趙鈞慧 孔雯雯 孫美艷 趙曉勇 周垂賢

1.濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，山東濰坊 261053；2.濰坊市中醫(yī)院麻醉科，山東濰坊 261000；3.濰坊市中醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濰坊 261000

麻醉手術(shù)后患者會(huì)出現(xiàn)甚至是持久存在的記憶力、定向力等方面的障礙及社會(huì)活動(dòng)能力的減退，稱作術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD），其主要表現(xiàn)為人格或社交能力及技巧等方面的改變，而不是智商的改變。輕度POCD 患者僅在認(rèn)知功能上表現(xiàn)出與正常人的差異，且持續(xù)時(shí)間短，可自愈，僅給生活、工作帶來(lái)些許不便；重度POCD 患者則表現(xiàn)出嚴(yán)重記憶損害，包括語(yǔ)言概括或判斷能力的喪失及人格改變，可持續(xù)3個(gè)月以上甚至長(zhǎng)期存在，從而導(dǎo)致患者的社會(huì)活動(dòng)及生活自理能力減退甚至喪失，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)負(fù)擔(dān)，因此尋找有效干預(yù)術(shù)后認(rèn)知障礙的方法是目前研究的熱點(diǎn)。

POCD 的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，其中年齡較大者較其他人更易發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，年齡＞60 歲的患者經(jīng)歷非心臟大手術(shù)，術(shù)后1 周及3 個(gè)月的POCD發(fā)生率分別為26%和10%。由此可見(jiàn)，尋找干預(yù)老年患者麻醉術(shù)后早期POCD 的藥物具有重要意義。近年來(lái)，中藥注射劑在我國(guó)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，以黃酮類和酚類化合物為主要成分的丹紅注射液（danhong injection，DHI）作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，主要從丹參、紅花中提煉獲取，已有研究表明其在抑制血栓、清除血瘀、減輕氧化損傷等方面具有重要價(jià)值。本研究通過(guò)建立大鼠POCD 模型，探討DHI 對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的影響，為臨床麻醉中應(yīng)用藥物改善術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康老年雄性SD 大鼠30 只，無(wú)特定病原體（specific–pathogen free，SPF）級(jí)別，體重250～300g，均由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20 190003；動(dòng)物合格證號(hào)：3707262101083423.0。飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房。

1.2 動(dòng)物分組及POCD 模型建立

采用隨機(jī)區(qū)組法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、POCD組和實(shí)驗(yàn)組，每組各10 只。POCD 組和實(shí)驗(yàn)組建立POCD 模型。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，大鼠腹腔麻醉后，依次對(duì)腸道、脾、肝、腎等臟器進(jìn)行探查，完成腹腔探查術(shù)。實(shí)驗(yàn)組大鼠于手術(shù)結(jié)束前30min 及術(shù)后第1、2天分別予2ml/kg DHI，POCD 組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)給予與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水；對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)，但在相同時(shí)間點(diǎn)給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 大鼠的認(rèn)知功能評(píng)價(jià)

通過(guò)Morris 水迷宮的定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，以評(píng)估各組大鼠的認(rèn)知功能，在成功建模1d 后對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。水池被均勻分成4 個(gè)象限，在第4 象限內(nèi)放一平臺(tái)，平臺(tái)距離池壁20cm 且平臺(tái)頂?shù)陀谒?cm。迷宮外參照物在訓(xùn)練期間始終保持不變。

1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 連續(xù)5d 記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間作為大鼠的逃逸潛伏期，若大鼠在120s 內(nèi)仍未找到平臺(tái)，則潛伏期記為120s。

1.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 訓(xùn)練結(jié)束后次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，去除平臺(tái)后記錄大鼠120s 內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)記作大鼠的空間記憶成績(jī)。

1.4 分子生化指標(biāo)檢測(cè)

分別于術(shù)前及術(shù)后6、24、48h 取大鼠靜脈血，放入含有促凝劑的生化試管中，用離心機(jī)3000 轉(zhuǎn)/min離心20min，分離血清，–70℃保存。血清S–100β蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、腫瘤壞死因子–α（tumor necrosis factor–α，TNF–α）、白細(xì)胞介素–6（interleukin–6，IL–6）和白細(xì)胞介素–1β（interleukin–1β，IL–1β）水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme–linked immunoadsordent assay，ELISA）進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠認(rèn)知功能

POCD 組大鼠逃逸潛伏期較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，且穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與POCD 組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠逃逸潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的逃逸潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），表明DHI 能夠提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，在一定程度上改善大鼠的認(rèn)知功能障礙，但無(wú)法完全治愈大鼠的術(shù)后認(rèn)知功能障礙，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較（）

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中S–100β 蛋白、NSE水平比較

各組大鼠術(shù)前血清中S–100β 蛋白、NSE 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。與對(duì)照組比較，POCD 組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清中S–100β 蛋白、NSE 水平均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與 POCD 組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)S–100β 蛋白、NSE 水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；但與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)S–100β 蛋白、NSE 水平均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），表明DHI 能減輕大鼠麻醉術(shù)后神經(jīng)功能的損傷，但不能完全逆轉(zhuǎn)POCD 造成的損傷，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中S–100β 蛋白、NSE 水平比較（，μg/L）

2.3 各組血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平比較

與對(duì)照組比較，POCD 組大鼠術(shù)后24h 血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與POCD 組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后24h 血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；但實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥因子水平較對(duì)照組有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 術(shù)后24h 各組大鼠血清中TNF–α、IL–1β、IL–6水平比較（，pg/ml）

3 討論

老年人術(shù)后常見(jiàn)的神經(jīng)并發(fā)癥之一就是POCD，目前認(rèn)為POCD 可能是由于患者大腦在手術(shù)和麻醉的刺激下發(fā)生損傷所致。目前檢測(cè)POCD 的分子生物學(xué)指標(biāo)主要有S–100β 蛋白、NSE、ox–LDL、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、TNF–α、IL–6、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血液流變學(xué)指標(biāo)（血漿黏度、全血黏度、血漿纖維蛋白原水平）等，因此，這些標(biāo)志性分子被研究人員與POCD 聯(lián)系起來(lái)，旨在探討其中潛在的關(guān)系，其中S–100β蛋白和NSE水平可反映神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度。Hcy是一種含硫基氨基酸，ox–LDL是由血漿LDL經(jīng)化學(xué)氧化修飾等方式氧化而成，其水平的增高可引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，降低血漿中Hcy、ox–LDL 水平可改善患者的認(rèn)知功能。許多研究表明，分子生物學(xué)指標(biāo)能從不同的機(jī)制方面反映或提示腦功能狀態(tài)的變化，是研究認(rèn)知功能常用的相對(duì)較成熟的重要指標(biāo)。因此本研究選用S–100β 蛋白、NSE、TNF–α、IL–6 及IL–1β 作為檢測(cè)指標(biāo)，以探討DHI 是否可改善POCD 大鼠的神經(jīng)功能損傷情況及能否減輕POCD 帶來(lái)的炎性反應(yīng)，旨在觀察DHI 對(duì)改善大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生的影響。

3.1 POCD 相關(guān)分子生物學(xué)指標(biāo)的作用及在POCD發(fā)生后的改變

S–100β 蛋白是神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互關(guān)聯(lián)的橋梁，主要存在于中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星型細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及大膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)的特異性蛋白。作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它的適量表達(dá)對(duì)腦組織的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相近、性別相同且S–100β 蛋白表達(dá)水平正常的患者比較，輕度腦損傷患者血清中的S–100β 蛋白水平顯著升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)S–100β 蛋白水平的高表達(dá)與認(rèn)知功能紊亂呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，因此該蛋白的表達(dá)水平對(duì)改善輕微腦損傷患者的預(yù)后有重要意義。另外，由于血清中的S–100β 蛋白不受年齡、溫度、某些藥物等因素影響，故其是判斷神經(jīng)損傷的一個(gè)較靈敏的指標(biāo)。由此可見(jiàn)，在神經(jīng)科學(xué)的研究中可通過(guò)檢測(cè)S–100β 蛋白水平的高低判斷腦組織或中樞損傷程度。NSE 在神經(jīng)系統(tǒng)里含量較高，腦組織損傷患者由于血腦屏障被破壞及缺氧、細(xì)胞腫脹等因素的共同作用，增加了血腦屏障的通透性，使NSE 進(jìn)入血液循環(huán)，隨后被運(yùn)送至外周血和腦脊液中，最終導(dǎo)致外周血中NSE 水平升高。因此NSE的表達(dá)水平可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)破壞的程度，NSE水平越高則說(shuō)明神經(jīng)系統(tǒng)的損傷越嚴(yán)重，且可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能出現(xiàn)紊亂。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，POCD 組大鼠的血清中S–100β 蛋白及NSE 水平升高，大鼠的認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙，給予DHI后其水平降低，減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激是POCD 常見(jiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。TNF–α 是炎性反應(yīng)中最早升高和最重要的細(xì)胞因子之一，是反映組織損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)。IL–6 可引起急性炎性反應(yīng)，是反映腦組織早期損傷程度的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，DHI 可降低TNF–α、IL–6 及IL–1β水平，減輕炎性反應(yīng)對(duì)細(xì)胞和組織帶來(lái)的損傷，對(duì)大鼠腦組織具有保護(hù)作用。

3.2 POCD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及認(rèn)知功能的評(píng)價(jià)

研究動(dòng)物大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的常用實(shí)驗(yàn)方法是Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，其在評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)記憶功能、老年癡呆及海馬功能研究中的重要作用被廣泛認(rèn)同。其中通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)得的逃避潛伏期用于評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；通過(guò)在空間探索實(shí)驗(yàn)中得到的穿越平臺(tái)次數(shù)評(píng)價(jià)大鼠獲取空間信息的記憶保持能力。本研究通過(guò)建立大鼠POCD 模型來(lái)模擬老年患者POCD，進(jìn)而探討DHI 能否改善POCD大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果顯示，給予DHI 后大鼠的逃逸潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，由此得出，DHI 可改善POCD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和術(shù)后認(rèn)知功能。

綜上所述，老年患者麻醉POCD 的發(fā)生可影響患者的預(yù)后，嚴(yán)重者導(dǎo)致患者社會(huì)活動(dòng)、工作及生活自理能力的減退甚至喪失，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)負(fù)擔(dān)。本研究發(fā)現(xiàn)，DHI 能降低S–100β 蛋白、NSE、TNF–α、IL–6 及IL–1β 水平，具有保護(hù)腦細(xì)胞的作用，在一定程度上能夠改善POCD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和術(shù)后認(rèn)知功能，為臨床麻醉中應(yīng)用中草藥改善麻醉術(shù)后老年患者認(rèn)知功能障礙提供理論依據(jù)，對(duì)術(shù)后認(rèn)知障礙的防治及改善患者的生活質(zhì)量具有重要意義。