血管新生調控作用的進一步闡明，以miRNAs為靶點的治療性血管新生將為冠心病以及血管性疾病的診療提供新的思路。